徐思遠，壽佳，吳強

增強子eRNA對原鈣粘蛋白基因簇的表達調(diào)控

徐思遠，壽佳，吳強

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，上海 200240

遠端增強子對關(guān)鍵靶基因的表達調(diào)控通?？梢詻Q定細胞的命運和功能，激活的增強子可以雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長非編碼(long noncoding)增強子RNA (enhancer RNA, eRNA)調(diào)控靶基因表達，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)增強子eRNA能夠通過形成R環(huán)(R-loop)來促進增強子與靶基因的染色質(zhì)遠距離互作，引起局部三維基因組TAD (topologically associated domain)的改變。為了進一步探究eRNA在基因轉(zhuǎn)錄過程中的生物學(xué)功能，本研究選取原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇的增強子eRNA(eRNA associated with R-loop formation)作為研究對象，通過CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA片段編輯技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等遺傳學(xué)和分子生物學(xué)實驗，揭示了增強子eRNA對基因簇表達的促進作用。首先，本研究通過分析不同組織中增強子eRNA發(fā)現(xiàn)其表達具有組織特異性；其次，通過CRISPR誘導(dǎo)增強子內(nèi)CTCF結(jié)合位點的反轉(zhuǎn)或缺失會造成增強子eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低至2%～10%，同時基因簇的轉(zhuǎn)錄水平也會降低至原來的13%～68%；最后，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點或反轉(zhuǎn)eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點后，基因簇的轉(zhuǎn)錄水平下降了約60%或40%，表明增強子eRNA在調(diào)控基因表達中發(fā)揮重要作用。以上研究結(jié)果進一步證實了增強子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以調(diào)控基因簇的表達，為后續(xù)研究原鈣粘蛋白基因簇在大腦中的表達調(diào)控機制提供了新的思路或方向。

增強子eRNA；簇狀原鈣粘蛋白；eRNA；基因表達；基因調(diào)控

多細胞生物中各種細胞類型的分化需要在發(fā)育過程中建立特定的基因表達模式。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要由增強子完成，增強子是包含多種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)結(jié)合位點的DNA調(diào)控元件[1～3]。增強子最早發(fā)現(xiàn)于1981年，猿猴空泡病毒40 (simian virus 40, SV40)的重復(fù)序列能夠通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以不依賴自身序列方向的方式增強β珠蛋白基因的表達[4]。在之后的研究中，常將候選增強子與報告基因序列克隆到表達質(zhì)粒中，通過檢測報告基因活性和熒光強度，鑒定增強子元件的功能[5]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，染色質(zhì)免疫沉淀與高通量測序結(jié)合(chromatin immunoprecipitation high-throughput sequencing, ChIP–seq)的實驗方法得到廣泛應(yīng)用，該方法通過特定的組蛋白修飾和表觀遺傳學(xué)標記識別候選增強子[6]。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因編輯系統(tǒng)也可用于增強子的鑒定，對目標序列進行突變或刪除，有助于篩選出潛在的調(diào)控元件[7]。但是這種方法會引起內(nèi)源DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)，促發(fā)細胞的雙鏈斷裂修復(fù)機制，針對這種情況，研究者將失活后的Cas9蛋白(dead Cas9, dCas9)與抑制或者激活因子偶聯(lián)靶向至增強子處，通過檢測相鄰基因的表達水平來識別增強子[8,9]。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況的不同，增強子可分為沉默增強子和活性增強子[10,11]，活性增強子在激活靶基因時會募集大量轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶II (RNA polymerase II, RNAPII)和表觀遺傳修飾酶，使自身處于開放狀態(tài)[12]。使用氯化鉀激活培養(yǎng)的神經(jīng)細胞后，在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量由刺激激活的增強子，這些增強子通過結(jié)合CBP招募RNAPII，在增強子區(qū)域雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生增強子RNA (enhancer RNA, eRNA)[12]。增強子eRNA由活性增強子產(chǎn)生，大類上屬于長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。增強子eRNA通常雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，是長度相對較短、豐度相對較低、易被RNA外切體(RNA exosome)降解的轉(zhuǎn)錄本[13～16]。增強子的轉(zhuǎn)錄是否發(fā)揮特定的生物學(xué)功能對研究增強子性質(zhì)和基因調(diào)控具有重要意義[14]。早期的研究認為增強子的轉(zhuǎn)錄本是副產(chǎn)物，增強子僅起到募集轉(zhuǎn)錄因子的作用[17]。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明eRNA在調(diào)控基因表達方面具有重要功能。增強子eRNA可能與Mediator蛋白復(fù)合物相互作用，促進基因轉(zhuǎn)錄[18,19]；增強子eRNA可能與CTCF或黏連蛋白(cohesin)相互作用幫助建立穩(wěn)定的增強子–啟動子環(huán)[20,21]；增強子eRNA可能招募組蛋白修飾酶來改變增強子區(qū)組蛋白甲基化或乙?；絒22,23]?；蚪M上不同的活性增強子通?？赊D(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA，但關(guān)注eRNA自身生物學(xué)功能的研究較少。

