劉晨龍，盧 丹，周泉勇，萬明春，郝曉東，張獻(xiàn)賀，鄭瑞強，季華員*

(1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200； 2.江西省幕村農(nóng)牧科技有限公司，九江 332438；3. 北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 102206； 4. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

群體遺傳多樣性(population genetic diversity)是一個群體內(nèi)基因組差異的表現(xiàn)，是物種進(jìn)化的本質(zhì)。對地方豬進(jìn)行群體遺傳多樣性研究，可以了解該品種的起源、進(jìn)化以及不同品種間的遺傳關(guān)系，對地方豬的保護(hù)及利用具有重要意義。群體的遺傳多樣性能夠使得群體在不斷變化的環(huán)境中適應(yīng)和生存下來，一般來說，個體數(shù)量越多的群體，遺傳多樣性越豐富。在小群體中，由于個體數(shù)量少或者家系少，往往會發(fā)生近親繁殖而導(dǎo)致遺傳漂變(genetic drift)，減少遺傳多樣性。對家畜品種的遺傳多樣性研究有助于個性化制定育種方案，更好的保護(hù)群體遺傳多樣性不丟失。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是一種常見的遺傳多樣性，通過對群體內(nèi)的個體進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的SNP比較分析，可以得到該群體的遺傳多樣性、群體內(nèi)個體間的親緣關(guān)系以及家系結(jié)構(gòu)等?；蛐酒?，又稱cDNA微陣列(microarray)、DNA芯片、寡核苷酸芯片(oligo-chip)，屬于生物芯片的一種?；蚪MSNP芯片是一種最早廣泛應(yīng)用的基因組水平遺傳標(biāo)記基因分型方法。SNP芯片由于具有密度大、覆蓋廣、價格低、數(shù)據(jù)處理方便等優(yōu)點應(yīng)用更為廣泛，在雞、牛、羊、犬和馬等畜禽方面均有使用。目前使用高密度SNP芯片進(jìn)行中國地方豬群體遺傳多樣性的研究較多。在江西地方豬品種研究方面，Wang等通過使用Illumina豬60K SNP芯片掃描，分析發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)花豬和玉山黑豬近年來發(fā)生過近交的情況，而贛西兩頭烏豬具有豐富的遺傳多樣性，且近交個體少；此研究通過構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，東鄉(xiāng)花豬和玉山黑豬都可以劃分為9個家系，而贛西兩頭烏豬可劃分為7個家系。在其他中國地方豬品種研究方面，蔡春波等通過高密度SNP芯片研究了馬身豬保種群的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)等內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)馬身豬保種群遺傳多樣性較豐富，但近交程度高，家系少；黃樹文等則發(fā)現(xiàn)，兩廣小耳花豬、大花白豬和藍(lán)塘豬的遺傳多樣性較低；劉彬等研究了青峪豬保種群體3個世代的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在閉鎖的繼代繁育過程中存在群體遺傳多樣性損失的情況。

