4-乙烯基苯硼酸聚合物納米材料的制備及其在果糖檢測中的應(yīng)用

李 濤張 睿聶玘豪吳浩君王欣惠吳海彤孫曉麗

(福建師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350007)

0 引言

果糖是食品工業(yè)中一種重要的糖，常用作食品甜味劑。但是果糖攝入過多會導(dǎo)致肥胖、非酒精性脂肪肝和代謝不良等疾病，所以對果糖的檢測十分必要[1-4]。目前，針對果糖檢測的方法主要有離子色譜法[5]，氣相色譜法[6]、紫外檢測法[7]、高效液相色譜檢測法[8]和熒光檢測法[9]，其中熒光檢測法具有操作簡便，易于觀察等優(yōu)點(diǎn)。硼酸基團(tuán)可以和果糖等1，2-二醇類化合物可逆地結(jié)合，形成五元環(huán)[10-13]。這些環(huán)酯的形成往往伴隨著一定的熒光變化[14，15]。所以利用硼酸基團(tuán)合成傳感器來檢測果糖一直是許多研究小組的重點(diǎn)[16-18]。Pooryousef課題組合成了9，9-二甲基-9H-芴-2，7-二基-2，7-二硼酸小分子，利用其硼酸基團(tuán)結(jié)合果糖導(dǎo)致熒光淬滅來檢測果糖，在果糖濃度為5×10－5至10－1mol/L的濃度范圍內(nèi)，對果糖顯示出線性響應(yīng)，檢測限為2×10－5mol/L[19]。相比于硼酸小分子，高分子納米材料具有生物相容性好，結(jié)構(gòu)形貌易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，在傳感器應(yīng)用中將含硼聚合物自組裝成納米材料成為新的趨勢[20]。Vlies課題組采用水分散聚合法合成了粒徑為80～250 nm 的具有框狀形貌的苯基硼酸納米粒子，納米粒子通過茜素紅S置換法利用熒光淬滅現(xiàn)象來檢測果糖，檢測限達(dá)到1.5 mmol/L[21]。

核殼結(jié)構(gòu)為精確控制顆粒中功能基團(tuán)的空間分布提供了可能，因此本文通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)方法合成了聚(4-乙烯基苯硼酸)-b-聚(N，N 二甲基丙烯酰胺)嵌段共聚物(PVPBA-b-PDMA)，同時(shí)利用溶液自組裝方法制備了2種尺寸的核殼結(jié)構(gòu)球狀納米材料，PDMA 作為殼提供納米材料良好的生物相容性和穩(wěn)定性，苯硼酸功能基團(tuán)分布于納米材料核中。納米材料核中的硼酸基團(tuán)與染料茜素紅S(ARS)、槲皮素(QC)、8-羥基喹啉(HQ)結(jié)合后，其體系產(chǎn)生熒光，構(gòu)建了新型熒光傳感器，利用這類熒光傳感器，可以實(shí)現(xiàn)對果糖的特異性檢測，具體表現(xiàn)為體系發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象。通過將納米材料與二元醇染料結(jié)合制備的熒光傳感器在果糖檢測中顯示出高靈敏度和特異性的優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 儀器與試劑

偶氮二異丁腈(AIBN，阿拉丁試劑，98%)在甲醇中重結(jié)晶兩次。S-1-十二烷基-S-(α，α'-二甲基-α''-乙酸)三硫代碳酸酯(TTC)作為鏈轉(zhuǎn)移劑根據(jù)文獻(xiàn)方法合成[22]。四氫呋喃(THF)在使用前用Na/二苯甲酮蒸餾干燥。N，N 二甲基丙烯酰胺(DMA)、4-溴苯乙烯、鎂、茜素紅S(ARS)、槲皮素(QC)、8-羥基喹啉(HQ)、果糖、葡萄糖、硼酸三甲酯、鹽酸等不需經(jīng)過處理可直接使用。

1.2 4-乙烯基苯硼酸(VPBA)的合成

取2.5 g(102.8 mmol)新鮮鎂屑加入到含有磁子的250 m L 反應(yīng)管中，直口用橡膠塞密封，支口與真空泵相連，將體系中的空氣抽出，并用熱風(fēng)槍200 ℃吹燙3 min，待溫度降至室溫后通入氮?dú)?，此過程重復(fù)三次。向反應(yīng)管中加入30 m L四氫呋喃溶液，取15.69 g(85.7 mmol)4-溴苯乙烯溶于20 m L 四氫呋喃溶液中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下向反應(yīng)管中緩慢加入配置好的4-溴苯乙烯四氫呋喃溶液，攪拌反應(yīng)3 h，制備得到4-乙烯基溴化鎂格氏試劑。