大腦能夠通過軸突–樹突間的突觸連接形成特定的神經(jīng)元回路，復(fù)雜神經(jīng)元回路的組裝需要細胞表面特定的分子標簽，近60個簇狀原鈣粘蛋白(clustered protocadherin, c)基因賦予了細胞表面分子標簽的多樣性[24,25]。人類c基因位于5號染色體上，由53個串聯(lián)排列的基因組成，形成3個緊密相連的原鈣粘蛋白(,,)基因簇[26]?；虼匕勺儏^(qū)和恒定區(qū)，由15個高度相似的基因組成，可變區(qū)外顯子包括13個隨機表達型外顯子(-)和2個C型外顯子(-)，位于可變區(qū)下游的恒定區(qū)包含3個外顯子。每個可變區(qū)外顯子通過順式剪接與下游的3個恒定區(qū)外顯子相連形成成熟的原鈣粘蛋白mRNA (圖1A)[27,28]。在基因簇下游存在2個超敏位點(hypersensitive site, HS)增強子元件，分別被命名為和[29]。增強子主要調(diào)控后半部基因表達(除)，增強子全局調(diào)控基因簇表達[30]。CTCF(CCCTC-binding factor)作為染色質(zhì)架構(gòu)蛋白在基因簇的表達中發(fā)揮重要作用，每個隨機表達型外顯子區(qū)域存在2個正向CTCF結(jié)合位點(CTCF binding site, CBS)[31～33]。在cohesin的協(xié)助下，外顯子區(qū)域內(nèi)正向的CBS與增強子內(nèi)存在的2個反向的CBS元件(CBSa和CBSb)發(fā)生遠距離染色質(zhì)相互作用，促進基因表達[31,32,34]。當增強子內(nèi)的CBS元件反轉(zhuǎn)后，增強子與啟動子間的遠距離染色質(zhì)相互作用減少，造成基因簇的表達水平顯著下降[34～36]。RFX5、REST/NRSF等轉(zhuǎn)錄抑制因子在增強子處的結(jié)合會減弱增強子–啟動子之間的遠距離染色質(zhì)相互作用[37,38]。另外，每個可變區(qū)外顯子附近會反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長非編碼lncRNA，這種轉(zhuǎn)錄活動引起基因啟動子區(qū)DNA去甲基化，促進CTCF結(jié)合[39]。最近的研究發(fā)現(xiàn)遠端調(diào)控元件增強子主要反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA，并且在原位形成R環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因簇的選擇性表達[40]。

本研究進一步探究活性增強子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物eRNA在調(diào)控基因簇表達中發(fā)揮的生物學(xué)功能。本課題組最近的研究揭示了增強子元件的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)增強子主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反向的eRNA[40]。然而增強子eRNA的正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否具有功能，以及eRNA轉(zhuǎn)錄方向的改變是否會影響基因簇的表達還不清楚。本研究在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對增強子eRNA進行研究。首先，對增強子eRNA進行了組織特異性分析。其次，對本實驗室之前構(gòu)建的增強子CBS元件刪除或反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株的eRNA和基因簇的表達情況進行定量分析；最后，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)[41～44]在HEC-1-B細胞中構(gòu)建增強子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點刪除和反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株，檢測其eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果為后續(xù)研究基因簇的表達調(diào)控機制和eRNA的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人類子宮內(nèi)膜瘤細胞系HEC-1-B從中科院上海細胞庫采購；構(gòu)建sgRNA所用質(zhì)粒pGL3-U6- Puromycin來源于上?？萍即髮W(xué)黃行許教授實驗室，表達Cas9所用質(zhì)粒pcDNA3.1-WT來源于北京大學(xué)席建忠教授實驗室；高保真Phanta PCR擴增酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采購自南京諾唯贊生物科技有限公司；實時熒光定量工具酶采購自瑞士Roche公司；限制性內(nèi)切酶I、T4 DNA連接酶采購自美國NEB公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒采購自德國Qiagen公司，質(zhì)粒小抽試劑盒采購自美國AXYGEN公司；細胞培養(yǎng)所用MEM培養(yǎng)基采購自美國Hyclone公司；胎牛血清采購自中國Excell Bio公司；10×PBS緩沖液和胰蛋白酶采購自美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)所用青霉素–鏈霉素雙抗、丙酮酸納和谷氨酰胺，轉(zhuǎn)染所用Lipofectamine 3000采購自美國Thermo公司；無水乙醇采購自國藥集團；異丙醇、三氯甲烷采購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；RNA提取液TRIzol Reagent采購自美國Invitrogen公司；嘌呤霉素、氯化鈉和SDS采購自美國Sigma公司；配制LB培養(yǎng)基所需胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂采購自英國的OXOID公司；克隆載體采購自北京擎科生物科技有限公司；本研究所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

