UPLC/MSMS內標法測定火鍋食品中5種生物堿和15種喹諾酮類物質

楊昌彪，李占彬，闕云飛，黃永橋，包娜，崔姍姍，趙莎，馬凱*

1(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽,550014)2(貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽,550014)

火鍋作為最受歡迎的中國傳統(tǒng)美食之一,其食品安全受到高度的關注。一些不法商販在火鍋食品中摻入罌粟殼以吸引回頭客。罌粟殼俗稱大煙殼，有止痛、止咳等作用，其主要成分包含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等多種生物堿類有毒物。消費者長期食用含有罌粟殼的食物及相關產品容易對人體神經系統(tǒng)造成損害，并可能造成慢性中毒[1]，甚至會出現(xiàn)內分泌失調等癥狀，最終上癮，具有潛在的吸食毒品的傾向，給社會造成極壞的影響[2]。此外，為防止火鍋食品的細菌滋生，影響保質期及防止中毒，個別商家還添加了衛(wèi)生部公布的食品中違法添加的物質——喹諾酮類抗生素。若長期食用殘留喹諾酮類藥物的食品，藥物會在人體內積累，會使致病菌產生耐藥性，從而危害人類健康。所以，建立一種同時測定火鍋食品的生物堿和喹諾酮類物質的檢測方法，為促進火鍋行業(yè)的發(fā)展及保障消費者的健康安全具有重要意義。

目前，檢測食品中罌粟殼的生物堿和喹諾酮類物質常用的方法有液相色譜法[3-4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[6]和液相色譜-串聯(lián)質譜法等[7-10]。而喹諾酮類藥物檢測方法多集中在動物源性食品和環(huán)境等領域[11-14]，補充檢驗方法《BJS 201909》中涉及11種喹諾酮類藥物的檢測，其他關于火鍋食品中喹諾酮類藥物分析的研究鮮見報道[15-16]。在目前分析技術手段中，液相色譜-串聯(lián)質譜法最具普遍性和實用性，其前處理簡單、選擇性好、靈敏度高。本研究將結合QuEChERS前處理技術，用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC/MSMS)同位素內標法同時測定火鍋食品中5種生物堿和15種喹諾酮類物質，為火鍋食品中生物堿和喹諾酮類物質的測定提供快捷、靈敏、準確的檢測技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

Agilent 1290/6470超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，美國安捷倫公司；L-500型高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；N-EVAP 12氮吹儀，美國Organomation公司；電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；UMV-2多管旋渦混合器，北京普立泰科儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，蘇州江東精密儀器有限公司；Milli-Q Intergra115實驗室超純水制備系統(tǒng)，美國Millipore公司；移液器，大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；5～50 mL瓶口分液器，德國普蘭德公司。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)、0.22 μm PTFE微孔濾膜、粒度40～63 μm乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine，PSA)填料和C18填料，上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸銨(優(yōu)級純)，山東西亞化學股份有限公司；MgSO4(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；CH3COONa(分析純)，天津市博迪化工有限公司。

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標準溶液(質量濃度分別為50.0、50.0、10.0、10.0和10.0 μg/mL)，喹諾酮混合標準溶液、嗎啡-d3溶液、可待因-d3溶液、諾氟沙星-d5溶液、恩諾沙星-d5溶液、環(huán)丙沙星-d8溶液(質量濃度均為100.0 μg/mL)，天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

混合標準儲備液的配制:分別準確稱取0.50 mL的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標準溶液和0.05 mL喹諾酮混合標準溶液于5 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質量濃度為1 000 ng/mL(嗎啡、可待因質量濃度為5 000 ng/mL)的混合標準儲備液。

同位素內標工作溶液的配制:分別準確取0.10 mL的嗎啡-d3溶液、可待因-d3溶液、諾氟沙星-d5溶液、恩諾沙星-d5溶液和環(huán)丙沙星-d8溶液至10 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質量濃度為1 000 ng/mL內標儲備液。

混合標準工作曲線溶液的制備：分別取混合標準儲備液0.010、0.050、0.10、0.25和0.50 mL于5個10 mL容量瓶中，并向不同濃度的容量瓶中準確加入0.10 mL的內標儲備液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質量濃度為1、5、10、25和50 ng/mL的混合標準工作液，其中嗎啡和可待因的質量濃度為5、25、50、125和250 ng/mL?；旌蠘藴使ぷ饕簝葮速|量濃度為10 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理方法

