文東虎

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 黑龍江 齊齊哈爾 161041)

白藜蘆醇(RSV)是多酚類化合物,又稱芪三酚,是腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，化學(xué)名稱是3,4,5-三羥基苯二烯[1]。白藜蘆可不僅可殺菌，還可抗炎、癌等。最近幾年，RSV抗腫瘤作用是研究核心，不同細(xì)胞，RSV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制與之存在很大不同，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RSV會引起HL-60細(xì)胞凋亡，此作用呈時間、劑量是雙依賴性，其原理與活性氧(ROS)有聯(lián)系。但ROS的發(fā)生與RSV導(dǎo)致HL-60細(xì)胞死亡有聯(lián)系，本研究經(jīng)遏制ROS的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡未得到科學(xué)抑制[2]。按此推測，除過ROS將線粒體死亡通路激活外，需與另外路徑相結(jié)合加入RSV抗腫瘤效用。因此，本研究需結(jié)合蛋白組方式分析RSV處理HL-60細(xì)胞所有磷酸化蛋白質(zhì)干擾，初步掌握RSV誘導(dǎo)入HL- 60細(xì)胞凋亡的其他理念。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

材料：人造幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞株。

儀器和試劑：雙向電泳裂解液、水化液，樣品混合器、離心機(jī)、垂直電泳儀、TPG預(yù)制膠條、脫色搖床。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞裂解

備好量皿處在對數(shù)生長階段的HL-60細(xì)胞，一皿細(xì)胞中添加白藜蘆醇，確保期RSV最終濃度100mol/L，另外一名細(xì)胞用于參照。經(jīng)12h的培養(yǎng)對細(xì)胞進(jìn)行收集，取離心管置入細(xì)胞懸液，以500g/min速度離心10min后，將上清液去除，后取冷PBS清洗細(xì)胞3次，500g/min，離心10min，放棄上清液。取離心管重新離心，500g/min，共2min，離心后充分吸收液體，一同稱取細(xì)胞與管，掌握所收到的細(xì)胞質(zhì)量。將收集的細(xì)胞置入-80℃冰箱冰凍保存>2h。從冰箱中取出細(xì)胞后，等細(xì)胞的溫度恢復(fù)后細(xì)胞重懸用緩沖液完成，約30L/mg，按照細(xì)胞質(zhì)量，找尋緩沖液A體積，等細(xì)胞均勻后，上下?lián)u晃懸液20次。在4℃環(huán)境下孵育細(xì)胞懸液10min，每分鐘顛倒離心管1次，10min后將其1.5mL轉(zhuǎn)移到至EP管。10000g/min離心20min，確保無溶解溶質(zhì)的沉淀。

1.2.2 親和層析柱分離富集磷酸化蛋白質(zhì)

在干凈的管中轉(zhuǎn)移上清液，此上清液即總蛋白；分出部分蛋白樣品測定蛋白濃度，另一部分用于提取磷酸化蛋白。提前在室溫處置放親和柱。將親和柱上下帽取下，排除儲存液。用蒸餾水清洗柱子，利用緩沖液保持平衡，知道流出液體的PH數(shù)值<6.0。叩上底帽。取蛋白樣品上柱，蛋白樣品總量控制在4mg-8mg，每次<5mL。蓋好頂帽，柱子置于4℃搖床上輕度晃動20min。豎直置放5min；輕輕打開親和柱底帽、頂帽。收集后-20℃保存。用緩沖液A對柱子進(jìn)行清洗，5mL/次，添加1mL緩沖液B對柱子清洗，4℃采集洗脫液，這種洗脫液即是磷酸化蛋白。用緩沖液B抽工夫?qū)χ舆M(jìn)行清洗，收集洗脫液。

1.2.3 蛋白樣品除鹽

因其所采集的磷酸化蛋白通常濃度低下，我們用超濾法將蛋白濃縮，有效提高蛋白濃度、脫鹽作用。部分獲得的磷酸化蛋白在超濾管中田間，按7000g/min，低溫迅速離心40min，完成離心后，添加適當(dāng)?shù)牧呀馊芤簩⒌鞍兹芙?，待蛋白溶液溶解后將其轉(zhuǎn)到干凈的EP管，取適量樣品BCA對蛋白濃度進(jìn)行測定。