合成實驗所需sgRNA單鏈(表1)，用ddH2O將引物濃度稀釋至20 μmol/L備用。配制如下反應(yīng)體系(總體積為20 μL)用于引物退火：2 μL 20 μmol/L sgRNA-F，2 μL 20 μmol/L sgRNA-R，2 μL 10× NEB buffer 2，14 μL ddH2O。用移液器吹打混勻后置于95℃水浴鍋中5 min，關(guān)閉電源，蓋上蓋子冷卻至室溫，反應(yīng)結(jié)束后短暫離心收集液體。

用限制性內(nèi)切酶I將環(huán)形質(zhì)粒pGL3-U6- Puromycin切開，切膠回收線性化載體。純化后進行連接反應(yīng)，用大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化。次日挑取數(shù)個克隆進行搖菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒，并送擎科生物上海公司進行一代測序。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEC-1-B細胞系的MEM完全培養(yǎng)基配方為87% MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素–鏈霉素雙抗、1%丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺。所有細胞均培養(yǎng)在37℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

待6孔板細胞密度達到50%～60%時，用Lipofectamine 3000進行細胞轉(zhuǎn)染。離心管中加入Lipo3000和MEM培養(yǎng)基，另外一個管中加入Cas9質(zhì)粒，sgRNA質(zhì)粒，p3000和MEM培養(yǎng)基。將液體吹打混勻，并轉(zhuǎn)移至一個離心管中，室溫孵育10 min后滴入到6孔板中，細胞放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 單克隆細胞株篩選

轉(zhuǎn)染2天后，換用含有2 μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基進行4天的藥物篩選，之后用正常培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)2天。取部分細胞裂解其基因組，通過PCR擴增鑒定該混合物基因型，若混合物中含有目的片段刪除的細胞，則對剩余細胞進行單克隆化鋪板。在37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后，在倒置顯微鏡下對含有單個細胞團的孔進行標記，再培養(yǎng)1周后，對所有單克隆細胞株進行基因型鑒定。

用胰酶對細胞進行消化，通過堿裂解法裂解單克隆細胞基因組，進行PCR擴增。反應(yīng)體系(總體積為20 μL)如下：10 μL 2 × Taq Mix，0.5 μL 10 μmol/L正向引物，0.5 μL 10 μmol/L反向引物，2 μL基因組模板，7 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)；最終延伸5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳確定單克隆基因型，將陽性克隆的PCR產(chǎn)物進行送測。若測序結(jié)果為雙峰，則將PCR產(chǎn)物純化后通過TA克隆的方式鑒定單克隆細胞株的基因型。將PCR產(chǎn)物與克隆載體在室溫條件下孵育5 min后，加入50 μL感受態(tài)細胞，冰上冷卻30 min后進行熱激，加入500 μL無抗LB進行搖菌，37℃恒溫搖床培養(yǎng)1 h。離心后將菌液涂在含有氨芐抗性的平板上，過夜倒置培養(yǎng)。次日挑取10個單菌落進行搖菌，抽提質(zhì)粒后送擎科生物公司進行一代測序。鑒定單克隆基因型所用引物見表1。

