李奇炯，顏伏歸

(1.浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，杭州 310000；2.浙江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，杭州 310058)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者的80%～85%[1-2]。盡管目前手術(shù)治療和靶向療法取得了極大的進(jìn)展，然而晚期肺癌患者生存率仍然較低，且超過一半的患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，有必要識(shí)別NSCLC患者新生標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[3-4]。 微RNA (miRNA)是為17～25個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-185-5p在肝癌細(xì)胞和肝癌組織中低表達(dá)，而過表達(dá)miRNA-185-5p能明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。但miRNA-185-5p在NSCLC中的表達(dá)及其作用尚不清晰。本研究旨在識(shí)別miRNA-185-5p在NSCLC中的表達(dá)，并探討miRNA-185-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

(1)臨床標(biāo)本：2018年7月至2019年9月收集40例NSCLC患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本。其中男27例，女13例，年齡39～72歲。所有組織標(biāo)本在獲得后立即置于液氮保存。(2)細(xì)胞系及試劑：人NSCLC細(xì)胞株HCC827、NCL-H358、NCL-H1299、A549、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，胎牛血清、miRNA-NC、miRNA-185-5p模擬物、miRNA-185-5p抑制劑、酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白(YWHAZ)過表達(dá)質(zhì)粒及PCR引物均購(gòu)于上海吉瑪生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒和RevertAid RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermofish科技有限公司；CCK-8試劑盒和脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；兔多抗E-cadherin、兔單抗Vimentin、兔多抗YWHAZ和山羊抗兔IgG H&L抗體均購(gòu)于武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將NSCLC細(xì)胞株HCC827、NCL-H358、NCL-H1299、A549和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板上，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作，分別將 miRNA-NC、miRNA-185-5p模擬物、miRNA-185-5p抑制劑、miRNA-185-5p 模擬物和pcDNA3.0-YWHAZ共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，設(shè)為miRNA-NC組、miRNA-185-5p模擬物組、miRNA-185-5p抑制劑組和miRNA-185-5p模擬物+pcDNA3.0-YWHAZ組。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)miRNA-185-5p和YWHAZ的表達(dá)

使用TRIzol試劑提取NSCLC癌組織和細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA-185-5p引物：5′-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3′；YWHAZ引物。上游：5′-AAA TGA AAG GAG ACT ACT ACC GCT A-3′，下游：5′-AGA CCC AAT CTG ATA GGA TGT GTT G-3′；GAPDH引物。上游：5′-GTC GGA GTC AAC GGA TTT G-3′，下游：5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′；U6引物。上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法處理數(shù)據(jù)。

1.2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔的密度接種于預(yù)涂基質(zhì)膠的Transwell小室上室，每個(gè)上室滴加150 μL細(xì)胞懸液和無血清培養(yǎng)基，在小室下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，24 h后，將下室細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，用結(jié)晶紫染液染色。在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)并取平均數(shù)。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組A549細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板上，每孔150 μL細(xì)胞懸液。分別于接種后24、48、72 h加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用4%多聚甲醛于室溫下固定40 min，PBS洗滌3次，用含0.3% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，5 min后向每個(gè)樣品加50 μL TUNEL檢測(cè)液，在37 ℃下避光孵育60 min，孵育結(jié)束后，PBS洗滌3次，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后各組A549細(xì)胞，提取蛋白樣品。取20 μL總蛋白上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。室溫下，采用5%脫脂牛奶封閉1 h。洗膜后，加入一抗在4 ℃下孵育過夜，洗膜，加入二抗在室溫下孵育1.5 h。洗膜后，ECL顯影，采用圖像分析軟件ImageJ對(duì)Western blot實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果圖像進(jìn)行灰度分析。

1.2.7生物學(xué)信息技術(shù)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證

使用StarBase在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA-185-5p的靶基因。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：野生型+miRNA-185-5p組(共轉(zhuǎn)染野生型載體質(zhì)粒和miRNA-185-5p)、野生型+miRNA-NC組(共轉(zhuǎn)染野生型載體質(zhì)粒和miRNA-NC)、突變型+miRNA-185-5p組(共轉(zhuǎn)染突變型載體質(zhì)粒和miRNA-185-5p模擬物)、突變型+miRNA-NC組(共轉(zhuǎn)染突變型載體質(zhì)粒和miRNA-NC)。檢測(cè)各組A549細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-185-5p在NSCLC組織中的表達(dá)