中國地方豬品種遺傳資源豐富，部分表型優(yōu)異，但近幾十年來，隨著國外著名商用豬種及配套系的大量涌入，我國地方豬資源受到巨大的沖擊。有的品種已滅絕，一些處于瀕危狀態(tài)的品種群體規(guī)模急劇下降?，F(xiàn)存的地方品種出現(xiàn)了程度不等的遺傳多樣性降低和種質(zhì)退化等現(xiàn)象，我國出現(xiàn)了前所未有的地方豬品種種質(zhì)資源危機。杭豬是江西省地方豬種，是贛西北花豬的代表性品種，具有性成熟早、發(fā)情時間長、繁殖率高、屠宰率高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，但同時存在生長速度慢、瘦肉率低等不足，無法滿足市場需求，導(dǎo)致杭豬數(shù)量急劇減少，開始出現(xiàn)近親繁殖現(xiàn)象。針對目前杭豬保種場的保種群家系結(jié)構(gòu)不清，無法進(jìn)行合理保種等問題，本研究使用“中芯一號”50K SNP芯片對杭豬保種群進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性分析以及家系構(gòu)建，為杭豬品種資源的保護(hù)、選育和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究所用30頭杭豬均于2021年6月采集自江西省幕村農(nóng)牧科技有限公司杭豬保種場，包括4頭 公豬，26頭母豬，所有個體的飼養(yǎng)管理條件一致。采集的耳組織樣品存放在裝有75%酒精的2 mL 凍存管內(nèi)，并放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 耳組織基因組DNA提取與質(zhì)量檢測 本研究使用通用型柱式基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Kit，康為世紀(jì))進(jìn)行杭豬耳組織樣品的基因組DNA提取。提取步驟主要包括：1)將 耳組織剪碎置于1.5 mL離心管中，加入Buffer GTL、Proteinase K后進(jìn)行水浴消化，向消化完全的樣品內(nèi)加入Buffer GL和無水乙醇后震蕩混勻離心，將溶液全部轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，離心棄廢液，向吸附柱中分步加入GW1和GW2并分別離心，棄掉廢液后室溫徹底晾干，最后加入Buffer GE溶解DNA，離心得到DNA溶液；2)將所得的DNA溶液使用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢查DNA的完整性；3)使用NanoDrop 2000測定DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2.2 杭豬“中芯一號”SNP分型 將質(zhì)檢合格的杭豬基因組DNA樣品委托北京康普森生物技術(shù)有限公司使用“中芯一號”芯片進(jìn)行SNP分型。SNP分型試驗流程主要包括：使用NaOH溶液基因組DNA進(jìn)行堿變性、恒溫進(jìn)行全基因組擴增(37 ℃ 孵育20～24 h)、DNA片段化、DNA沉淀和重懸、將重懸的DNA片段加到芯片上進(jìn)行雜交(48 ℃ 孵育16～24 h)、洗掉非特異性結(jié)合的DNA、單堿基延伸染色、數(shù)據(jù)讀取等。

1.2.3 SNP分型結(jié)果質(zhì)量控制 使用Plink(V1.90)軟件對得到的SNP分型結(jié)果按照下述標(biāo)準(zhǔn)篩除不合格的樣本和SNP位點：剔除性染色體上以及未定位染色體的SNPs，剔除檢出率(call rate)小于90%的SNPs，剔除最小等位基因頻率(MAF)小于0.05的SNPs，剔除哈代-溫伯格平衡檢驗值小于10的標(biāo)記。

1.2.4 杭豬保種群體的遺傳多樣性分析 使用Plink(V1.90)軟件對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，包括計算杭豬保種群體的、期望雜合度()、觀察雜合度()、多態(tài)信息含量()，分析杭豬保種群體的遺傳多樣性。

1.2.5 杭豬保種群體的親緣關(guān)系分析 使用Plink(V1.90)軟件中的--homozyg --homozyg-window-snp 50 --homozyg-window-het 1 --homozyg-window-missing 5 --homozyg-kb 500命令對每個個體的連續(xù)性純合片段(runs of homozygosity，ROH)進(jìn)行估算。該命令的含義是進(jìn)行全基因組掃描計算ROH，每個窗口50個SNPs，每個窗口至多一個雜合SNP以及5個錯配SNPs，設(shè)置最短長度為500 kb。計算每個個體的ROH片段總長度與常染色體基因組總長度的比值得到基于ROH的近交系數(shù)()，并使用R軟件(https://www.r-project.org/)繪制小提琴圖。采用Plink(V1.90)構(gòu)建狀態(tài)同源(identity by state，IBS)距離矩陣，采用Gmatrix(V2)軟件構(gòu)建矩陣，分析保種群體個體間的親緣關(guān)系，并使用R軟件繪制IBS距離矩陣和矩陣結(jié)果的熱圖。

1.2.6 杭豬保種群體的家系結(jié)構(gòu)分析 使用Mega X(V10.2)軟件繪制進(jìn)化樹，分析杭豬保種群體中公豬的家系結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 DNA檢測

本研究所提取的DNA樣品濃度均大于100 ng·μL， OD/OD為1.8～2.0，表明提取的DNA濃度和純度均符合要求。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性(圖1)，結(jié)果顯示，DNA條帶清晰，無拖尾，表明提取的DNA樣品質(zhì)量較好，符合試驗要求。

2000M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10. 杭豬基因組DNA樣品2000M. The DNA reference marker; 1-10. The genomic DNA sample of Hang pigs圖1 杭豬基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of Hang pigs genomic DNA