表1 引物序列

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR

待6孔板細胞達到90%密度時，棄盡細胞表面培養(yǎng)基。每個孔加入500 μL TRIzol消化細胞，并提取細胞總RNA。隨后使用南京諾唯贊公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄實驗。取1 μg總RNA，加入1 μL鏈特異性引物，用ddH2O補至12 μL，在PCR儀上65℃反應(yīng)5 min將RNA模板變性，之后立即冰上冷卻2 min；加入4×gDNA wiper Mix去除基因組DNA，42℃反應(yīng)2 min；加入10×RT Mix和HiScript II Enzyme Mix各2 μL，經(jīng)25℃ 5 min、50℃ 45 min、80℃ 2 min反應(yīng)后得到cDNA文庫。

將模板用ddH2O稀釋至50 μL，配制熒光定量PCR反應(yīng)體系。在PCR中依次加入以下溶液(總體積為10 μL)：5 μL SYBR Green，0.3 μL 5μmol/L正反向引物混合物，2 μL cDNA模板，2.7 μL ddH2O，在熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)。以作為內(nèi)參基因，采用2–ΔΔCt的方式計算基因相對表達量。熒光定量PCR所用引物見表1。

1.6 HS5-1增強子eRNA組織特異性分析

從ENCODE數(shù)據(jù)庫中下載人類HEK293細胞[45]和小鼠腎臟組織[46]的啟動子活性標記H3K4me3、增強子活性標記H3K27ac和染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF的ChIP-seq實驗數(shù)據(jù)，并將其導(dǎo)入至UCSC瀏覽器中進行分析。將人類和小鼠基因簇的增強子區(qū)域進行放大，人類HEK293細胞的參考基因組為hg19，小鼠腎臟組織的參考基因組為mm10。FANTOM5數(shù)據(jù)庫的CAGE數(shù)據(jù)[11]代表增強子eRNA的潛在轉(zhuǎn)錄起始位點，藍色表示反向轉(zhuǎn)錄起始位點，紅色表示正向轉(zhuǎn)錄起始位點。同時與之前發(fā)表的人類HEC-1-B細胞和小鼠大腦皮層組織的相關(guān)數(shù)據(jù)進行對照[40]，以此揭示增強子eRNA的組織特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原鈣粘蛋白α基因簇HS5-1增強子eRNA表達具有組織特異性

增強子eRNA是由激活的增強子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，通常位于染色質(zhì)開放區(qū)域，大量的轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子會結(jié)合在增強子上，其周圍的核小體也會發(fā)生相應(yīng)的修飾[16]。全基因組分析表明，哺乳動物中的活性增強子雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的eRNA一般具有組織特異性[11]。本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)在人類HEC-1-B細胞和小鼠大腦皮層組織中的增強子是活性增強子，在eRNA轉(zhuǎn)錄的區(qū)域富集了RNAP II、H3K4me3、H3K27ac、CTCF和Rad21等信號，能夠激活基因簇的表達[40]。為了進一步驗證增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄特征，本研究分析了人類HEK293細胞[45]和小鼠腎臟組織[46]的增強子eRNA表達譜。在HEK293細胞中，盡管增強子處有CTCF結(jié)合可以使增強子與啟動子的空間距離相互靠近，但ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示增強子處的染色質(zhì)組蛋白上沒有發(fā)生甲基化和乙?；揎?，推測該細胞系中增強子并未發(fā)生活化，也沒有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA (圖1B)，這與文獻中報道的eRNA的定量結(jié)果相一致[40]。和人類HEK293細胞類似，小鼠腎臟組織中增強子也并未活化(圖1C)，這與最近的一篇文章中揭示的小鼠腎臟組織的RNA-seq實驗結(jié)果相一致，數(shù)據(jù)顯示整個基因簇基因幾乎不表達[39]。這些eRNA的轉(zhuǎn)錄特征分析表明增強子的轉(zhuǎn)錄具有組織特異性。

