苗永美， 簡 興， 張開京

(1. 安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100; 2. 安徽科技學院 建筑學院，安徽 鳳陽 233100； 3. 安徽科技學院 農(nóng)學院，安徽 鳳陽 233100)

誘導黃瓜器官離體再分化尤其對于實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因研究具有重要的理論和實踐意義[1],黃瓜產(chǎn)生愈傷組織的能力和生根能力都很強,尤其生根環(huán)節(jié)不需要激素刺激。但是愈傷組織再分化、外植體器官直接分化、胚狀體誘導等再生途徑難度非常大,且存在明顯基因型和外植體差異,子葉為常選用的外植體[2-3]。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化仍然是目前黃瓜轉(zhuǎn)化的主要方法[4]。本研究選用華北型、華南型、歐洲溫室型和美國加工型4種類型共10個黃瓜品種,研究基因型、外植體和生長調(diào)節(jié)劑對黃瓜器官分化影響;進行篩選標記敏感性試驗,同時考察了農(nóng)桿菌濃度、預培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間及乙酰丁香酮(AS)對轉(zhuǎn)化率影響,以期建立一個高效穩(wěn)定黃瓜再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系,為實現(xiàn)黃瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

10個黃瓜品種,具體見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因型再生能力比較 種子用0.1%HgCl2消毒8 min,無菌水漂洗4次,無菌水浸泡4 h,吸干表面水分,平放在MS培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)至露白后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)。6 d時兩片子葉脫離種皮但未完全張開,切取1.5 cm下胚軸、子葉橫切成兩份,近軸端沿胚軸縱切,輕輕刮去生長點(帶柄子葉)、遠軸端切去葉尖(不帶柄子葉)、1.5 cm左右胚根,共4種外植體。MS培養(yǎng)基,0.05 mg/L TDZ、1.0 mg/L 6-BA分別與(0、0.1、0.5 mg/L)、IAA 0.1 mg/L NAA隨機成8種激素配方,記M1～M8,根據(jù)文獻及預試驗設計培養(yǎng)基M9:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L ABA+2 mg/L AgNO3。每處理7～13個外植體,重復3次,30 d統(tǒng)計結(jié)果。光周期16 L/8 D,光照強度2 500 lx,溫度25 ℃。

1.2.2 細胞分裂素種類篩選 ‘EC5’和‘Chipper’子葉節(jié)接種在含TDZ、6-BA和KT的MS上,25 d統(tǒng)計芽分化率。

1.2.3 子葉節(jié)不定芽誘導 ‘EC5’和‘Chipper’子葉節(jié),三因素四水平正交設計(見表2),每處理接種50～60個外植體,‘EC5’試驗重復4次,‘Chipper’ 試驗重復2次,25 d統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將獲得的‘EC5’芽苗接種于1/2MS附加IAA和NAA的培養(yǎng)基上,1周后統(tǒng)計生根率、根數(shù)及表現(xiàn)。

1.2.5 潮霉素敏感性試驗 ‘EC5’和‘Chipper’子葉節(jié),培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3,添加0、5、8、10、15、20、25 mg/L Hyg,每個處理接種30個外植體,25 d統(tǒng)計誘導率,并觀察外植體生長情況。選高度大于2 cm無根苗,接種至含0、5、8、10、15、20、25 mg/L Hyg的1/2MS上,每處理接種15株,統(tǒng)計生根情況及生長表現(xiàn)。

1.2.6 脫菌劑抑菌效果比較 挑選含有pCABIA1304的EHA105農(nóng)桿菌單菌落,YEB+50 mg/L Rif+50 mg/L Kan培養(yǎng)基中,28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng),測OD600值,5 000 r/min、4 ℃下離心5 min 收集菌體,MS0重懸、調(diào)整OD=0.6。

‘Chipper’子葉節(jié)暗預培養(yǎng)2 d,置于侵染液中(OD=0.6)侵染8 min,吸干表面菌液,黑暗下共培養(yǎng)2 d,轉(zhuǎn)至添加羧芐青霉素(Carb)和頭孢噻圬(Cef)的培養(yǎng)基上,濃度為0、100、300、500、700 mg/L,15 d統(tǒng)計抑菌效果和芽分化。

1.2.7 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 預培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3;選擇培養(yǎng)基:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3+10 mg/L Hyg+200 mg/L Carb。

