李衛(wèi)東，蔣玉婷，段宏偉，何海軍，楊 帥，丁自強(qiáng)，吳建新，張恩秋，胡俊杰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.四川省廣安市前鋒區(qū)桂興鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，廣安 638500；3.定西市畜牧技術(shù)推廣站，定西 743000)

褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果體合成和分泌的一種吲哚類激素，對(duì)機(jī)體的生理功能具有廣泛的調(diào)控作用[1-2],如抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和生殖生理功能調(diào)節(jié)等[2]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，褪黑素的多種調(diào)節(jié)作用是通過(guò)其高親和力G蛋白耦聯(lián)膜受體介導(dǎo)的，即MT1和MT2，且不同受體介導(dǎo)所發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制可能不同[7]。目前，在人及大鼠等動(dòng)物胃中研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素具有影響胃動(dòng)力、抑制胃酸和胃蛋白分泌、清除氧自由基、保護(hù)胃黏膜等多種功能[8-9]。而綿羊作為反芻動(dòng)物，其消化系統(tǒng)極為復(fù)雜，各胃室功能差異較大[10]，在前期研究中已證實(shí)綿羊胃組織具有合成褪黑素的能力[11]，但其特異性膜受體MT1和MT2在綿羊胃組織中的表達(dá)規(guī)律尚待揭示。

基于褪黑素與胃組織特異性受體耦合發(fā)揮調(diào)控胃動(dòng)力的機(jī)制，研究褪黑素激素受體在體內(nèi)的分布及生物學(xué)特性對(duì)于闡明褪黑素的作用機(jī)制十分重要。本研究運(yùn)用ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化(immunohistochemistry，IHC)和Western blotting等分子生物學(xué)方法，從基因和蛋白水平探明褪黑素膜受體MT1和MT2在綿羊各胃中的定位和定量變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步研究褪黑素對(duì)綿羊等反芻動(dòng)物不同胃功能的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樣品采自蘭州市某屠宰場(chǎng)6只10～15月齡健康綿羊的全胃組織，液氮保存立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，依次分離瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃4個(gè)胃室，再將瘤胃依據(jù)組織形態(tài)分離背囊和腹囊組織。部分樣品用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫組化檢測(cè)，其余樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗MT1抗體購(gòu)自PLIabs公司；兔抗MT2抗體購(gòu)自Abcam公司；SP-0024 HistostainTM-Plus Kits免疫組化染色試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液和陽(yáng)離子防脫玻片均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液、TRIquick Reagent、PMSF和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Go ScriptTMReverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；Trans Start Green qPCR Super Mix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；綿羊褪黑素ELISA試劑盒購(gòu)自上海穎心實(shí)驗(yàn)室。

移液槍購(gòu)自Eppendorf公司；超低溫冰箱、4 ℃離心機(jī)和ND2000紫外分光光度計(jì)均購(gòu)自Thermo Fisher公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽均購(gòu)自Bio-Rad公司；超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自Pultton公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Device公司；正置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法測(cè)定綿羊不同胃室組織中褪黑素含量 參照綿羊褪黑素ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，將樣品置于預(yù)冷的含有50 mmol/L EDTANa2(pH 7.4)的PBS中，以9倍樣品重量的體積進(jìn)行勻漿處理，超聲波破碎后4 ℃、3 000×g離心15 min，提取上清液并于-80 ℃保存。將瘤胃背囊、瘤胃腹囊、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃組織上清液加入包被好的96孔板中，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(S0-S5)50 μL。空白孔不加，樣本孔加上清液10 μL，再加入Sample稀釋液40 μL，除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 100 μL，于37 ℃溫育60 min；棄去液體，拍干孔內(nèi)液體后每孔加入洗滌液1 mL，震蕩洗滌1 min，拍干，重復(fù)洗滌5次或以上。顯色：除對(duì)照孔外其他每孔加入底物A、B各50 μL，置于37 ℃避光溫育15 min。每孔加入終止液50 μL，在15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的D值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體mRNA的表達(dá)差異 將試驗(yàn)樣品在液氮中快速研磨至粉狀，分別稱取500 g，加入1 mL Trizol裂解液提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNAD260 nm/D280 nm值及濃度。運(yùn)用Go ScriptTMReverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank中公布的綿羊MT1和MT2受體mRNA序列，選用β-actin作為內(nèi)參基因，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)MT1、MT2和β-actin的引物(表1)。使用Trans Start Top Green qPCR Super Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。PCR反應(yīng)體系20 μL：Trans Start Green qPCR Super Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL， ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)。

