鄭學(xué)芝 徐秋玲 郭 冉 孫 健 王文婷

牡丹江醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011

中藥夏枯草具有散結(jié)、明目、清火、消腫、抗腫瘤等作用，所含化學(xué)成分包括三萜類（熊果酸、齊墩果酸）、黃酮類、香豆素類、有機酸類、糖類、揮發(fā)油類等。其中夏枯草提取物的抗腫瘤作用表現(xiàn)在抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、誘導(dǎo)分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、抑制新生血管生成、抗突變等多方面。但傳統(tǒng)中藥抗腫瘤具有藥物生物利用度低、起效慢、療程長等特點，影響了其在臨床上的應(yīng)用。因此需要探究能增強夏枯草抗腫瘤療效的方法。食管癌是嚴重危害人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與多基因表達異常有關(guān)，所以研究致癌相關(guān)基因并加以干預(yù)具有重要意義。Survivin 基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，參與調(diào)控細胞凋亡和細胞周期，是最強的凋亡抑制因子之一，下調(diào)Survivin 基因表達可以促進腫瘤細胞的凋亡，Survivin 基因參與調(diào)控食管癌ERK 信號傳導(dǎo)通路，Survivin 蛋白表達與食管癌分化程度和TNM 分期有關(guān)，故推測Survivin 基因可能對食管癌細胞的惡性增殖發(fā)揮重要作用。但臨床實踐表明，單獨干預(yù)一個基因不能起到穩(wěn)定持久的抗癌效果。所以本研究設(shè)計將中藥夏枯草三萜類提取物與Survivin基因靶點干預(yù)聯(lián)合應(yīng)用，探究從調(diào)控基因表達角度，能否起到優(yōu)化夏枯草抗食管癌療效的作用及可能性，觀察中藥夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用的影響，研究兩種治療方法對食管癌Eca-109 細胞是否具有協(xié)同抑制作用，Survivin-siRNA 能否增強夏枯草的抗腫瘤敏感性，進一步探究夏枯草抗食管癌機制，為臨床食管癌中醫(yī)藥治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

食管癌Eca-109 細胞：購自原中科院上海細胞所，傳代培養(yǎng)后由牡丹江醫(yī)學(xué)院科研中心保存；夏枯草三萜類提取物：利用大孔樹脂法得到三萜類成分，用95%乙醇溶解，配成生藥濃度為100 mg/ml 的夏枯草提取液，夏枯草購自廣東匯群中藥飲片公司（貨號：粵20160301）；RPMI1640 培養(yǎng)基（貨號：22400-0089）、胎牛血清（貨號：10270-106）、胰蛋白酶（貨號：25200-056）：購自Gibco 公司；RT-PCR 試劑盒（貨號：RR037A）：購自takara 公司；Trizol（貨號：R0016）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0011）、Survivin 抗體（貨號：AS792）、GAPDH 抗體（貨號：AF1186）：購自碧云天生物技術(shù)研究所；Survivin-siRNA B 套餐（貨號：A10002）、siRNA-Mate 轉(zhuǎn)染試劑（貨號：G04003）：購自Gene Pharma 公司；Annexin-V-FITC/PI 凋亡雙染試劑盒（貨號：556547）：購自BD 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（貨號：BA1056）、CCK-8 試劑盒（貨號：AR1160）：購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

食管癌Eca-109 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d 傳代一次，選取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3 Survivin-siRNA 的選用及設(shè)計

參考文獻[12]及Gen Bank 中人類Survivin 基因序列，設(shè)計靶向人Survivin 基因的特異性siRNA 序列為：正向5-′GGCUGGCUUCAUCCACUGCTT-3′，反向5′-GCAGU-GGAUGAAGCCAGCCTT-3′；無意義siRNA序列為：正向5-′CAGUCGCGUUUGCGACUGGTT-3′，反向5′-CCAGUCGCAA ACGCGACUGTT-3′。

1.4 實驗分組

空白對照組：食管癌Eca-109 細胞常規(guī)培養(yǎng)，不進行任何處理；陰性對照組：食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染無意義siRNA；夏枯草單獨處理組：夏枯草三萜類提取物處理食管癌Eca-109 細胞；siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組：食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組：食管癌Eca-109 細胞轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA 24 h 后入夏枯草三萜類提取物。調(diào)整夏枯草三萜類提取物終濃度為168 μg/ml。

1.5 Survivin mRNA 表達檢測

轉(zhuǎn)染前24 h 將食管癌Eca-109 細胞以2×10/孔接種至6 孔板上，待胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組相應(yīng)細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物，之后所有組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行指標檢測。收集各組食管癌Eca-109 細胞，利用Trizol 試劑一步法提取總RNA。按照RT-PCR 試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及擴增。以GAPDH 作為內(nèi)參照，設(shè)計Survivin、GAPDH引物序列如下。Survivin 基因產(chǎn)物約363 bp，正向引物P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC-3′，反向引物P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC-3′；內(nèi)參照GAPDH 基因產(chǎn)物長度約280 bp，正向引物P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA-3′，反向引物P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 次循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像分析系統(tǒng)分析Survivin 基因表達情況。