1.2.4 雙向電泳與質(zhì)譜測定

水化：室溫溶解一定劑量的水化液后，添加4LDTT，2L，Pharmalyte3-10,混合均勻。預(yù)測樣品蛋白濃度后，選50L樣品，用均勻的水化液體補(bǔ)充在125L。結(jié)合膠條長度，順?biāo)P槽線添加樣品。消除預(yù)制的IPG膠條保護(hù)層，膠面向下放置在水化盤樣品溶液中，預(yù)防氣泡的出現(xiàn)，接著覆蓋礦物油3mL。

第一向等電聚焦：膠條水化時間達(dá)16h后，轉(zhuǎn)移至聚焦盤，聚焦盤正極正對聚焦盤。為保障膠條親密接觸電極，7cm膠條取干凈濾紙為鹽橋在兩極放置，膠條膠面向下搭于鹽橋，蓋上礦物油3mL，與正負(fù)極對應(yīng)，蓋好蓋子。7cm的膠條等電聚焦程序是：100V5min；500V1h：1000V1h；8000V、55000V數(shù)小時；2000V24h；設(shè)置溫度18-20℃。

第二向SDS-PAGE電泳：膠條被聚集后，合理使用平衡緩沖液平衡。接著取膠條在SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上置放，加入熔點低的瓊脂糖封膠液，待其全部凝固后執(zhí)行SDS-PAGE電泳。結(jié)束電泳后銀染，經(jīng)掃描分析，分析切2倍以上差異點質(zhì)譜。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)觀察雙向電泳分離磷酸化蛋白質(zhì)。(2)觀察鑒定分析差異蛋白點質(zhì)譜。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳分離磷酸化蛋白質(zhì)

此實驗用雙向電泳技術(shù)，結(jié)合蛋白質(zhì)等電點、相對分子質(zhì)量不同，對照組HL-60細(xì)胞、100mol/LRSV、12h干預(yù)的HL-60細(xì)胞獲取磷酸化蛋白開展雙向電泳，經(jīng)一向等電聚焦、二向SDS-PAGE后，分離各蛋白點。銀染凝膠后使用掃描儀進(jìn)行檢查。用PDQuest雙向電泳軟件分析獲取表達(dá)蛋白不同，取得兩組蛋白點數(shù)240個、190個，表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點數(shù)達(dá)13個，將其標(biāo)注出來，選擇部分放大。

2.2 鑒定分析差異蛋白點質(zhì)譜

從蛋白質(zhì)水平來看，蛋白質(zhì)組學(xué)可為細(xì)胞提供正常、非正常環(huán)節(jié)細(xì)胞于生理上的發(fā)展與路徑。經(jīng)用2-DE與質(zhì)譜技術(shù)在其所檢測的HL-60細(xì)胞中磷酸化蛋白，取PDQuest雙向電泳軟件分析表達(dá)蛋白的不同。經(jīng)放大部分差異點，取部分分辨清晰的差異點經(jīng)酶切，質(zhì)譜判斷部分蛋白質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫對NCBI蛋白質(zhì)的主要作用進(jìn)行搜索，見表1。

表1 判斷雙向電泳后質(zhì)譜測定兩組差異磷酸化蛋白功能與名稱

3 討論

人急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60是通過分離患此病的患者外周建立，會自行發(fā)生分化，還可用丁酸鹽、視黃酸刺激等實現(xiàn)分化。PMA在受到刺激后會分泌TNF-α[3]。該細(xì)胞會對活性造成吞噬，引起趨化反應(yīng)。癌基因myc呈陽性，所呈現(xiàn)的受體為補(bǔ)體、FcR。 血管平滑肌細(xì)胞的再生能力是原發(fā)血管病變的重要因素，表達(dá)鈣通道及ICAM-1和VCAM-1，參與血管壁的炎癥反應(yīng)，與血管疾病的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)[4]。其基本特征是：肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色。細(xì)胞分化前主要表現(xiàn)是生長阻滯，分裂能力降低。所以，分化誘導(dǎo)很多能夠?qū)?xì)胞生長進(jìn)行抑制[5]。培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇時取出液氮罐凍存管，及時存放在37℃下水浴，不斷搖晃，使其迅速融化。取出溶解好的細(xì)胞凍存管，使用酒精消毒后打開，吸收含有細(xì)胞的凍存液，添加提前準(zhǔn)備的培養(yǎng)液，離心、預(yù)熱，吹打均勻，1000rpm 5min，去掉上清，添加適量培育液，吹達(dá)為細(xì)胞懸液，按1*105/ml密度在25cm2培養(yǎng)瓶實施接種，在37℃、5%co2環(huán)境下培養(yǎng)。

