蒲公英多糖提取及其抗氧化活性研究

舒玉鳳 盧靜靜 陳 旭

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205）

蒲公英（Taraxacum mongolicum）味微苦、寒性，具有清熱解毒和利尿等療效[1]。蒲公英含有黃酮、植物甾醇、多糖、三萜類、膽堿等活性物質(zhì)，具有消除炎癥、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抵御病毒和防御腫瘤等藥理作用[2-4]，是一種藥食同源植物[5]，可以用于食品、方劑、保健品和護(hù)膚品中。多糖作為蒲公英的活性成分之一，具有提高免疫力、降低血脂、預(yù)防衰老和抗輻射等功能，其在醫(yī)療和保健方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[6-7]。國(guó)內(nèi)外普遍使用酶解法和熱水浸提法提取蒲公英中的多糖[8-9]。熱水浸提法受多糖種類的影響較小，且能在保證安全生產(chǎn)的同時(shí)統(tǒng)籌降低成本、提高效率，因而較酶解法提取應(yīng)用范圍更廣。

自由基又稱游離基，是一種能夠破壞細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)。其可以破壞機(jī)體內(nèi)的遺傳基因組織、酶、脂肪、碳水化合物等，從而導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。目前主要通過添加防腐劑和抗氧化劑，抑制食品中有害微生物生長(zhǎng)，減緩食品氧化變質(zhì)過程。但是，工業(yè)合成的抗氧化物存在較多的安全隱患。從食物和天然產(chǎn)物中尋找活性物質(zhì)，并將其開發(fā)成為具有抑菌、抗氧化、降血糖、降血脂及降血壓等功效的功能性食品或藥物成為研究熱點(diǎn)[10]。據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，天然活性成分可提供氫離子或螯合金屬離子，達(dá)到清除自由基的目的。因此，研究植物及中藥提取物對(duì)抑制自由基的產(chǎn)生具有重要意義。

本研究采用熱水浸提法提取蒲公英多糖，探究影響蒲公英多糖得率的因素，并對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取條件，同時(shí)研究蒲公英多糖抗氧化活性，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用蒲公英多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料：蒲公英，購自當(dāng)?shù)刂兴幍?；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、DPPH、H2O2和鄰苯三酚，均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器與設(shè)備。試驗(yàn)儀器有紫外分光光度計(jì)（UV-1800 CP，上海美譜達(dá)儀器有限公司）、高速萬能粉碎機(jī)（FW-200，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S4，金壇市富華儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱[DHG-9240（A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司]、離心機(jī)（TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理。選取無蟲蛀、無霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎機(jī)中粉碎，過60目篩，將蒲公英粉末采用索氏抽提法在50℃條件下用石油醚回流處理4 h后得到脫脂蒲公英粉末，過篩、干燥，備用。

1.2.2 蒲公英多糖提取工藝。稱取適量脫脂蒲公英粉末，加入去離子水?dāng)嚢杈鶆颍瑹崴岷笕〕?，放置于室溫下冷卻。在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，加入3倍體積的95%乙醇，密封之后在4℃條件下靜置24 h，再次在4 000 r/min條件下離心20 min，數(shù)次清洗沉淀，將沉淀用去離子水溶解并定容至100 mL，在490 nm處測(cè)吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量[12]，并按照如下公式計(jì)算蒲公英多糖得率：

式中：m1代表多糖質(zhì)量；m2代表樣品質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。以蒲公英粉末為原料，利用熱水浸提法，研究提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（60、90、120、150、180 min）和 液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]對(duì)蒲公英多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)條件下，將Box-Behnken試驗(yàn)作為依據(jù)設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，以蒲公英多糖得率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并驗(yàn)證最佳工藝條件。試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素分析水平