取250 m L反應(yīng)管加入磁子，直口用橡膠塞密封，支口與真空泵相連，將體系中的空氣抽出，并用熱風(fēng)槍200 ℃吹燙3 min，待溫度降至室溫后通入氮?dú)?，此過程重復(fù)三次。取8.908 g(85.7 mmol)硼酸三甲酯溶于40 m L四氫呋喃溶液中，加入到反應(yīng)管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰水浴的條件下，將制備的格氏試劑緩慢加入到反應(yīng)管中，滴加過程持續(xù)30 min，攪拌反應(yīng)過夜得到乳白色溶液。后加入60 m L 2 mol/L的鹽酸，攪拌2 h，用乙酸乙酯、蒸餾水萃取三次得到黃色溶液，加入無水硫酸鎂干燥至澄清透明，抽濾濃縮有機(jī)相，采用石油醚:乙酸乙酯＝10∶1的洗脫液進(jìn)行柱層析，得到5.55 g 4-乙烯基苯硼酸單體，產(chǎn)率43.7%。核磁氫譜(400核 磁 碳 譜(400 MHz，DMSO-d6，δ):δ ＝139.00核磁硼譜(600 MHz，DMSO-d6，δ):δ＝27.58(1B，-(OH)2)。反應(yīng)過程如圖1所示。

圖1 4-乙烯基苯硼酸(VPBA)合成路線流程圖

1.3 聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)的制備

按照摩爾比100∶1∶0.5稱取9.9 g(100 mmol)DMA 單體，364 mg(1 mmol)鏈轉(zhuǎn)移劑十二烷基三硫代碳酸酯，16.4 mg(0.1 mmol)引發(fā)劑AIBN 溶于10 m L四氫呋喃溶液，加入到帶磁子的聚合管中。重復(fù)冷凍-抽真空-解凍操作3次至完全除去體系中的氧氣后，80 ℃下磁力攪拌反應(yīng)24 h，迅速降溫終止反應(yīng)，將反應(yīng)液滴加入過量石油醚中，聚合物沉淀析出，重復(fù)2次。過濾后將固體室溫下真空干燥，得到淺黃白色固體8.715 g，產(chǎn)率為82.5%。核磁氫譜

1.4 PVPBA-b-PDMA嵌段共聚物的制備

按照摩爾比500∶1∶0.5稱取0.5 g(3.37 mmol)VPBA 單體，60.2 mg(0.006 7 mmol)鏈轉(zhuǎn)移劑PDMA，0.54 mg(0.003 3 mmol)引發(fā)劑AIBN 溶于2 m L 四氫呋喃溶液，加入到帶磁子的聚合管中。重復(fù)冷凍-抽真空-解凍操作至完全除去體系中的氧氣后，80 ℃下磁力攪拌反應(yīng)24 h，迅速降溫終止反應(yīng)，將反應(yīng)液滴加入過量石油醚中，聚合物沉淀析出，重復(fù)2 次。室溫下真空干燥，得到淺黃白色固體0.24 g，產(chǎn)率為48%。核磁 氫 譜紅外光譜(KBr壓片，cm－1):3 406(brs)，2 924(m)，2 852(w)，1 609(m)，1 561(w)，1 511(w)，1 411(s)，1 342(s)，1 116(m)，1 015(m)，831(m)，749(m)，651(m)，634(w)。

按照摩爾比1000∶1∶0.5稱取0.5 g(3.37 mmol)VPBA 單體，30.1 mg(0.003 3 mmol)鏈轉(zhuǎn)移劑PDMA，0.27 mg(0.001 7 mmol)引發(fā)劑AIBN 溶于2 m L 四氫呋喃溶液，按照相同操作，得到淺黃白色固體0.31 g，產(chǎn)率為73%。核磁氫譜紅外光譜(KBr壓片，cm－1):3 405(brs)，2 924(m)，2 851(w)，1 608(m)，1 561(w)，1 511(w)，1 411(s)，1 342(s)，1 115(m)，1 015(m)，831(m)，749(m)，651(m)，634(w)。反應(yīng)過程如圖2所示。

圖2 PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物合成路線流程圖

1.5 PVPBA-b-PDMA納米材料的制備

利用溶液自組裝的方法，將10 mg PVPBA-b-PDMA 嵌段共聚物溶于1 m L四氫呋喃溶液中，利用推動(dòng)泵以1 m L/h的流速勻速地將四氫呋喃溶液滴加到10 m L去離子水中，透析3 h，每隔1 h更換去離子水，去除體系中的四氫呋喃得到納米材料水溶液，其濃度為1 mg/m L。

1.6 結(jié)構(gòu)表征

采用核磁共振(NMR Bruker 400 MHz)和傅里葉變換紅外光譜(FT-IR BNICOLET IS10)分析樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM HITACHI Regulus 8100)記錄納米材料的形貌，采用熒光光譜(RF-5301pc)記錄納米材料與染料、果糖結(jié)合產(chǎn)生的熒光變化。