表1 引物信息

1.2.3 免疫組化檢測(cè)綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體分布 將不同胃室組織切片于60 ℃烘箱內(nèi)烘烤4 h，經(jīng)脫蠟和檸檬酸鈉煮沸抗原修復(fù)，按SP法免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，一抗MT1(1∶400)和MT2(1∶400)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗HRP標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育20 min后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染2 min，用PBS漂洗，中性樹(shù)膠封片，干燥后，在顯微鏡下觀察、拍照。陰性對(duì)照一抗用PBS代替，其余步驟一致。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體蛋白的表達(dá)差異 在液氮中將試驗(yàn)樣品快速研磨至粉狀，分別稱取500 g，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF(1 mmol/L)提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白裂解液75 μL加入25 μL 4×Loading buffer，98 ℃變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗MT1(1∶1 000)、MT2(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育過(guò)夜，PBST清洗5次，加入ECL發(fā)光液檢測(cè)蛋白條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理匯總，然后運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)褪黑素含量及MT1和MT2基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊不同胃室組織中褪黑素含量測(cè)定結(jié)果

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，在綿羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃中均檢測(cè)到了褪黑素，依次為0.69、0.66、0.52、1.10和1.55 pg/mL，皺胃中含量最高，顯著高于其他胃室(P<0.05)，瓣胃中含量顯著高于瘤胃背囊、瘤胃腹囊和網(wǎng)胃(P<0.05)(圖1)。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below圖1 綿羊不同胃室組織中褪黑素的含量Fig.1 Content of melatonin in different stomachs of sheep

2.2 綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體mRNA的表達(dá)

由圖2可知，在綿羊的各胃室組織中均檢測(cè)到褪黑素受體MT1和MT2 基因mRNA。皺胃中MT1和MT2基因mRNA表達(dá)量最高，顯著高于其他胃室(P<0.05)；其次是瘤胃腹囊，顯著高于瘤胃背囊、網(wǎng)胃和瓣胃(P<0.05)，瘤胃背囊的表達(dá)量最低，而MT1基因mRNA在瓣胃中的表達(dá)量顯著高于瘤胃背囊和網(wǎng)胃(P<0.05)，MT2基因mRNA在瓣胃中的表達(dá)量顯著高于瘤胃背囊(P<0.05)。

圖2 綿羊不同胃室組織中MT1和MT2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of MT1 and MT2 gene mRNA in different stomachs of sheep

2.3 綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體分布

由圖3可知，MT1和MT2分布在綿羊不同胃中的整個(gè)黏膜層(瘤胃背囊和瘤胃腹囊的結(jié)果一致)，瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃均為無(wú)腺部，在黏膜上皮基底層陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)；皺胃為有腺部，主要分布在黏膜層，在黏膜上皮陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，在固有層胃底腺體中的分布呈由底部到頸部呈逐漸增多的趨勢(shì)。

2.4 綿羊不同胃室組織中褪黑素膜受體蛋白的表達(dá)

由圖4可知，在綿羊不同胃室組織中均檢測(cè)到MT1和MT2蛋白的表達(dá)，且MT1和MT2在網(wǎng)胃中的表達(dá)量顯著高于瘤胃背囊、瘤胃腹囊和皺胃(P<0.05)。MT1蛋白在瓣胃中的表達(dá)量顯著高于瘤胃背囊和皺胃(P<0.05)，MT2蛋白在在瓣胃中的表達(dá)量顯著高于瘤胃腹囊和皺胃(P<0.05)。

箭頭表示蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)Arrows indicate positive expression of the protein圖3 綿羊不同胃室組織中MT1和MT2蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(400×)Fig.3 Immunohistochemistry detection result of MT1 and MT2 in different stomachs of sheep (400×)

1～5，分別為瘤胃背囊、瘤胃腹囊、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃1-5，Saccus ruminis dorslis, saccus ruminis ventralis, reticulum, omasum and abomasum, respectively圖4 綿羊不同胃室組織中MT1和MT2蛋白的表達(dá)量Fig.4 Expression of MT1 and MT2 proteins in different stomachs of sheep

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)ELISA分析發(fā)現(xiàn)綿羊不同胃室組織中褪黑素含量差異較大，其中在皺胃組織中褪黑素含量最高，在瘤胃背囊、瘤胃腹囊和網(wǎng)胃中含量較低。Bubenik等[12-13]在奶牛和豬胃腸道組織中也檢測(cè)到褪黑素，且還發(fā)現(xiàn)褪黑素在奶牛的消化道前段含量較高，而豬的消化道后端含量較高。這些差異可能是由于不同動(dòng)物的飲食習(xí)慣和胃室結(jié)構(gòu)差異所致。此外，基于前期在綿羊胃組織中褪黑素關(guān)鍵合成酶5-羥色胺-N-2酰基轉(zhuǎn)移酶(AANAT)和羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(HIOMT)的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，AANAT和HIOMT表達(dá)量的變化趨勢(shì)與本試驗(yàn)檢測(cè)到的褪黑素表達(dá)模式趨同[11]。這提示，綿羊各胃室至少能以自分泌的方式合成并釋放褪黑素。