1.3.2.1 試樣制備和保存

取待測半固體樣品(>200 g)放入均質機中，勻漿混勻；取待測液體樣品(>200 g)置玻璃燒杯中，攪勻。將制備完的樣品，裝于潔凈的聚四氟乙烯瓶中，密封并標記，于-18 ℃保存，備用。

1.3.2.2 提取

稱取2 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入同位素內標溶液，加入1粒陶瓷均質子，再加入5 mL水，漩渦混合30 s，使樣品分散均勻，加入乙腈-1%(體積分數)甲酸10 mL，置于多管漩渦混合器中，振蕩提取5 min，然后加入1.5 g CH3COONa，6 g MgSO4，迅速振搖，以4 200 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.2.3 凈化

吸取6 mL上清液加到預先放置1 200 mg無水MgSO4、400 mg PSA及400 mg C18填料的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，準確吸取2 mL上清液于15 mL離心管中，45 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mLV(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，渦旋復溶，過PTFE微孔濾膜，使用UPLC/MSMS進行分析。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；流動相：A為體積分數0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(10% B)，2～6 min(10%～30% B)，6～9 min(30%～50% B)，9～11.5 min(50%～95% B)，11.5～14.5 min(95% B)，15.0～16.0 min(95%～10% B)，16.0～20.0 min(10% B)。

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，多反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)，正離子掃描，毛細管電壓5 500 V，噴嘴電壓500 V，霧化氣壓力45 psi，干燥氣流速8 L/min，干燥氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L/min，鞘氣溫度300 ℃，各目標物定性、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數列于表1。

表1 目標物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the analytes

續(xù)表1

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

本研究采用超高效液相色譜，為保證分離效果和峰形，選擇1.8 μm粒徑，規(guī)格為2.1 mm×150 mm的超高效液相色譜柱，經試驗，在20 min內完成了20種化合物的分離，與傳統(tǒng)色譜柱相比，分離效果較好，峰形更加優(yōu)異。由于被分析物均在正離子模式下掃描，為了提高離子化效率，本實驗考察了乙腈-0.1%(體積分數)乙酸水、乙腈-0.1%(體積分數)甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨溶液)等不同的流動相體系，經過比較，發(fā)現(xiàn)甲酸更有利于各化合物的離子化，質譜響應較好，同時，流動相中添加銨鹽，改善了被分析物的峰形和分離效果，最終選擇了乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨溶液)作為流動相體系進行色譜分析。

實驗對定容溶液進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用不同比例有機溶劑的溶液作為樣品前處理后的定容液或標準稀釋液，會對目標物峰形產生顯著的影響，有機溶劑比例過高會造成部分目標物的色譜峰形坍塌，特別是嗎啡和可待因的色譜峰嚴重拖尾。經過多次實驗，確定以V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液作為定容溶液，再通過色譜分離，可獲得良好的峰形，如圖1所示。

1～20分別代表嗎啡、可待因、伊諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氟羅沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、司帕沙星、蒂巴因、沙拉沙星、雙氟沙星、罌粟堿、那可丁、噁喹酸、氟甲喹圖1 各目標物特征離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of the compounds

2.2 質譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣的方式，將配制好的各組分混合標準工作液，注入質譜儀進行全掃描，得到的母離子均為[M+H]+，在正離子模式(ESI+)下，優(yōu)化錐孔電壓，對母離子進行子離子掃描和MRM掃描，獲得每個母離子的特異碎片離子，優(yōu)化碰撞能量，選擇2個豐度較高的離子作為定量和定性離子，各目標物質譜參數見表1。以優(yōu)化好的質譜參數聯(lián)機液相色譜儀，優(yōu)化毛細管電壓、霧化氣壓力、干燥氣流量和溫度、鞘氣溫度和流量等離子源參數，最后選擇的參數見1.4.2中的質譜條件。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

2.3.1 樣品的提取

喹諾酮類化合物結構上既有羥基，又有叔氨基，是兩性化合物，易溶于酸性或堿性溶液，罌粟殼5種生物堿屬弱堿性化合物。火鍋食品基質較為復雜，在添加溶劑提取前，需要加水對樣品進行分散，增加提取溶劑與樣品的接觸面積。在已有研究的基礎上，本文采用QuEChERS法常用的乙腈作為提取溶劑，分別考察了在相同加標量10 μg/kg(嗎啡、可待因50 μg/kg)的情況下純乙腈、乙腈-1%(體積分數)甲酸、乙腈-1%(體積分數)乙酸對各目標物的提取效率，結果以回收率表示。3種不同溶劑中，乙腈-1%(體積分數)甲酸提取效果優(yōu)于其他2類溶劑，回收率最低的嗎啡為38%，最高的達氟沙星為142%(圖2)。從溶劑整體效果考慮，選擇1%甲酸乙腈作為實驗溶劑提取劑。