‘Chipper’子葉節(jié),預培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間采用四因素四水平正交設計,每處理接40～45個,25 d統(tǒng)計抗性芽誘導率;子葉塊和下胚軸用于瞬時表達鑒定,選擇培養(yǎng)7 d后Gus染色,參照Jefferson方法[5]。

1.2.8 AS濃度對侵染效果影響 共培養(yǎng)基中添加0、50、75、100、200 μmol/L AS,預培養(yǎng)1 d,侵染液OD=0.6,侵染12 min,共培養(yǎng)3 d,統(tǒng)計抗性芽及瞬時表達。

1.2.9 結(jié)果統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析 芽分化率(%)=分化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%;平均分化芽數(shù)=分化芽總數(shù)/接種總數(shù);染色率(%)=呈藍色外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。采用SPSS 18.0軟件方差分析,Duncan新復極差法顯著差異性檢驗。不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)先反正弦平方根轉(zhuǎn)換后再方差分析。Gus染色率采用極差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 外植體對黃瓜再生影響

10個基因型黃瓜子葉節(jié)、子葉遠軸端、下胚軸和根段在M1～M9培養(yǎng)基上均膨大,顏色變深,但只有子葉節(jié)能誘導出不定芽并伴有愈傷組織發(fā)生,其它3種僅個別兩端或邊緣膨大或有愈傷發(fā)生,無不定芽產(chǎn)生。

2.2 基因型對子葉節(jié)不定芽誘導影響

10個基因型黃瓜子葉節(jié)在M9培養(yǎng)基上表現(xiàn)(表1)看出:基因型間差異不大,只有華北型2個品種分化率較低,其它8個基因型的誘導率及分化芽數(shù)差異不顯著。因此,后期試驗選用‘EC5’和‘Chipper’。

表1 不同基因型黃瓜子葉節(jié)不定芽誘導情況

2.3 細胞分裂素對兩種黃瓜子葉節(jié)不定芽誘導影響

圖1顯示,0.05 mg/L TDZ時,誘導率較低、芽小、愈傷化重,提高至0.1或0.2 mg/L時,‘EC5’外植體黃化死亡,‘Chipper’分化率降低。6-BA誘導能力比KT強,KT培養(yǎng)基上芽少,但個體大。總體來看,6-BA更適合不定芽誘導。

圖1 分裂素對芽分化率影響

2.4 不同培養(yǎng)基對‘EC5’子葉節(jié)不定芽誘導影響

表2 激素組合對‘EC5’子葉節(jié)不定芽分化影響

表3 多重比較

圖2 子葉不定芽誘導情況

表2結(jié)果做多重比較(表3),0.5～2.0 mg/L 6-BA對分化率影響差異不明顯,但芽數(shù)受濃度影響大,1.0 mg/L時最多,與1.5 mg/L時差異不顯著。0.3～0.9 mg/L ABA會降低芽分化率和芽數(shù),抑制愈傷產(chǎn)生,不加ABA時柄端產(chǎn)生較多愈傷,芽小。2.0 mg/L AgNO3能提高芽分化率,比對照提高了20.13%。綜上,‘EC5’不定芽分化激素組合為1.0～1.5 mg/L 6-BA+0～0.3 mg/L ABA+2.0 mg/L AgNO3。

2.5 不同培養(yǎng)基對‘Chippper’子葉節(jié)不定芽誘導影響

極差分析看出，對不定芽分化影響最大的是6-BA,其次是ABA,最小的是AgNO3;‘Chipper’子葉節(jié)芽分化的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3。

表4 激素組合對‘Chipper’子葉節(jié)不定芽分化影響

2.6 生根培養(yǎng)

1周后生根情況見表5,生長素會導致愈傷化,有些整株愈傷化,長勢弱;1/2MS培養(yǎng)基上生根率達100%、平均根數(shù)為5.70。時間宜短,否則根太長、過細,影響移栽成活。