褪黑素可通過(guò)抗氧化[14]、抗凋亡[14]、控制胃黏膜血流量[15]及防止胃缺血再灌注損傷[16]等方式保護(hù)胃黏膜，褪黑素對(duì)胃黏膜的保護(hù)和調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)與受體耦聯(lián)結(jié)合后發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素受體MT1和MT2主要分布于黏膜層，表明各胃的黏膜層均存在褪黑素作用靶點(diǎn)。研究顯示，黏液-碳酸氫鹽屏障是保護(hù)胃免受過(guò)量胃鹽酸侵襲的主要結(jié)構(gòu)[17]，而褪黑素可通過(guò)迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)介導(dǎo)刺激胃黏膜層分泌碳酸氫鹽達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用[18]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，褪黑素可能主要是通過(guò)結(jié)合受體MT1和MT2介導(dǎo)參與分泌碳酸氫鹽的生理過(guò)程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MT1和MT2蛋白在固有層呈現(xiàn)從底部到頸部陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)的現(xiàn)象。Taslidere等[19]研究顯示，在胃黏膜層中存在pH梯度，從胃腔到胃壁pH逐漸遞增，胃黏膜中H+主要通過(guò)HCO3-中和，因此胃黏膜中HCO3-分泌由底部到頸部也是逐漸增多的階梯式分布，這提示在綿羊皺胃壁褪黑素可能具有刺激黏膜層分泌碳酸氫鹽中和胃酸保護(hù)自身的作用。此外，褪黑素還可通過(guò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性防止有害物質(zhì)滲透以及促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)方式保護(hù)胃黏膜[20]。褪黑素受體MT1和MT2在黏膜上的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)特點(diǎn)與碳酸氫鹽分泌趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了褪黑素主要通過(guò)MT1和MT2對(duì)碳酸氫鹽分泌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

作為多胃室動(dòng)物，綿羊各胃室功能差異很大。本試驗(yàn)檢測(cè)到綿羊各胃中褪黑素受體MT1和MT2基因和蛋白的表達(dá)存在差異，MT1和MT2蛋白在網(wǎng)胃中表達(dá)量最高，在皺胃中表達(dá)量最低，而MT1和MT2基因在皺胃中的表達(dá)量最高，在瘤胃背囊和網(wǎng)胃的表達(dá)量最低，這種差異表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)錄翻譯空間上存在差異[21]，或與褪黑素在不同胃室組織功能發(fā)揮作用的對(duì)應(yīng)受體不同有關(guān)。Katarina等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胃腸道中，MT1蛋白在十二指腸高表達(dá)，而MT2蛋白則主要分布于結(jié)腸。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，提示褪黑素對(duì)綿羊各胃的調(diào)控存在較大差異。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MT1和MT2在網(wǎng)胃的表達(dá)量最大，可能通過(guò)膜受體介導(dǎo)的功能部位主要在網(wǎng)胃。綿羊前胃黏膜層無(wú)腺體，不能分泌胃液，主要通過(guò)微生物消化和前胃的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行機(jī)械研磨的消化。而皺胃黏膜層有腺體，主要依賴黏膜層分泌胃液進(jìn)行消化，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT1和MT2蛋白在前胃中的表達(dá)量均高于皺胃，表明褪黑素受體MT1和MT2可能主要介導(dǎo)參與褪黑素對(duì)胃動(dòng)力的調(diào)控。在前胃的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，始發(fā)于胃內(nèi)容物刺激網(wǎng)胃發(fā)生雙向收縮，網(wǎng)胃將食糜壓向瘤胃。此外，當(dāng)食物刺激口腔感受器，或食糜的性狀刺激網(wǎng)胃感受器均可引起動(dòng)物機(jī)體發(fā)生逆嘔和反芻[17]。推測(cè)網(wǎng)胃與瘤胃的協(xié)同作用共同促進(jìn)食糜的往復(fù)，佐證了受體在這兩部分表達(dá)量相似的試驗(yàn)結(jié)果，而MT1和MT2在綿羊網(wǎng)胃中的高表達(dá)規(guī)律說(shuō)明褪黑素通過(guò)MT1和MT2介導(dǎo)對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控可能在前胃胃動(dòng)力調(diào)節(jié)中起重要作用，其確切的調(diào)節(jié)作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

褪黑素在綿羊各胃組織中差異化表達(dá)從而發(fā)揮多樣性生理功能，其還可能通過(guò)與胃組織上特異性受體MT1和MT2結(jié)合，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)而調(diào)控前胃受食糜刺激后發(fā)生反芻生理過(guò)程。本研究結(jié)果為闡明褪黑素參與綿羊消化系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。