2.2 HS5-1增強子CTCF位點方向改變導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低

本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)基因簇中的增強子eRNA通過在原位形成R環(huán)的方式介導(dǎo)增強子與基因簇啟動子間的遠距離染色質(zhì)相互作用，進而激活基因簇的表達[40]。R環(huán)是指在轉(zhuǎn)錄過程中，新生的RNA鏈與DNA鏈進行堿基互補配對導(dǎo)致另一條單鏈DNA被置換，產(chǎn)生一種含有RNA-DNA雜合體的三鏈結(jié)構(gòu)，這種R環(huán)結(jié)構(gòu)在基因的表達調(diào)控和DNA修復(fù)中發(fā)揮了重要的功能[47,48]。本文利用熒光定量PCR對之前構(gòu)建的增強子CBSa、CBSb位點基因編輯的細胞克隆與野生型細胞的和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析。結(jié)果表明，在增強子CBS元件反轉(zhuǎn)的細胞株中，增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低至野生型克隆的5%，基因簇的轉(zhuǎn)錄水平下降至野生型克隆的15% (圖2，A和B)。在增強子CBS元件一條等位基因反轉(zhuǎn)、一條等位基因缺失的雜合子細胞株中，增強子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平都顯著降低(圖2，C和D)，這表明CBS元件方向的改變會引起和基因簇的表達異常。在這兩種情況中，增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄方向發(fā)生原位反轉(zhuǎn)破壞了原本的eRNA序列，由于R環(huán)傾向于在轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域形成，因此可能破壞了R環(huán)結(jié)構(gòu)的方向性，導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄水平降低。同時的轉(zhuǎn)錄方向在三維空間折疊后不再與基因簇的轉(zhuǎn)錄方向相同，由CBS元件介導(dǎo)的增強子–啟動子環(huán)也被破壞，導(dǎo)致基因簇的表達下降。此外，這兩種情況相比較，第一種單克隆細胞株中的和基因簇的表達受到的影響更大。在增強子CBSa位點反轉(zhuǎn)的雜合子細胞株中，增強子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平分別下降90%和40% (圖2，E和F)。在該細胞株中，CBSa位點方向的改變并不影響的長度，但是在一定程度上改變了的轉(zhuǎn)錄本序列，因此推測序列本身在調(diào)控基因簇的表達中發(fā)揮重要作用。雖然CBSa位點的原位反轉(zhuǎn)沒有破壞的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，但這一反轉(zhuǎn)不僅改變了CBSa位點自身的方向，導(dǎo)致增強子與啟動子間的相互作用減弱；而且導(dǎo)致增強子內(nèi)部的部分序列發(fā)生改變，這一改變可能破壞了增強子內(nèi)原本的R環(huán)結(jié)構(gòu)。這個結(jié)果表明CBSa元件方向的改變會引起的異常轉(zhuǎn)錄。在增強子CBSb位點刪除的純合子細胞株中，增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄水平并沒有發(fā)生明顯變化(圖2，G和H)。由于的轉(zhuǎn)錄起始位點位于兩個CBS元件之間，因此對CBSb位點進行基因編輯沒有破壞的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和其序列本身。這個結(jié)果表明增強子CBSb元件作為基因簇的邊界，它的缺失不會引起異常轉(zhuǎn)錄，但其刪除后會破環(huán)TAD的邊界，引起基因簇的表達降低(圖2，G和H)。總之，增強子內(nèi)CTCF結(jié)合位點方向的改變或缺失會引起eRNA的異常轉(zhuǎn)錄，同時影響基因簇的表達。

圖1 原鈣粘蛋白α基因簇HS5-1 eRNA的組織特異性分析

A：人類原鈣粘蛋白基因簇()示意圖。人類基因簇由15個可變區(qū)外顯子和3個恒定區(qū)外顯子組成，15個可變區(qū)外顯子包括13個隨機表達型外顯子和2個C型外顯子。每個基因的可變區(qū)外顯子都攜帶自己的啟動子，通過順式剪接與下游3個恒定區(qū)外顯子相連。B：ENCODE數(shù)據(jù)庫中[45]人類HEK293細胞系中增強子處eRNA的特異性分析。依次為H3K4me3、H3K27ac和CTCF的ChIP-seq結(jié)果(橘色)。C：ENCODE數(shù)據(jù)庫[46]小鼠腎臟組織(紫色)中增強子處eRNA的組織特異性分析。

圖2 HS5-1增強子CTCF位點方向改變導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低

A：增強子CBS反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株基因型示意圖。B：增強子eRNA和基因表達的定量分析。C：增強子CBS編輯后的單克隆細胞株基因型示意圖。D：增強子eRNA和基因表達的定量結(jié)果。E：增強子CBSa反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株基因型示意圖。F：增強子eRNA和基因表達的定量分析。G：增強子CBSb刪除的單克隆細胞株基因型示意圖。H：增強子eRNA和基因表達的定量結(jié)果。NS：沒有顯著性差異；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