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定。①DPPH自由基清除能力的測(cè)定。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液和0.1 mmol/L DPPH溶液2.0 mL混合，充分搖勻[13-14]，在避光條件下反應(yīng)30 min，以無水乙醇作為空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以VC作為對(duì)照品，3次重復(fù)，取平均值。②羥基自由基清除能力的測(cè)定。分別取不同濃度樣品溶液1.0 mL，加入 1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴400 min，然后在510 nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的VC作為對(duì)照，以同體積蒸餾水作為空白組，3次重復(fù)，取平均值。③超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定。分別取不同濃度的樣液2.0 mL，然后加入2.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值=8.8）。在室溫下混勻后加入0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚溶液后開始計(jì)時(shí)5 min，每隔30 s記錄在320 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以相同濃度的VC作為對(duì)照，以同體積的蒸餾水作為空白組，3次重復(fù)，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均平行3次，取平均值。單因素及抗氧化試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design-Expert V8.0.6軟件分析，并進(jìn)行模型方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水浸提法提取蒲公英多糖研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)。從圖1（a）可以看出，當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，溫度與多糖得率成正相關(guān)。當(dāng)溫度為80℃時(shí)，多糖的得率達(dá)到峰值，繼續(xù)升高溫度多糖得率降低。原因可能是溫度升高，分子反應(yīng)速度變快，溶劑的滲透性加大，多糖分子的溶出變得更容易，但是多糖在溫度過高后容易分解，而蒲公英中黃酮等其他水溶性物質(zhì)也被提取出來，與多糖發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成多糖含量降低[15]。因此，在80℃下提取蒲公英多糖最好。從圖1（b）可以看出，當(dāng)提取時(shí)間小于2.5 h時(shí)，提取時(shí)間與多糖得率成正相關(guān)。當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)多糖得率達(dá)到峰值，后面繼續(xù)增加提取時(shí)間，多糖得率下降。原因可能是多糖內(nèi)部的糖苷鍵在持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下發(fā)生斷裂，造成得率下降。因此，2.5 h是熱水浸提法提取蒲公英多糖的最佳時(shí)間。從圖 1（c）可以看出，在液料比低于 30∶1（mL/g）時(shí)，液料比增大與蒲公英多糖的得率成正相關(guān)，即溶質(zhì)的擴(kuò)散動(dòng)力與用水量成正相關(guān)，蒲公英中水溶性多糖更易溶解出來，使多糖得率持續(xù)增大。當(dāng)液料比大于30∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率變化較小，可能是液料比為30∶1（mL/g）時(shí)多糖幾乎全部溶出，浸出率呈現(xiàn)飽和狀態(tài)。因此，熱水浸提法提取蒲公英多糖的最佳液料比為 30∶1（mL/g）。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到蒲公英多糖得率對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和液料比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。該模型的P值＜0.000 1＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.074 6，不顯著，表明數(shù)據(jù)沒有異常點(diǎn)；決定系數(shù)R2=0.998 1，說明響應(yīng)值的變化有99.57%來源于提取時(shí)間、提取溫度和液料比3個(gè)因素，該回歸方程能較好地展現(xiàn)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。比較P值與F值大小，可知提取溫度（A）的影響最大，提取時(shí)間（B）次之，液料比（C）的影響最小。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和方差分析

響應(yīng)曲面坡度體現(xiàn)了響應(yīng)值面對(duì)操作條件改變的靈敏程度，即曲面陡峭度與多糖得率對(duì)于提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)條件的改變成正相關(guān)。由圖2可知，交互作用的影響順序?yàn)锳B＞BC＞AC，即提取溫度和提取時(shí)間兩者交互作用對(duì)多糖得率的影響最顯著，提取溫度和液料比的交互作用對(duì)多糖得率的影響最小。

2.1.3 最佳工藝條件驗(yàn)證。用回歸模型預(yù)計(jì)測(cè)得的熱水浸提蒲公英多糖的最佳工藝條件為提取溫度83.42 ℃、提取時(shí)間 163.2 min、液料比 32.27∶1（mL/g），在此條件下蒲公英多糖得率為66.74 mg/g。

對(duì)提取工藝條件按照實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，將提取溫度 83.5 ℃、提取時(shí)間 163 min、液料比 32∶1（mL/g）作為熱水浸提法提取蒲公英多糖的條件。根據(jù)調(diào)整后工藝條件設(shè)置5組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，熱水浸提法提取蒲公英多糖得率為（65.87±0.31）mg/g，與理論值相差微小，證明該回歸模型獲得了較準(zhǔn)確的優(yōu)化參數(shù)。

2.2 抗氧化活性測(cè)定

對(duì)最優(yōu)工藝條件下提取的多糖進(jìn)行抗氧化能力研究。 結(jié)果表明，蒲公英多糖對(duì) DPPH·、OH·、O2-·3種自由基均有一定的清除作用，對(duì)DPPH·的清除能力較強(qiáng)[16]。

3 結(jié)論與討論

本文將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化熱水浸提法作為提取蒲公英多糖的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，熱水浸提法提取蒲公英多糖的最優(yōu)條件為提取溫度83.5 ℃、提取時(shí)間 163 min、液料比 32∶1（mL/g），此條件下多糖得率可達(dá)65.87 mg/g。這與李婧雯等[17]研究結(jié)果相近。在各影響因素中，影響最大的是提取溫度，提取溫度和提取時(shí)間兩者交互作用對(duì)蒲公英多糖得率的影響最顯著。方差分析中決定系數(shù)R2為99.81%，變異系數(shù)為0.95%，說明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠，為蒲公英多糖提取和生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，蒲公英多糖對(duì)DPPH·、OH·和O2-·3種自由基均有一定的清除作用，對(duì)DPPH·的清除率較強(qiáng)[16]，可用于天然抗氧化劑開發(fā)或功能性食品原料。綜上所述，熱水浸提法提取蒲公英多糖能提高多糖得率，為進(jìn)一步開發(fā)利用蒲公英提供了參考。