2.2 SNP分型與質(zhì)控

經(jīng)過“中芯一號”SNP芯片分型，30頭杭豬共得到57 466個SNPs標(biāo)記分型結(jié)果，芯片個體檢出率為0.987 4～0.989 3，平均檢出率為0.988 3±0.000 4，通過質(zhì)檢的SNPs數(shù)為34 156，結(jié)果見表1。質(zhì)控前后各常染色體上的SNPs數(shù)見圖2，其中1號染色體篩選掉的SNP數(shù)最多，為2 856個，17號染色體篩選掉的SNP數(shù)最少，為454個。

表1 SNP質(zhì)量控制統(tǒng)計結(jié)果

圖2 質(zhì)控前后常染色體上SNPs數(shù)Fig.2 The SNPs number on autosomes before and after quality control

2.3 杭豬保種群體遺傳多樣性分析

經(jīng)分析，杭豬保種群體MAF介于0.05到0.1的比例最高，為26.66 %，介于0.4到0.5的比例最低，為14.38%，平均MAF為0.228±0.137，結(jié)果見圖3A。SNP位點的多態(tài)信息含量()的范圍是0.090～0.375，平均多態(tài)信息含量為0.255±0.098，多態(tài)信息含量占比見圖3B。杭豬平均觀察雜合度()為0.359±0.181，平均期望雜合度()為0.314±0.140，平均觀察雜合度略高于平均期望雜合度。

A. 最小等位基因頻率占比圖；B. 多態(tài)信息含量占比圖A. The proportion of minor allele frequency; B. The proportion of polymorphism information content圖3 杭豬保種群體遺傳多樣性分析結(jié)果Fig.3 The genetic diversity of Hang pigs conserved population

2.4 杭豬保種群體IBS距離矩陣分析

經(jīng)Plink軟件計算，杭豬保種群體的IBS遺傳距離在0.143 6～0.323 5之間，平均遺傳距離為0.241 7±0.033 6，可視化結(jié)果如圖4所示。其中4頭 公豬(圖4中的GH2、GH3、GH4和GH5)的IBS遺傳距離在0.143 6～0.210 9之間，平均遺傳距離為0.178 3±0.025 5。從圖中可以看出，大部分杭豬個體間的IBS遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系處于中等程度(圖中偏紅的方格)；小部分個體間的IBS遺傳距離較近，親緣關(guān)系較近(圖中偏白以及偏藍(lán)的方格)，表明存在近交風(fēng)險，需強化育種措施。

IBS距離矩陣中每一個小方格代表其所連接的兩個個體之間的遺傳距離值，該值越大越接近紅色，即遺傳距離越遠(yuǎn)，反之亦然Each small square in IBS distance matrix represents the genetic distance value between two connected individuals, the larger the value, the color is closer to red, namely the father the genetic distance is, and vice versa圖4 杭豬保種群體IBS距離矩陣可視化結(jié)果Fig.4 The visualization results of IBS distance matrix of Hang pigs conserved population

2.5 杭豬保種群體G矩陣分析

使用Gmatrix軟件構(gòu)建基因組關(guān)系矩陣，進(jìn)一步分析杭豬保種群體的親緣關(guān)系，可視化結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看到，大部分杭豬個體間親緣關(guān)系程度中等(圖中偏白及偏藍(lán)的方格)，小部分個體間的親緣關(guān)系較近(圖中偏紅的方格)，與IBS距離矩陣結(jié)果一致，表明杭豬保種群體存在近交風(fēng)險。

G矩陣中每一個小方格代表其所連接的兩個個體之間的親緣關(guān)系值，該值越大越接近紅色，即兩個個體的親緣關(guān)系越近，反之亦然Each small square in G matrix represents the genetic relationship value between two connected individuals, the larger the value, the color is closer to red, namely the closer genetics relationship between two samples, and vice versa圖5 杭豬保種群體G矩陣可視化結(jié)果Fig.5 The visualization results of G matrix of Hang pigs conserved population