2.3 HS5-1增強子eRNA對原鈣粘蛋白α基因簇的激活功能

在此之前，已有的研究利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除了eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點來探究其生物學(xué)功能[40]。為了進一步研究增強子eRNA對基因簇的調(diào)控作用，同時排除CBS元件的影響，根據(jù)FANTOM5數(shù)據(jù)庫揭示的增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點，設(shè)計靶向正反向轉(zhuǎn)錄區(qū)域的成對sgRNA，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除增強子eRNA分子的雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(圖3A)。根據(jù)編輯區(qū)域設(shè)計成對引物對單克隆細胞株的基因型進行鑒定，凝膠電泳結(jié)果和一代測序結(jié)果表明，增強子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點被成功刪除(圖3，B和C)。通過熒光定量PCR實驗對基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析發(fā)現(xiàn)，在缺失eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點后，基因簇的轉(zhuǎn)錄下降了70% (圖3D)。這個結(jié)果進一步說明增強子eRNA的雙向轉(zhuǎn)錄過程甚至是轉(zhuǎn)錄本可以調(diào)控基因簇的表達。此外，CTCF蛋白敲低也造成增強子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(圖3，E和F)。增強子與可變型啟動子間的遠距離染色質(zhì)相互作用不僅需要eRNA的轉(zhuǎn)錄，同時需要CTCF/cohesin等染色質(zhì)架構(gòu)蛋白的參與[40]。CTCF蛋白的減少，導(dǎo)致增強子–啟動子之間的遠距離染色質(zhì)相互作用減弱，染色質(zhì)環(huán)的破壞導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平的下降。

增強子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點的刪除，同時造成了增強子CBSa位點的缺失，由于CBSa位點具有重要的調(diào)控作用，因此基因簇的表達下降可能是由于CBSa位點被破壞所導(dǎo)致的。為了排除CBSa位點的干擾以及探究eRNA轉(zhuǎn)錄方向的改變是否會影響基因簇的表達，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)將的轉(zhuǎn)錄起始位點進行原位反轉(zhuǎn)(圖4A)。通過對單克隆細胞株進行篩選，總共獲得了兩個轉(zhuǎn)錄起始位點反轉(zhuǎn)的雜合子單克隆(圖4，B和C)。熒光定量PCR實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄起始位點反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株中，增強子eRNA自身轉(zhuǎn)錄下降了80%左右；與此同時，其調(diào)控的基因簇的轉(zhuǎn)錄水平降至原來的一半(圖4D)。轉(zhuǎn)錄起始位點的反轉(zhuǎn)不僅改變了自身的轉(zhuǎn)錄方向，同時也破壞了其與基因簇轉(zhuǎn)錄方向的協(xié)同性。此外，轉(zhuǎn)錄方向的變化使得原本轉(zhuǎn)錄出的RNA序列隨之改變，由于共轉(zhuǎn)錄R環(huán)主要在啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點處形成，序列本身的改變會動搖、甚至是破壞R環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因簇周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。原本由形成的R環(huán)結(jié)構(gòu)所介導(dǎo)的增強子–啟動子之間的遠距離染色質(zhì)相互作用也被破壞，導(dǎo)致基因簇的表達下調(diào)。這些結(jié)果表明原位反轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點方向會影響基因簇的表達。

圖3 使用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除HS5-1增強子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點

A：敲除增強子eRNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)所用sgRNAs及單克隆基因型鑒定所用引物示意圖。B：單克隆細胞株基因型鑒定凝膠電泳圖。以野生型細胞作為對照，F(xiàn)1和R1的目的產(chǎn)物片段為1798 bp，刪除轉(zhuǎn)錄起始區(qū)后產(chǎn)物片段為1079 bp，F(xiàn)1和R2的目的產(chǎn)物片段為826 bp。C：單克隆細胞株基因型鑒定一代測序圖。紅色堿基為PAM位點，紅色箭頭表示Cas9切割位點；粉色框內(nèi)為上游接口處堿基，黃色框內(nèi)為下游接口處堿基。D：野生型克隆、增強子eRNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域刪除的單克隆細胞株中基因表達的定量分析。E：敲低CTCF后的蛋白質(zhì)免疫印記。F：CTCF敲低后的增強子eRNA和基因表達的定量分析。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點；WT：野生型；KD：敲低。**：<0.01；***：<0.001。