1.7 熒光傳感器的構(gòu)建與熒光測試

PVPBA-b-PDMA 納米材料與HQ、ARS、QC 結(jié)合構(gòu)建熒光傳感器:取1 m L 配置好的納米材料水溶液，加入不同含量的染料如HQ、ARS和QC，靜置5 min后，記錄溶液熒光強(qiáng)度與染料濃度的關(guān)系。激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm。

PVPBA-b-PDMA/QC與果糖的熒光測試:取1 m L配置好的納米材料水溶液，加入9.07 mg QC，配置成含有30 mmol/L QC，5.8 mmol/L苯基硼酸基團(tuán)的熒光傳感器，加入不同含量的果糖，靜置5 min后，記錄溶液熒光強(qiáng)度與染料濃度的關(guān)系。激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度為10 nm。

所有熒光測量均在室溫下進(jìn)行。通過將數(shù)據(jù)擬合到方程(1)中來計(jì)算Stern-Volmer靜態(tài)猝滅常數(shù)

式中F是初始未淬滅的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0是存在猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，Ksv是靜態(tài)猝滅常數(shù)，Q是猝滅劑濃度。

通過將數(shù)據(jù)擬合到等式(2)中計(jì)算檢測限

式中σ表示空白溶液的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差，Ksv表示熒光靜態(tài)猝滅擬合曲線的斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)與形貌

2.1.1 結(jié)構(gòu)分析。VPBA 的核磁共振氫譜、碳譜、硼譜譜圖如圖3所示，從核磁氫譜可以看出，VPBA 單體含有6種不同化學(xué)環(huán)境的氫原子，圖3(a)中a處(δ＝5.29，5.89)的信號峰為乙烯基雙鍵=CH2上的H，b處(δ＝6.76)的信號峰為與雙鍵相連的=CH-中的H，c處(δ＝7.44)的信號峰為苯環(huán)上靠近雙鍵的氫，d處(δ＝7.77)的信號峰為苯環(huán)上靠近硼羥基的氫，e處(δ＝8.08)為硼羥基-B(OH)2的氫信號峰。同時(shí)核磁碳譜在139.00，137.25，134.90，125.61，115.21出現(xiàn)了信號峰，核磁硼譜在27.58出現(xiàn)了唯一的硼酸基團(tuán)信號峰。核磁譜圖證明了VPBA 的成功合成。

圖3 VPBA 的核磁共振氫譜(a)、碳譜(b)和硼譜(c)

圖4為PDMA 的1H 核磁譜圖，從核磁氫譜可以看出，雙鍵特征信號峰的消失，1～2出現(xiàn)的寬主鏈信號峰，以及對核磁信號峰的歸屬，證實(shí)了PDMA 的合成，通過比較2.79與5.07的峰面積積分，計(jì)算出均聚物PDMA 的聚合度為90。

圖4 PDMA 的核磁共振氫譜

圖5為PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物的核磁共振氫譜圖與FT-IR 光譜圖，通過比較6.60與2.75的鼓包峰面積積分，計(jì)算出了嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)為PVPBA315-b-PDMA90，PVPBA730-b-PDMA90。通過嵌段聚合物的FT-IR 光譜(如圖5(c)、(d)所示)，3 405 cm－1(-OH 鍵)，1 608 cm－1(C=O 鍵)，1 342 cm－1(B-O 鍵)，以及1 015 cm－1(B-O-H 伸展)的出現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PVPBA 鏈段的存在，以及PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物的形成。

圖5 (a)PVPBA315-b-PDMA90; (b)PVPBA 730-b-PDMA 90的核磁共振氫譜;(c)PVPBA 315-b-PDMA 90; (d)PVPBA730-b-PDMA90的FT-IR 光譜圖

2.1.2形貌。圖6是納米材料的掃描電鏡圖，從6(a)可以看出，由PVPBA315-b-PDMA90自組裝形成的納米材料呈現(xiàn)出了核殼球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為100 nm，大部分尺寸較均勻，但是也存在極少300 nm 的球殼結(jié)構(gòu)納米材料。而從6(b)可以看出當(dāng)摩爾比VPBA∶PDMA＝1 000∶1時(shí)，PVPBA730-b-PDMA90自組裝形成的納米材料也呈現(xiàn)出了核殼球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為200 nm，但會形成小尺寸的團(tuán)聚體。通過改變VPBA 與PDMA的摩爾比，我們可以得到2種尺寸的核殼結(jié)構(gòu)納米材料。