2.6 杭豬保種群體基于ROH的近交系數(shù)分析

經(jīng)Plink軟件計算，30頭杭豬保種個體共檢測到828個ROHs，單個ROH平均長度為(6.96±9.62)Mb，個體ROH數(shù)量為5～ 80個不等，平均(27.60±19.64)個。個體ROH總長度為(14.14～687.31)Mb，平均(191.95±201.56)Mb，個體間的差異較大，其中ROH總長度在100 Mb以內(nèi)的個體數(shù)量最多，占比50%，而ROH總長度為400～500 Mb的個體數(shù)量為0(圖6)。從染色體上的ROH分布數(shù)量看，1號染色體上的ROH數(shù)量最多，為117個；17號 染色體上的ROH數(shù)量最少，為14個(圖7)。從單個ROH長度數(shù)量分布情況來看，1～10 Mb長度的ROH數(shù)量最多，占總數(shù)量的83.33%，而大于80 Mb 長度的ROH數(shù)量最少，只占總數(shù)量的0.12%(圖8)。通過對每個個體的ROH統(tǒng)計，得到每個個體基于ROH的近交系數(shù)(圖9)，計算結(jié)果表明，杭豬保種群體的平均為0.078±0.082，但4頭公豬中有3頭公豬的大于0.21，另1頭則大于0.10，公豬平均近交系數(shù)為0.219±0.082。由圖9可知，杭豬保種群體整體的近交系數(shù)較小，說明近交程度不嚴(yán)重。

圖6 杭豬ROH總長度樣本數(shù)分布Fig.6 The distribution of ROH total length in Hang pigs

圖7 杭豬染色體ROH數(shù)量分布圖Fig.7 The distribution of ROH on chromosomes of Hang pigs

圖8 杭豬ROH長度占比統(tǒng)計Fig.8 The statistics on proportion of ROH length in Hang pigs

圖中中心的白點代表杭豬群體FROH的中位數(shù)，中間黑色方框的上緣和下緣分別為杭豬群體FROH的上四分位數(shù)和下四分位數(shù)。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的樣本數(shù)量分布，小提琴圖越寬的部分表示處于該值的樣本數(shù)目越多，反之則越少The white dot in the center of the figure indicates the median of FROH in Hang pigs, and the upper and lower edges of the black box in the middle are the upper quartile and lower quartile of FROH in Hang pigs, respectively. The width of the violin graph represents the sample number of FROH in Hang pigs, the wider indicate the more samples at this FROH value, and vice versa圖9 基于ROH的近交系數(shù)可視化結(jié)果Fig.9 The visualization result of inbreeding coefficient based on ROH

2.7 杭豬保種群體家系結(jié)構(gòu)分析

對保種群體中的公豬進(jìn)行家系分類，有助于杭豬的保種和育種工作。結(jié)合IBS距離矩陣和矩陣對4頭杭豬公豬使用鄰接法進(jìn)行了聚類分析，使用Mega X軟件繪制進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4頭公豬都屬于同一家系A(chǔ)(圖10)。通過矩陣結(jié)果，將與公豬的親緣關(guān)系值大于0.1的母豬與公豬劃分為同一個家系，分析結(jié)果表明，家系A(chǔ)中共有4頭公豬，12頭 母豬，其余14頭母豬則劃分為其它家系，杭豬保種群體家系劃分結(jié)果見表2。

圖中數(shù)字表示公豬號，相同顏色表示為同一個家系The numbers in the figure indicate the number of boar, and the same color represent the same family圖10 杭豬保種群體公豬進(jìn)化樹結(jié)果Fig.10 The phylogenetic tree of boars in Hang pigs conserved population

表2 杭豬保種群體家系表

3 討 論

中國地方豬擁有比現(xiàn)代西方豬更長遠(yuǎn)的家養(yǎng)歷史，而且歷史上中國地方豬沒有像西方豬那樣進(jìn)行高強度的人工選擇，因此有理由推測中國地方豬的遺傳多樣性比西方豬豐富，這一觀點也得到了前人研究的驗證。然而本研究結(jié)果表明，杭豬的遺傳多樣性與西方豬的接近，可能的原因是：1)不同研究使用的芯片不一致，一個是偏向中國地方豬設(shè)計的50K SNP芯片，另一個是針對西方豬設(shè)計的60K或者70K SNP芯片；2)各研究所使用的個體數(shù)不一致，不能完全代表各品種的遺傳多樣性；3)對SNP芯片分型結(jié)果所使用的質(zhì)控條件不一致；4)據(jù)本研究結(jié)果可知，杭豬家系少，且部分個體近交系數(shù)較高，這也會導(dǎo)致群體遺傳多樣性降低。