圖4 使用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)反轉(zhuǎn)HS5-1增強子eRNA PEARL的轉(zhuǎn)錄起始位點

A：反轉(zhuǎn)eRNA轉(zhuǎn)錄起始位點所用sgRNAs及單克隆基因型鑒定所用引物示意圖。B：單克隆細胞株基因型鑒定凝膠電泳圖。以野生型細胞作為對照，F(xiàn)1和R1的目的產(chǎn)物片段為1798 bp，雜合子中一條等位基因目的產(chǎn)物片段為1504 bp，F(xiàn)1和F2的目的產(chǎn)物片段為921 bp。C：單克隆細胞株基因型鑒定一代測序圖。紅色堿基為PAM位點，紅色箭頭表示Cas9切割位點；藍色框內(nèi)為上游接口處堿基，綠色框內(nèi)為反轉(zhuǎn)序列，黃色框內(nèi)為下游接口處堿基。D：野生型克隆、轉(zhuǎn)錄起始位點反轉(zhuǎn)的單克隆細胞株eRNA和基因表達的定量分析。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點；WT：野生型；inv：反轉(zhuǎn)。**：<0.01；***：<0.001。

3 討論

鈣粘蛋白是Ca2+依賴性細胞粘附分子，鈣粘蛋白之間特異的細胞間粘附在組織的形成和維護中發(fā)揮關(guān)鍵作用[49]。原鈣粘蛋白屬非經(jīng)典鈣粘蛋白，在神經(jīng)元間的自身識別和非自身回避、神經(jīng)元存活和遷移、軸突–樹突間的連接等功能中發(fā)揮重要作用，同時在某些神經(jīng)以及精神疾病中，原鈣粘蛋白可以作為疾病診斷的標志物[24,25]。原鈣粘蛋白基因簇下游的遠距離順式調(diào)控元件和在調(diào)控基因簇的表達中發(fā)揮重要功能[29]。此外，原鈣粘蛋白基因的表達需要CTCF/cohesin復(fù)合物介導(dǎo)的增強子–啟動子之間的遠距離染色質(zhì)相互作用[31,32,34]。

增強子eRNA轉(zhuǎn)錄是否具有功能一直是eRNA研究領(lǐng)域的重點問題[14]。最近的研究表明基因簇的增強子內(nèi)主要反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA來激活基因表達(圖5A)[40]。本研究在此基礎(chǔ)上進一步探究增強子eRNA的功能，對本實驗室之前構(gòu)建的增強子CTCF結(jié)合位點編輯的細胞株進行定量分析，發(fā)現(xiàn)CTCF結(jié)合位點方向的改變會引起的異常轉(zhuǎn)錄。由于eRNA的轉(zhuǎn)錄豐度較低，在對其克隆時并未獲取其完整的序列，只得到了一個804 bp的分子序列[40]。增強子CTCF結(jié)合位點反轉(zhuǎn)的細胞株(圖2，A～D)轉(zhuǎn)錄的eRNA分子包括了上游CRISPR/Cas9切割位點，說明將CBS元件反轉(zhuǎn)不僅改變了的轉(zhuǎn)錄方向，而且改變了原本的序列。在增強子CBSa位點反轉(zhuǎn)的細胞株中(圖2，E和F)，由于CBSa位點的序列包含在804 bp的eRNA分子內(nèi)，因此這一反轉(zhuǎn)同樣改變了原本的序列。這兩種情況都可能破壞了原本的R環(huán)結(jié)構(gòu)，造成和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，因此推測的序列具有調(diào)控基因簇基因表達的功能(圖5B)。利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除eRNA的雙向轉(zhuǎn)錄起始位點的實驗表明，增強子的正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同樣具有調(diào)控功能(圖3)。尤其是當只反轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點同樣可以影響基因簇的表達，這一結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄的方向性可能對基因簇具有調(diào)控作用(圖4)。上述兩個實驗利用CRISPR系統(tǒng)編輯eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域，同樣改變原有的轉(zhuǎn)錄本序列，轉(zhuǎn)錄本序列的變化將會影響原本穩(wěn)定的R環(huán)結(jié)構(gòu)(圖5C)。