1.6 Survivin 蛋白表達檢測

收集各組食管癌Eca-109 細胞，加入RIPA 裂解緩沖液，提取總蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。采用12%SDS-PAGE 電泳分離后進行轉(zhuǎn)膜、封閉，Survivin 抗體（1∶1000）、GAPDH 抗體（1∶1000）室溫孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（1∶1000）二抗室溫孵育2 h，暗室中ECL 反應(yīng)后曝光顯影，用quantity one 4.6.2 軟件進行分析。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率

在96 孔培養(yǎng)板上按照5×10/孔接種各組食管癌細胞，每組各接種3 孔。待細胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組細胞轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，向所有組細胞待測孔內(nèi)各加入CCK-8 試劑10 μl，培養(yǎng)箱孵育4 h 后于450 nm 處用酶標儀測定各孔的吸光度（optical density，OD 值）。以培養(yǎng)液做空白對照并調(diào)零，測3 次，取平均值。細胞增殖抑制率=1-細胞存活率，即細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD 值/空白對照組OD 值）×100%。

1.8 細胞凋亡檢測

在6 孔板上按2×10接種各組食管癌細胞，待細胞增殖達到30%～50%密度時，按siRNA-Mate 操作說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、陰性對照組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組相應(yīng)細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h，夏枯草單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組加入夏枯草三萜類提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取各組腫瘤細胞1×10個，加入Annexin-V-FITC 4 μl，PI 5 μl，Annexin-V 結(jié)合緩沖液400 μl，室溫條件下避光作用15 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Survivin mRNA 表達檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組食管癌細胞中Survivin mRNA 的表達情況

2.2 Survivin 蛋白表達檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin 蛋白表達水平低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2、表1）。

圖2 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白的表達情況

表1 各組食管癌細胞中Survivin 蛋白表達水平的比較（±s）

2.3 細胞增殖抑制率檢測

夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組食管癌細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

2.4 細胞凋亡檢測

流式雙染結(jié)果顯示，夏枯草單獨處理組、siRNA轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞凋亡率高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3、表3）。

圖3 各組食管癌細胞凋亡率

表3 各組食管癌細胞凋亡率（%，±s）

3 討論

食管癌發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)居高不下，隨著現(xiàn)代外科醫(yī)學(xué)高速發(fā)展，手術(shù)輔助以放化療的治療方式使食管癌患者的5年生存率得到了改善，但還存在術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及因手術(shù)創(chuàng)傷、放化療副作用等因素造成患者的生活質(zhì)量降低等問題，因此中醫(yī)藥治療、靶向基因干預(yù)等非手術(shù)治療方法已成為食管癌防治研究的熱點。與傳統(tǒng)化療藥物相比，夏枯草毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥，患者主觀接受度高，但是夏枯草成分復(fù)雜，抗腫瘤作用起效慢，療程長，生物利用度低，限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，有必要通過聯(lián)合其他抗腫瘤策略以利于夏枯草提取物抗食管癌的臨床應(yīng)用及推廣。

食管癌的發(fā)生與促凋亡基因和抗凋亡基因的失衡有關(guān)，其中Survivin 基因?qū)κ彻馨┰鲋澈偷蛲龅挠绊懹绕滹@著。Survivin 基因在胚胎組織、多種惡性腫瘤組織中廣泛表達，具有調(diào)節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡、調(diào)控腫瘤血管生成等作用。研究表明，Survivin在腫瘤組織高表達不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，而且與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、生存期和復(fù)發(fā)有關(guān)，抑制Survivin 基因表達能起到抑制腫瘤的作用。

基于以上原因，本研究探討Survivin-siRNA 能否增強中藥夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用，從基因表達層面探究夏枯草抗食管癌作用機制。本研究結(jié)果顯示，夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA及Survivin 蛋白表達水平均低于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組、夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于空白對照組與陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞Survivin mRNA 及Survivin 蛋白表達水平均低于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；夏枯草+siRNA 轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用組的食管癌Eca-109 細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均高于夏枯草單獨處理組、siRNA 轉(zhuǎn)染單獨處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Survivin 基因沉默與夏枯草三萜類提取物對食管癌Eca-109 細胞具有協(xié)同抑制效應(yīng)，Survivin 基因沉默增加了夏枯草三萜類提取物抑制食管癌細胞增殖敏感性。夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA 從理論上有望為臨床食管癌中藥及靶向治療提供新的思路和方案。推測夏枯草抗食管癌作用與抑制Survivin 基因表達密切相關(guān)，具體機制有待于進一步研究。

目前，有關(guān)Survivin-siRNA 聯(lián)合中藥夏枯草在食管癌治療中的研究較少，本研究只觀察了離體情況下中藥夏枯草三萜類提取物聯(lián)合Survivin-siRNA 對食管癌Eca-109 細胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用，今后尚需通過體內(nèi)動物實驗進一步驗證以Survivin 作為基因靶點聯(lián)合夏枯草提取物對在體食管癌的影響，以及二者聯(lián)合應(yīng)用作為治療食管癌策略的有效性及可行性，為夏枯草的抗腫瘤臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。