圖2 不同提取溶劑的回收率Fig.2 Recoveries of analytes with different extraction solvents

2.3.2 基質效應的考察

通過優(yōu)化的前處理過程和儀器條件，分別測定空白提取液與純溶劑中各目標物的離子響應值，考察各目標物的基質效應(matrix effect，ME)，基質效應的計算參考文獻[17]進行，如公式(1)所示：

(1)

式中：A，空白樣品基質中目標物的離子響應值；B，純溶劑中各目標物相同濃度的離子響應值。

當ME<0.5或者>1.5時，表示存在較強的基質抑制或者增強效應；當0.8

圖3 優(yōu)化的凈化條件下各目標物的基質效應Fig.3 Matrix effects of the compounds under optimum purification conditions

2.4 線性范圍與檢出限

移取適量的混合標準儲備溶液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液稀釋，配制標準系列溶液，按照已優(yōu)化的色譜條件和質譜參數進行檢測，罌粟堿、那可丁、蒂巴因以定量離子的峰面積(y)為縱坐標、質量濃度(x)為橫坐標繪制工作曲線，其他目標物以定量離子與相應同位素內標峰面比值(y)為縱坐標、質量濃度與內標濃度比值(x)為橫坐標繪制標準工作曲線，各組分的線性范圍在1.0～250 ng/mL，線性關系良好，線性相關系數≥0.997 5，結果見表2。采用空白樣品添加目標物，按照1.3.2樣品前處理步驟進行處理，并上機測定，以定量離子峰的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)確定方法的檢出限(limit of detection，LOD)，各目標物的檢出限見表2。

表2 目標物的線性范圍、線性回歸方程、相關系數及檢出限Table 2 Linear ranges, linear regression equations, correlation coefficients and LODs of the compounds

續(xù)表2

2.5 方法回收率與精密度

為驗證此方法的可靠性，選取空白樣品，分別加入低、中、高3個不同濃度水平的混合標準溶液，按照1.3.2前處理方法處理樣品，每個水平重復測定6次，采用內標法和外標法定量，計算平均回收率和精密度，如表3所示。結果表明，本研究建立的方法在不同加標水平下，平均回收率為74.6%～114.8%，精密度(relative standard deviation，RSD)<15.1%，具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足火鍋食品中添加的喹諾酮類藥物和罌粟殼中生物堿檢測的要求。

表3 三個加標水平下目標物的回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and repeatabilities of the compounds spiked at three levels (n=6)

2.6 實際樣品測定結果

通過對超市及自制餐館采集3個類別25批次樣品，其中羊肉湯10批次，牛肉湯10批次及其他預包裝火鍋食品5批次，進行生物堿及喹諾酮類化合物檢測，結果見表4。檢測的25批次火鍋食品中7批次檢出罌粟堿類殘留物，其中2批次羊肉湯檢出嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因5個物質，含量為20.3～627 μg/kg；另外5批次檢出不同類別的罌粟堿類藥，含量為9.07～626 μg/kg，其余的火鍋食品均未檢出罌粟堿類和喹諾酮類藥物，本研究檢測出的生物堿類藥物和喹諾酮類藥物結果與馮月超等[15]、李航等[18]研究結果相當。同時實驗按要求進行了平行樣及加標回收質量控制，5種生物堿和15種喹諾酮類物質的質控回收結果為69.2%～107%，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求，表明結果準確、可靠?；疱伿称分袡z出生物堿類藥物的原因主要是添加了罌粟殼或使用含有罌粟堿類藥物的香料導致；而未檢出喹諾酮類藥物主要是因為實驗代表樣主要為鮮的湯料，不需要添加殺菌劑；其次預包裝的火鍋食品為正規(guī)的生產商，質量控制較好，所以生物堿類藥物及喹諾酮類均未檢出。

表4 不同類別火鍋食品中目標化合物檢測結果Table 4 Results of the compounds in different kinds of hotpot food

3 結論

本文結合QuEChERS前處理技術，對提取及凈化方法、色譜及質譜條件進行了優(yōu)化，建立了同時測定火鍋食品中5種生物堿及15種喹諾酮類物質的檢測方法。該方法操作簡便，靈敏度高，適合火鍋食品的非法添加物生物堿及喹諾酮類物質的快速篩查，為市場食品安全監(jiān)管提供技術支撐。