圖5 增強子eRNA PEARL調(diào)控原鈣粘蛋白α基因簇表達的示意圖

A：在野生型細胞中，增強子eRNA(紫色)在增強子處形成R環(huán)激活基因簇表達。B：使用CRISPR DNA片段編輯系統(tǒng)反轉(zhuǎn)增強子及其兩邊的CTCF位點，不會改變增強子eRNA轉(zhuǎn)錄本的5′端序列(紫色)，但會改變eRNA轉(zhuǎn)錄本的3′端序列(綠色)，因此可能會改變原本的R環(huán)結(jié)構(gòu)，造成基因簇的表達降低。C：反轉(zhuǎn)eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點會完全改變其自身序列(橙色)，增強子內(nèi)的R環(huán)結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，導(dǎo)致基因簇的表達降低。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點。

由于eRNA是由增強子DNA序列轉(zhuǎn)錄的，遺傳學(xué)方法在一定程度上破壞了增強子區(qū)域。因此，在確定eRNA轉(zhuǎn)錄起始位點的前提下，可以通過定點突變的方式研究eRNA的功能。此外，一些輔助激活因子已被證實在調(diào)控eRNA轉(zhuǎn)錄，維持增強子活性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮作用[22,50]，關(guān)于輔助抑制因子的研究也開始逐步開展。例如，以炎癥性巨噬細胞為模型，研究者發(fā)現(xiàn)GPS2和SMRT輔助抑制因子與輔助激活因子CBP和Mediator拮抗調(diào)控增強子活性[51]。輔助抑制因子的結(jié)合可以阻止增強子活化、抑制eRNA的轉(zhuǎn)錄，當輔助抑制因子被敲低后，增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄被重新激活[51]。在基因簇中，增強子CBSb位點附近結(jié)合RFX5、REST/NRSF等轉(zhuǎn)錄抑制因子[37,38]。因此，這些轉(zhuǎn)錄因子可能作為eRNA轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子阻止增強子的轉(zhuǎn)錄，去除這些因子后可能會增加增強子活性。

本研究主要討論了基因簇下游增強子產(chǎn)生的eRNA在基因表達調(diào)控方面發(fā)揮的激活功能，對已經(jīng)報道的增強子eRNA的生物學(xué)功能是一種補充。通過檢測增強子CBS位點編輯的細胞株中eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，以及利用CRISPR系統(tǒng)編輯增強子eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域，發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平下降會導(dǎo)致基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這些結(jié)果表明，增強子eRNA在調(diào)控基因簇的表達中發(fā)揮重要作用，為進一步理解eRNA的生物學(xué)功能提供幫助。

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Additional evidence ofenhancer eRNAfor protocadherin alpha gene regulation

Siyuan Xu, Jia Shou, Qiang Wu

The regulation of target genes by distal enhancers usually determines the fate and function of cells. Active enhancers in specific regions of chromatin may transcribe bidirectionally to produce long non-coding enhancer RNA (eRNA) to regulate gene expression. We recently found that an antisense enhancer eRNA(eRNA associated with R-loop formation) regulates gene expression of members of theclusterR-loop formation. To further explore the biological function of eRNA, we performed additional genetic and molecular experiments such as CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA-fragment editing, RT-PCR, and qPCR. First, we performed expression analyses of theeRNAand found that it was expressed in a tissue-specific manner. In addition, upon CRISPR DNA-fragment deletion or inversion of the CTCF sites in theenhancer region, the expressionof eRNAwas reduced to 2%–10% and the expressionofgene cluster was also reduced to 13%–68% of the original levels. Finally, deletion of the bidirectional transcription start site (TSS) ofeRNA or inversion of TSS of the eRNAresulted in approximately 60% or 40% decrease of levels ofgene expression. In summary, these data suggested a functional role of theeRNA in gene regulation of thecluster, providing a new direction for future researches on the regulatory mechanisms of clusteredgene expression in the brain.

enhancer RNA; clustered protocadherin; eRNA; gene expression; gene regulation

2022-05-15;

2022-06-30;

2022-07-08

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31630039, 91940303)和上海市科學(xué)技術(shù)委員會項目(編號：19JC1412500, 21DZ2210200)資助[Supported by the National Nature Science Foundation of China (Nos. 31630039, 91940303) and the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality Program (Nos. 19JC1412500, 21DZ2210200)]

徐思遠，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: xus1yuan@126.com

吳強，博士，教授，研究方向：三維基因組學(xué)。E-mail: qiangwu@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-160

(責任編委: 單革)