圖6 (a)PVPBA315-b-PDMA90; (b)PVPBA730-b-PDMA90納米材料形貌

2.2 熒光傳感器的構(gòu)建與熒光測試

圖7為納米材料與HQ、QC、ARS結(jié)合之后的熒光光譜。在400 nm 激發(fā)波長的激發(fā)下，PVPBA315-b-PDMA90和PVPBA730-b-PDMA90納米球在與ARS結(jié)合后，在580 nm 左右出現(xiàn)了發(fā)射峰，表現(xiàn)出了紅色熒光。在400 nm 激發(fā)波長的激發(fā)下，PVPBA315-b-PDMA90納米球與HQ 結(jié)合之后在500 nm 出現(xiàn)了發(fā)射峰，表現(xiàn)出了綠色熒光，而PVPBA730-b-PDMA90納米球與HQ 結(jié)合之后在485 nm 出現(xiàn)了發(fā)射峰，表現(xiàn)出了綠色熒光，其熒光強(qiáng)度弱于PVPBA315-b-PDMA90與HQ 結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。納米材料與QC 結(jié)合之后，在440 nm 激發(fā)波長的激發(fā)下，在575 nm 左右出現(xiàn)發(fā)射峰，表現(xiàn)出暗紅色熒光，相比于與HQ、ARS結(jié)合，與QC 結(jié)合之后其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。同時(shí)比較2種尺寸的納米結(jié)構(gòu)與QC結(jié)合產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，PVPBA315-b-PDMA90/QC的熒光強(qiáng)度(635)比PVPBA730-b-PDMA90的熒光強(qiáng)度(440)略強(qiáng)，這是因?yàn)楫?dāng)PVPBA 鏈段越長時(shí)，其自組裝形成納米球的核尺寸越大，在一定程度上會妨礙內(nèi)部的硼酸基團(tuán)與QC結(jié)合。我們利用硼酸基團(tuán)與二醇染料的結(jié)合，成功構(gòu)建了三種熒光傳感器。

圖7 PVPBA315-b-PDMA90納米材料與不同濃度的ARS(a)，HQ(b)，QC(c)結(jié)合的熒光光譜;PVPBA 315-b-PDMA 90納米材料與不同濃度的ARS(d)，HQ(e)，QC(f)結(jié)合的熒光光譜

將果糖和葡萄糖(濃度為200 mmol/L)分別加入到三種熒光傳感器中，如圖8所示。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)將果糖加入到PVPBA-b-PDMA/QC熒光傳感器中時(shí)，體系熒光發(fā)生了明顯的淬滅現(xiàn)象，達(dá)到了檢測果糖的目的。當(dāng)加入葡萄糖之后，PVPBA-b-PDMA/QC體系熒光沒有發(fā)生明顯變化，因此PVPBA315-b-PDMA90/QC可以實(shí)現(xiàn)對果糖的特異性檢測。我們利用VPBA315-b-PDMA90/QC熒光傳感器熒光強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)靈敏度實(shí)驗(yàn)。

圖8 熒光傳感器加入果糖或葡萄糖的熒光照片示意圖(365 nm 紫外燈照射下)

圖9為熒光傳感器PVPBA315-b-PDMA90/QC 檢測果糖的熒光光譜，從圖中可以看出，當(dāng)果糖的加入量為5.5 mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度開始減小，在165 mmol/L 的時(shí)候熒光趨于消失，即果糖的加入會導(dǎo)致熒光淬滅，我們認(rèn)為造成這種現(xiàn)象的原因是果糖與硼酸基團(tuán)的結(jié)合力大于染料QC，當(dāng)果糖競爭性地與硼酸基團(tuán)結(jié)合，染料與硼酸基團(tuán)結(jié)合斷開之后，其熒光消失，發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象。當(dāng)果糖濃度在0～82.5 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，其熒光淬滅的Stern-Volmer曲線表現(xiàn)出線性關(guān)系，其檢測限為60 nmol/L，與其他材料檢測果糖效果相當(dāng)[24]。

圖9 (a)PVPBA315-b-PDMA90/QC檢測不同濃度果糖的熒光光譜(在440 nm 激發(fā));(b) 熒光淬滅的Stern-Volmer

3 結(jié)論

本文采用RAFT 聚合和溶液自組裝方法制備了PVPBA-b-PDMA 球狀納米材料，通過NMR、FT-IR 證實(shí)了聚合物的合成，SEM 證實(shí)了納米材料是具有100、200 nm 兩種尺寸的核殼結(jié)構(gòu)。納米材料與HQ、QC、ARS結(jié)合后其溶液產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，利用這樣的特性，成功構(gòu)建了PVPBA315-b-PDMA90/QC 熒光傳感器，在果糖濃度為0～82.5 mmol/L 范圍內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)線性的熒光淬滅，其檢測限可以低至60 nmol/L，成功實(shí)現(xiàn)了對果糖的高靈敏度和特異性檢測。