表5 不同生長素對‘EC5’生根影響

2.7 潮霉素篩選濃度確定

從表6看出,5 mg/L Hyg會抑制‘EC5’子葉節(jié)芽分化,使顏色變淺,抑制作用隨濃度升高更明顯,15 mg/L時葉塊完全變黃,無分化;‘Chipper’對Hyg耐受力稍強,5 mg/L Hyg對芽分化率影響不顯著,但抑制芽生長,濃度增至8 mg/L時明顯抑制芽分化,分化率只有43.3%。黃瓜屬易生根作物,Hyg會抑制生根,5mg/L培養(yǎng)基上,‘EC5’生根率只有25%,‘Chipper’生根率為33.33%,顯著低于對照,8 mg/L的Hyg完全抑制2種黃瓜生根。5～8 mg/L Hyg是‘EC5’芽苗分化和生根的篩選臨界濃度,8～10 mg/L Hyg為‘Chipper’的篩選壓力。

表6 潮霉素濃度對子葉節(jié)不定芽分化及生根的影響

2.8 脫菌劑濃度確定

由表7看出，不加抑菌劑時整個培養(yǎng)容器內(nèi)長滿農(nóng)桿菌且影響到芽分化,2種脫菌劑濃度大于200 mg/L時都能完全抑制住農(nóng)桿菌,Carb比Cef抑制作用小。所以,后期試驗選用200 mg/L Carb。

表7 脫菌劑抑菌效果及對不定芽分化影響

2.9 侵染條件對轉(zhuǎn)化效率影響

預培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間對芽分化率和染色的影響見表8～10。預培養(yǎng)對分化率影響不顯著;隨侵染液濃度升高,分化率先升高后降低,OD在0.6～0.8時,芽分化顯著高于其它2個濃度;侵染8～16 min比4 min能明顯提高分化率;共培養(yǎng)3 d時侵染率最高。根據(jù)R值大小,預培養(yǎng)天數(shù)對瞬時表達率影響最大,其它3個因素從大到小依次是侵染時間、共培養(yǎng)時間和農(nóng)桿菌濃度。綜合2個考察指標,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件為:預培養(yǎng)1 d,OD=0.6～0.8,侵染時間12～16 min,共培養(yǎng)3 d。

表8 轉(zhuǎn)化條件對芽分化及瞬時表達的影響

表9 抗性芽分化的方差分析

表10 瞬時表達的極差分析

2.10 AS濃度對轉(zhuǎn)化效率影響

一定濃度乙酰丁香酮(AS)能提高‘Chipper’子葉節(jié)轉(zhuǎn)化率(表11),隨AS濃度升高,芽分化率和瞬時表達率都表現(xiàn)出先升高后降低趨勢,50～75 μmol/L AS轉(zhuǎn)化效率最好。

表11 AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

圖3 抗性芽的Gus染色

3 結(jié)論與討論

影響植物離體器官分化的主要因素有基因型、外植體和生長調(diào)節(jié)劑,對黃瓜離體培養(yǎng)的影響已有研究報道。杜勝利等[6]比較了12份黃瓜子葉再生,均能出芽但存有差異,劃分3個等次。李建欣等[7]研究了20個黃瓜自交系子葉不定芽誘導情況,誘導率變異范圍15%～94%。張若偉等[2]比較了華北、華南、歐洲、日本及美國加工型共8個純系黃瓜,華南型再生率最高,四川白瓜達100%,其它類型均較低。本研究選用4個生態(tài)型10個高代自交系黃瓜,只有華北型兩個品種子葉節(jié)不定芽誘導能力相對降低,30%左右,其它8個分化能力差異不顯著,誘導率都在80%以上。選擇合適基因型是建立黃瓜高效再生體系的重要保障。

黃瓜可選用外植體種類很多,有子葉、下胚軸、真葉、子房及胚等,不同外植體分化能力和途徑存有差異,其研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似,表明帶柄子葉產(chǎn)生不定芽能力最強,其它幾種外植體芽誘導能力很弱,大多數(shù)不能分化出芽,只有愈傷發(fā)生。也有從下胚軸上誘導出不定芽的個別報道[8],可能主要是基因型差異,再生能力強的基因型會擴大再生外植體范圍?？傮w看,外植體種類比基因型對黃瓜再生影響大。

誘導黃瓜直接分化芽或產(chǎn)生愈傷組織,細胞分裂素必不可少,常用6-BA,也有人使用TDZ和KT。6-BA常用濃度為0.5～2.0 mg/L,6-BA濃度過高,會加重愈傷化,芽小,叢生;TDZ因活性強使用濃度要低[3,9],0.05 mg/L時誘導出芽,但愈傷化重,超過0.1 mg/L時子葉黃化死亡。KT誘導能力不及6-BA,芽大,長勢壯特點較為突出[10]。