觀察雜合度()為某個品種內(nèi)所有SNPs位點觀察到的雜合基因型個體數(shù)占總體數(shù)的比例，期望雜合度()為某個品種所有SNPs位點雜合基因型的理論比例。當(dāng)觀察雜合度低于期望雜合度時，表明該群體可能存在近交；觀察雜合度高于期望雜合度時，表明該群體可能滲入了其它品種的血緣。本研究中，杭豬為0.359，高于東鄉(xiāng)花豬(0.17)、玉山黑豬(0.22)、贛西兩頭烏豬(0.24)、陸川豬(0.18)、巴馬香豬(0.22)等的，與馬身豬(0.354)和涼山豬(0.355)等的接近。杭豬為0.314，低于梅山豬(0.382)、二花臉(0.378)、米豬(0.382)、嘉興黑豬(0.350)、沙烏頭豬(0.371)、馬身豬(0.350)和涼山豬(0.348)的，與楓涇豬(0.315)的接近。杭豬的略高于，說明當(dāng)前的杭豬群體可能混入過其他品種的血緣，需要加以純化。

IBS是指兩個或兩個以上的個體具有相同的等位基因序列，IBS遺傳距離可以衡量群體內(nèi)個體間的相似性，評價彼此的親緣關(guān)系。青峪豬以及馬身豬的公豬平均IBS遺傳距離均高于保種群體的平均IBS遺傳距離，而本研究杭豬公豬的平均IBS遺傳距離小于杭豬保種群體的平均IBS遺傳距離，是因為青峪豬和馬身豬公豬分別有6個和3個家系，而本研究的杭豬公豬只有一個家系，因此IBS遺傳距離較近。

ROH是指父母將相同的單倍型傳遞給后代導(dǎo)致該后代中存在的純合基因型的連續(xù)片段。近親繁殖將導(dǎo)致 ROH 的增加，現(xiàn)代基因組數(shù)據(jù)研究顯示 ROH 在群體中普遍存在，群體的 ROH 的長度和數(shù)量反映了群體的人口歷史和血統(tǒng)情況。ROH 長度過大將導(dǎo)致群體遺傳多樣性的降低，對群體ROH 的估算能更好的確定近親繁殖情況，為種群多樣性保護(hù)提供重要參考依據(jù)。本研究中，個體ROH總長大于500 Mb的個體只有4個，其中包含3頭公豬，這3頭公豬基于ROH的近交系數(shù)都大于0.21，另一頭公豬的ROH總長度為257 Mb，基于ROH的近交系數(shù)為0.10，表明這4頭公豬存在近交，這與4頭公豬為一個家系的結(jié)果相符。26頭杭豬母豬單個ROH長度小于10 Mb的比例占母豬整體單個ROH數(shù)量的86.63%，且母豬的近交系數(shù)也偏小，說明杭豬母豬群目前近交程度較輕，需繼續(xù)加以維持，同時需預(yù)防近交的發(fā)生。

公豬在群體保種過程中起著十分重要的作用，家系的劃分都是以公豬為主，若某個群體的公豬只有一個家系，隨著世代的增加和閉鎖繁育，近交系數(shù)會越來越大，種群多樣性會降低，健康和繁殖性能下降，隱形有害突變會增加，導(dǎo)致整個種群出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，嚴(yán)重的可能導(dǎo)致該物種的滅絕。擴增群體數(shù)量特別是引入新的公豬血緣是有效降低杭豬近交系數(shù)的方法之一，引種后還需加強管理，制定合理的配種方案，做好詳細(xì)的系譜記錄。如果引種困難，可利用與杭豬公豬不屬于同一家系的其他家系的母豬通過回交法創(chuàng)建新的公豬血緣，也可以有效避免近交系數(shù)的進(jìn)一步增加。

4 結(jié) 論

本研究通過使用高密度SNP芯片較為系統(tǒng)的分析了杭豬保種場中保種群的遺傳多樣性、個體間的遺傳距離和親緣關(guān)系以及群體的家系結(jié)構(gòu)和近交系數(shù)。表明該保種場的杭豬群體多態(tài)性處于中等水平；杭豬保種群可能混入過其他品種的血緣，需要進(jìn)行血緣純度的鑒定；杭豬公豬遺傳距離短，親緣關(guān)系較近，且存在近交，家系少，需要引入新的血統(tǒng)來擴增杭豬保種群血緣數(shù)量或者通過回交來降低近交系數(shù)，確保杭豬保種群家系結(jié)構(gòu)的合理與平衡。