通過分析GSE152702數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，miRNA-185-5p在NSCLC患者血漿中的表達(dá)水平明顯低于健康者。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，NSCLC癌組織中miRNA-185-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，見圖1A。與正常人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B比較，NSCLC各細(xì)胞株miRNA-185-5p表達(dá)水平明顯降低，其中A5495細(xì)胞miRNA-185-5p表達(dá)水平最低，見圖1B。故選擇A5495細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A:NSCLC癌組織與癌旁組織miRNA-185-5p表達(dá)水平比較;B:各組細(xì)胞株miRNA-185-5p表達(dá)水平比較;1：BEAS-2B；2：HCC827；3：NCL-H358；4：NCL-H1299；5：A5495；a：P<0.01，與癌旁組織比較；b：P<0.05，c:P<0.01,與BEAS-2B比較。

2.2 各組A549細(xì)胞miRNA-185-5p表達(dá)水平及細(xì)胞增殖和凋亡率比較

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miRNA-NC組比較，miRNA-185-5p模擬物組miRNA-185-5p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制劑組miRNA-185-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖2A。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組A549細(xì)胞的增殖能力，第48小時(shí)開始，與miRNA-NC組比較，miRNA-185-5p模擬物組增殖能力明顯降低(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制劑組增殖能力明顯升高(P<0.05)，見圖2B。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miRNA-NC組比較，miRNA-185-5p模擬物組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，miRNA-185-5p抑制劑組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，見圖2C、D。

A:RT-qPCR檢測(cè);B:CCK-8檢測(cè);C、D:TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及顯微鏡觀察(×100);1：miRNA-NC組；2：miRNA-185-5p模擬物組；3：miRNA-185-5p抑制劑組；a：P<0.05，b：P<0.01，與miRNA-NC組比較。

2.3 各組A549細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與miRNA-NC組相比，miRNA-185-5p模擬物組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，Vimentin表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；miRNA-185-5p抑制劑組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.01)，E-cadherin表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Vimentin表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見圖3。

A、B:Transwell檢測(cè)(×100);C、D:Western blot檢測(cè);1：miRNA-NC組；2：miRNA-185-5p模擬物組；3：miRNA-185-5p抑制劑組；a：P<0.05，b：P<0.01，與miRNA-NC組比較。

2.4 StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè)miRNA-185-5p靶向調(diào)控YWHAZ表達(dá)水平

通過StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA-185-5p靶基因進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)有3 740個(gè)基因，通過Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)有385個(gè)基因，隨后通過Human protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與NSCLC不良預(yù)后有關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)有297個(gè)基因，將檢索出的基因制作韋恩圖，見圖4A。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析YWHAZ在肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)YWHAZ在肺腺癌和肺鱗癌中均高表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)，見圖4B、C。StarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析顯示，YWHAZ-3′UTR中部分核苷酸序列能與miRNA-211-5p形成互補(bǔ)配對(duì)，見圖4D。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，與miRNA-NC組相比較，miRNA-185-5p模擬物組WT載體的細(xì)胞螢光素酶相對(duì)活性明顯降低(P<0.05)，而MUT熒光素酶相對(duì)活性則無明顯差異(P>0.05)，見圖4E。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miRNA-NC組相比較，miRNA-185-5p模擬物組細(xì)胞中YWHAZ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，而miRNA-185-5p抑制劑組細(xì)胞中YWHAZ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見圖4F。

A:基因韋恩圖;B、C:GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析;D:StarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析;E:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè);F:Wetern blot檢測(cè);1：miRNA-NC組；2：miRNA-185-5p模擬物組；3：miRNA-185-5p抑制劑組;a：P<0.01，與miRNA-NC組比較。

2.5 miRNA-NC組、miRNA-185-5p模擬物組及miRNA-185-5p模擬物+pcDNA3.1-YWHAZ組A549細(xì)胞侵襲、增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

miRNA-NC組比較，miRNA-185-5p模擬物組48 h后細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Vimentin表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與miRNA-185-5p模擬物組比較，miRNA-185-5p模擬物+pcDNA3.1-YWHAZ組48 h后細(xì)胞增殖能力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，E-cadherin表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Vimentin表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見圖5。

