張志鵬 鄧李紅 王壽富 黃夢婷 李 玲 魏 梅

廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officinatis L.的干燥地上部分[1]，多年生草本植物，花期在每年的6～8 月，在中國主要分布于江蘇、河南、貴州等地。馬鞭草主要含環(huán)烯醚萜類、黃酮類、揮發(fā)油類等化學成分[2-5]，具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[6]，其中抗炎鎮(zhèn)咳的有效成分主要為環(huán)烯醚萜類和黃酮類[7]。《中國植物志》[8]中記載馬鞭草植物形態(tài)為莖四方形，多分枝，葉對生，穗狀花序頂生和腋生等。目前，學者們多對馬鞭草整株藥材進行含量測定和指紋圖譜的研究[9-14]，而本研究通過測定馬鞭草藥材、根、主莖、側枝、葉、花穗的指紋圖譜，對不同形態(tài)部位的色譜圖進行化學模式識別研究，為保證馬鞭草藥用的科學合理性提供實驗數據支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP26 型、ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機（默克密理博實驗設備有限公司）。

1.2 材料

5-羥基馬鞭草苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq18110104，純度＞98.0%）；馬鞭草苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：M-042-180517，純度＞99.36%）；毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201714，純度＞92.5%）；甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）。

11批馬鞭草藥材（編號：A1～A11）經魏梅主任藥師鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officinatis L.，產地信息見表1。將11 批馬鞭草藥材不同部位分開，分別得根（編號：B1～B11）、主莖（編號：C1～C11）、側枝（編號：D1～D11）、葉（編號：E1～E11）、花穗（：編號F1～F11）。

表1 藥材產地信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性

Waters HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫，洗脫程序：0～2 min，2%→10%A；2～12 min，10%→18%A；12～16 min，18%A；16～23 min，18%→25%A；23～28 min，25%→35%A；28～33 min，35%→60%A；33～35 min，60%→75%A；35～45 min，75%→95%A；45～50 min，95%→2%A。柱溫35℃；流速0.3 ml/min；檢測波長230 nm；進樣量1 μl。

2.2 對照品溶液的制備

取5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含5-羥基馬鞭草苷45 μg、馬鞭草苷66 μg、毛蕊花糖苷123 μg 的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過二號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，搖勻，密塞，稱定重量，加熱回流120 min，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇補重，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜，濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下檢測，重復進樣6 次。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%，提示儀器精密度良好。

2.4.2 重復性考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，平行6 份，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下檢測。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD＜1%，相對峰面積RSD＜3%，提示該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，室溫放置，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下檢測。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD＜2%，相對峰面積RSD＜3%，提示供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 超高效液相色譜指紋圖譜研究

取11 批馬鞭草藥材、根、主莖、側枝、葉和花穗，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下檢測，采集不同部位的色譜圖，并將其導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）處理，分別以A1、B1、C1、D1、E1 和F1 圖譜作為參照，生成藥材、根、主莖、側枝、葉和花穗的指紋圖譜共有模式及其對照指紋圖譜，見圖1。藥材及花穗標定共有峰22 個，葉21 個，主莖和側枝20 個，根14 個。通過對照品比對，指認了7 號峰為5-羥基馬鞭草苷、8 號峰為馬鞭草苷、12 號峰為毛蕊花糖苷，見圖2。計算11 批馬鞭草不同部位超高效液相色譜指紋圖譜的相似度，結果顯示藥材與側枝的相似度較高，均＞0.98；與根的相似度較低，相似度＜0.95的有10 批，提示藥材與根整體差異較大。

圖1 馬鞭草不同部位超高效液相色譜指紋圖譜及對照圖譜

圖2 馬鞭草藥材共有對照指紋圖譜與混合對照品色譜圖

2.6 化學模式識別研究

2.6.1 聚類分析 采用HemI 1.0 軟件對11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數據進行熱圖和聚類分析（空白處記為色譜峰缺失）。熱圖分析結果顯示，花穗、葉、側枝各共有特征峰顏色偏暖，提示各成分含量較高；根、主莖各共有特征峰顏色偏冷，提示各成分含量較低。聚類分析結果表明藥材與側枝的一致性較高，且與根和主莖區(qū)分明顯。見圖3。

圖3 馬鞭草不同部位熱圖和聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析 采用SIMCA-P 14.0 軟件對11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數據進行主成分分析，見圖4。不同部位樣品能夠分別集中聚在一起，根和主莖區(qū)分界線清晰，但距離較近，提示根和主莖在形態(tài)學部位上相連接，化學成分較為接近，仍可以通過主成分分析區(qū)分；藥材和側枝聚集在一起，無法區(qū)分，提示側枝與藥材無明顯差異。

圖4 馬鞭草不同部位的主成分分析二維得分散點圖

2.6.3 偏最小二乘法判別分析 結合VIP 值對11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數據進行偏最小二乘法判別分析，以VIP＞1.0 作為標準篩選對模型貢獻較大的7 個變量，由大到小依次為色譜峰7、17、16、3、21、2、8 號，提示這些成分是引起馬鞭草不同部位成分差異的主要標志性成分。

3 討論

通過指紋圖譜進行中藥的多組分研究分析更能體現藥材質量的整體性[15-21]，基于超高效液相色譜指紋圖譜研究藥材去除非藥用部位的質量評價研究具有十分重要的指導意義[22-25]。本研究結果顯示，色譜峰16 號僅出現在花穗中；葉中17 號峰含量非常低，而花穗中含量較高，推測藥材中色譜峰16、17 號峰主要來自于花穗，可將其作為6～8 月開花時采收的標志性化學成分，保證化學成分合成和富集。偏最小二乘法判別分析分析顯示5-羥基馬鞭草苷是形成不同部位差異的重要指標，其在藥材中質量分數相對較高，具有抗炎、抗菌等作用，作為評價馬鞭草不同部位差異的指標具有重要意義[6,26]。

本研究建立的指紋圖譜和化學模式識別分析方法能較好地反映馬鞭草不同形態(tài)部位化學成分的分布規(guī)律及差異性，但不同部位化學成分的差異及所占藥材比例不同與臨床療效是否緊密相關，尚需結合藥效學及安全性評價進行系統(tǒng)性研究。