本研究表明雖然少量生長素或高濃度細胞分裂素使外植體愈傷化,但黃瓜愈傷組織難以再分化。梅茜等[11]研究表明ABA 明顯提高芽再生能力,1.0 mg/L最適宜,不添加ABA不定芽很難產(chǎn)生。Altman等[12]認為ABA對愈傷組織形成有重要促進作用。張守杰等[13]通過酶聯(lián)免疫法分析了新泰密刺黃瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)中ABA變化,愈傷誘導期為峰值,分化階段出現(xiàn)低谷,認為ABA對愈傷組織誘導具促進作用,其水平下降利于不定芽分化。也有相反報道,ABA和BA 組合能明顯抑制愈傷組織而直接生出叢生芽[14];Sikioka 等[15]研究表明低濃度ABA(0.1 mg/L)促進黃瓜胚狀體正常發(fā)育,高濃度(1.0 mg/L)顯著減少愈傷化,控制胚狀體處于球形胚或球形胚后期。本研究0～0.3 mg/L ABA對出芽數(shù)沒有顯著影響,但能減少出愈量,促進芽生長,0.6 mg/L ABA顯著降低分化。由此看出,ABA對黃瓜再生調(diào)控作用不完全相同,可能與基因型有關。

AgNO3作為乙烯抑制劑能競爭性結(jié)合乙烯作用部位常用于植物組織培養(yǎng),能提高不定芽發(fā)生[16]。培養(yǎng)基中添加2～8 mg/L AgNO3可顯著提高再生頻率,2 mg/L效果最佳[17],也有最佳濃度是1 mg/L和0.5 mg/L[18]的報道。本研究表明,2 mg/L AgNO3促進 ‘EC5’不定芽發(fā)生。

Hyg是表達載體pCABIA1304抗性標記基因,Hyg作為選擇壓力篩選轉(zhuǎn)化細胞。對Hyg敏感程度因植物和生長階段存有敏感差異,王丹等[19]研究表明山新楊和歐美楊葉片分化芽時敏感濃度為2.0 mg/L,小黑楊為3.0 mg/L;山新楊和小黑楊不定芽生長敏感濃度為2.0 mg/L,歐美楊為1.0 mg/L;山新楊和小黑楊莖段生長和生根敏感濃度為6.0 mg/L,歐美楊為2.0 mg/L。本試驗表明 ‘Chipper’比‘EC5’對Hyg臨界濃度稍高,生根階段對Hyg敏感性不存有差異;兩種黃瓜生根階段敏感性都稍高于芽分化階段?？剐匝吭诤琀yg培養(yǎng)基上生長較慢,選擇培養(yǎng)4周后采用逐步降低Hyg濃度方法,減少Hyg對芽和根生長抑制。預培養(yǎng)目的是刺激細胞分裂分化,易于感受和接納外源基因,通過正交設計和R分析表明預培養(yǎng)時間對瞬時表達率影響最大,其它因素依次為侵染時間、共培養(yǎng)時間和菌液濃度。蔡誠等[20]也證明預培養(yǎng)對楊樹瞬時表達影響最大,不經(jīng)預培養(yǎng)或時間過短,子葉傷口易褐化、死亡,時間過長,傷口處于愈合和封閉狀態(tài)不利于侵染。預培養(yǎng)天數(shù)(0～4 d)對‘Chipper’抗性芽產(chǎn)生影響不大,但對瞬時表達率影響較大,1 d最好。AS目的是促進農(nóng)桿菌侵染及激活Vir表達使T-DNA轉(zhuǎn)移插入到受體基因組,加入方式主要有侵染液中加入和共培養(yǎng)中加入2種,共培養(yǎng)添加是常采用的方式。預培養(yǎng)和共培養(yǎng)中添加100 μmol/L AS 利于‘津優(yōu)1號’黃瓜子葉節(jié)分化[21],菌液和培養(yǎng)基中加入50 mg/L AS提高了‘新泰密刺’58.4%抗性芽再生率;本研究共培養(yǎng)階段添加50～75 μmol/L AS效果最好。