A:細(xì)胞增殖曲線圖;B:細(xì)胞凋亡檢測(cè);C:侵襲細(xì)胞檢測(cè);D、E:Wetern blot檢測(cè);1：miRNA-NC組；2：miRNA-185-5p模擬物組；3：miRNA-185-5p模擬物+pcDNA3.0-YWHAZ組；a：P<0.01，b：P<0.05，與miRNA-NC組比較;c：P<0.05，與miRNA-185-5p模擬物組比較。

3 討 論

NSCLC是人類最常見的惡性腫瘤，也是腫瘤相關(guān)死亡最常見的原因；NSCLC的常規(guī)治療手段包括手術(shù)治療、放療和化療[1-2]。然而很多患者確診時(shí)已經(jīng)為疾病進(jìn)展期，錯(cuò)過了手術(shù)時(shí)機(jī)；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，預(yù)后極差[1-2]。因此，闡明NSCLC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于提高NSCLC的診療和治療具有重要意義。

miRNA通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，發(fā)揮著抑癌或促癌的作用[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-939在NSCLC患者中高表達(dá)，抑制miRNA-939能明顯降低NSCLC侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-185-5p在NSCLC中低表達(dá)，而上調(diào)miRNA-185-5p的表達(dá)，會(huì)抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果與之類似，發(fā)現(xiàn)miRNA-185-5p在NSCLC組織及細(xì)胞系中明顯下調(diào)，進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-158-5p能明顯抑制NSCLC細(xì)胞侵襲、增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力，并促進(jìn)凋亡，結(jié)果顯示miRNA-158-5p在NSCLC中發(fā)揮著抑癌基因的作用。本研究結(jié)果提示，外源性誘導(dǎo)miRNA-158-5p可能是治療NSCLC的潛在思路。

YWHAZ是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心樞紐蛋白，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控[12]。有研究報(bào)道顯示，YWHAZ在上皮性卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲低YWHA的表達(dá)，能明顯降低上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[13]。在人骨肉瘤細(xì)胞中，通過下調(diào)YWHAZ的表達(dá)，能抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等惡性表型[14]。DENG等[15]研究報(bào)道，YWHAZ的表達(dá)在NSCLC組織中明顯上調(diào)，且其高表達(dá)與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示患者的不良預(yù)后；沉默YWHAZ的表達(dá)能明顯抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-158-5p與YWHAZ存在靶向關(guān)系，miRNA-158-5p可負(fù)向調(diào)控YWHAZ的表達(dá)，上調(diào)YWHAZ可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miRNA-211-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲、增殖的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC細(xì)胞中，miRNA-158-5p與YWHAZ之間存在調(diào)控關(guān)系。本研究不僅幫助闡明了miRNA-158-5p抑制NSCLC細(xì)胞惡性表型的可能分子機(jī)制，也助于解釋YWHAZ在NSCLC組織中表達(dá)紊亂的可能原因。

本研究有一些局限性，(1)在本研究中，miRNA-158-5p在NSCLC組織中的表達(dá)水平和患者的預(yù)后關(guān)系尚不明確。(2)本研究生物信息學(xué)分析提示，miRNA-158-5p有多個(gè)候選的靶基因，miRNA-158-5p可能通過除YWHAZ之外的其他靶基因調(diào)控NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，這些潛在的miRNA-158-5p靶基因還有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。(3)針對(duì)miRNA-158-5p的生物學(xué)功能，本研究?jī)H設(shè)計(jì)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在后續(xù)工作中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將有助于進(jìn)一步明確miRNA-158-5p在NSCLC中的抑癌特性。

綜上所述，本研究探索了miRNA-158-5p在NSCLC中的表達(dá)和功能，并證實(shí)miRNA-158-5p可通過調(diào)控YWHAZ抑制NSCLC細(xì)胞侵襲、增殖，并促進(jìn)凋亡。本研究結(jié)果顯示，miRNA-158-5p/YWHAZ軸在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中的意義，為NSCLC的診斷和治療提供了潛在的標(biāo)志物和靶點(diǎn)。