蛋白質(zhì)在人體中可執(zhí)行各種生命活動，生命活動期間，各類活動變化最終均會出現(xiàn)蛋白質(zhì)水平改變。蛋白質(zhì)組學(xué)在各技術(shù)手段中的開展，主要包含2-DE，是從整體出發(fā)對細(xì)胞中蛋白質(zhì)構(gòu)成部分進(jìn)行研究，掌握蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系，呈現(xiàn)蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，展現(xiàn)蛋白質(zhì)功能[6]。最近幾年，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到發(fā)展迅速，其中具備差異的蛋白質(zhì)組學(xué)為當(dāng)前這方面研究中可行的路徑，雙向電泳為蛋白質(zhì)組學(xué)的要點，是唯一分離蛋白質(zhì)是的技術(shù)，不僅檢測方法簡單，且快速，具有較高分辨率，重復(fù)性好[7]。

本研究中，現(xiàn)用2-DE與對應(yīng)的PDQuest軟件，對對照組HL-60細(xì)胞、100mol/L處理12h后HL-60細(xì)胞提取磷酸呼哈蛋白點比較，取得兩組蛋白點數(shù)240個、190個，10個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點。選擇分辨清晰的差一點經(jīng)酶切，對部分蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，通過數(shù)據(jù)庫搜索NCBI蛋白質(zhì)的功能[8]。一是核磷蛋白(nuclephosmin)屬于核蛋白，表達(dá)甚廣，在胞漿、細(xì)胞核間穿梭，生物學(xué)功能豐富，操作控制中心體折疊，其功能十分重要。內(nèi)網(wǎng)中包含ER-60蛋白酶，降解保守蛋白后，會使半胱氨酸蛋白酶有活性；帶負(fù)電荷硫脂類可對ER-60蛋白酶造成抑制[9]。ER-60與蛋白質(zhì)折疊息息相關(guān)，CCT2是蛋白中存在TCPl，亞基2，在細(xì)胞質(zhì)中分布，加入蛋白折疊功能，經(jīng)對蛋白質(zhì)功能觀察發(fā)現(xiàn)二者均和蛋白質(zhì)的折疊有關(guān)系。ER中，伴侶分子輔助的多肽折疊、修飾促使蛋白成熟并發(fā)生變化。ER內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，科學(xué)調(diào)節(jié)信號，決定著折疊的正確性[10]。產(chǎn)生刺激導(dǎo)致ER折疊削弱蛋白能力時，應(yīng)激信號會通過ER膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，提高靶基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯水平降低，激活保守度高且未出現(xiàn)折疊蛋白反應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路。UPR經(jīng)對普通蛋白合成抑制，調(diào)高ER殘余的蛋白，對另外通路成分進(jìn)行調(diào)節(jié)，保障ER蛋白效率折疊。UPR經(jīng)對普通蛋白合成的遏制，上調(diào)殘存伴侶蛋白，保障ER蛋白充分折疊[11-12]。但若刺激無法減輕，UPR會引起死亡。激活URP信號后會轉(zhuǎn)化成UPR受體，引起Chop/GADD153活化，若其表達(dá)較高時，會影響ER蛋白折疊功能，暫停細(xì)胞周期，損傷DNA，最終使細(xì)胞凋亡。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)功能復(fù)雜，信號折疊路徑為白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制鋪設(shè)新道路。經(jīng)雙向電泳會發(fā)現(xiàn)差異蛋白，如：抑制素就具有顯著的表達(dá)差異，其死亡與誘導(dǎo)有一定關(guān)系，這為將來白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡機(jī)制奠定基礎(chǔ)。