張冬杰，汪 亮，馬 紅，李忠秋，王文濤，劉 娣

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086)

低溫寒潮是自然界中最常見(jiàn)的一種自然災(zāi)害，對(duì)動(dòng)物、植物、微生物等都會(huì)造成破壞性影響。家養(yǎng)畜禽雖有人為保護(hù)，能將這種傷害程度減輕，但目前的規(guī)?；B(yǎng)殖模式，以及引入品種為主的生產(chǎn)方式，都使得畜禽對(duì)環(huán)境溫度的敏感性提高。豬是我國(guó)重要的家養(yǎng)畜種之一，與牛、羊等其他大型家養(yǎng)牲畜相比，其對(duì)環(huán)境溫度的變化更為敏感。1998年Lossec等界定了不同生長(zhǎng)階段豬的臨界溫度，其中斷奶仔豬為26～28 ℃，體重60 kg育肥豬為18～20 ℃，低于這些溫度區(qū)間，均被視為低溫環(huán)境。低溫環(huán)境是導(dǎo)致新生仔豬死亡和發(fā)病的主要原因，會(huì)造成圍產(chǎn)期母豬死亡率上升、肉品質(zhì)下降。因此，豬與環(huán)境溫度之間的關(guān)系依舊是養(yǎng)殖業(yè)不容忽視的問(wèn)題之一。

在過(guò)去的20年里，測(cè)序技術(shù)的飛速進(jìn)步使得人們能夠研究各種內(nèi)部和外部刺激下基因表達(dá)變化的全基因組模式，人們發(fā)現(xiàn)低溫脅迫對(duì)每個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組均產(chǎn)生了廣泛的影響。在對(duì)一種南極細(xì)菌的深度測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，與初級(jí)代謝相關(guān)的基因在低溫下受到抑制，而與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相關(guān)的基因受到促進(jìn)，乙醇氧化途徑對(duì)細(xì)菌在低溫下生長(zhǎng)起著重要作用。對(duì)葡萄柚低溫耐受性的全基因組分析顯示，光合作用、防御、細(xì)胞壁和次級(jí)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)，而膜蛋白、脂質(zhì)代謝、植物激素和冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)。短期冷暴露(3 d，4 ℃)改變了小鼠腹股溝部白色脂肪(iWAT)中參與脂肪酸伸長(zhǎng)、三酰基甘油、鞘脂和甘油三酯合成的基因表達(dá)與生物學(xué)通路，此外，與代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病和衰老相關(guān)的基因及表達(dá)途徑均發(fā)生了改善性變化。遭受重度低溫的大鼠髂腰肌中有91種mRNAs 的表達(dá)量是正常、輕度以及中度低溫組的2倍 以上，這些mRNAs參與了一系列的生物學(xué)過(guò)程，包括對(duì)應(yīng)激和脂質(zhì)的反應(yīng)以及細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)、、41和4是重度低溫下特異表達(dá)的基因。對(duì)冷馴化下人的股外側(cè)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，冷馴化改變了756個(gè)基因的表達(dá)量，表達(dá)量變化最高的基因參與了神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞之間的收縮和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些上調(diào)基因與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練造成的基因上調(diào)存在顯著重疊，尤其是與細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)的基因和通路。

民豬是生活在我國(guó)東北地區(qū)的一個(gè)古老的地方豬種，受環(huán)境氣候影響，它具有顯著的耐寒特性，能夠在-30～30 ℃的廣泛溫度區(qū)間內(nèi)保持正常的生理反應(yīng)。本研究的目的是篩選和鑒定民豬骨骼肌內(nèi)參與低溫脅迫應(yīng)答的基因及調(diào)控因子。為此，對(duì)經(jīng)歷了58 d低溫脅迫的民豬骨骼肌組織進(jìn)行了RNA-Seq分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。2020年11月9日，將6頭6月齡體重相近的雌性民豬隨機(jī)分成2組，每組3頭個(gè)體。試驗(yàn)開(kāi)始前，6頭個(gè)體全部在室內(nèi)有供暖的豬舍內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在(18±2) ℃，試驗(yàn)開(kāi)始后，一組置于室外的半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，溫度隨外界環(huán)境溫度變化而變化，第1天的環(huán)境溫度為5 ℃/-5 ℃(最高溫度/最低溫度)，飼養(yǎng)至2021年1月6日結(jié)束，此時(shí)的環(huán)境溫度為-15 ℃/-24 ℃(圖1)，相同時(shí)間內(nèi)，另一組始終留在溫暖的舍內(nèi)飼養(yǎng)。兩組均保證自由采食和飲水，共處理58 d。試驗(yàn)結(jié)束后，屠宰全部個(gè)體，取背最長(zhǎng)肌置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 試驗(yàn)期間環(huán)境溫度變化情況Fig.1 Environment temperature changes during the experiment

1.2 民豬背最長(zhǎng)肌組織總RNA的提取

采用常規(guī)的酚-氯仿法提取總RNA，使用NanoDrop 2000&8000 微量分光光度計(jì)對(duì)所提取的RNA進(jìn)行純度檢測(cè)，要求OD/ OD≥ 1.8，使用安捷倫的2100 Bioanalyzer進(jìn)行濃度與完整性檢測(cè)，要求濃度不低于100 ng·μL，28 S / 18 S ≥ 1.5。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

每個(gè)樣品取1 μg總RNA作為起始量構(gòu)建lncRNA 文庫(kù)。首先使用Ribo-off rRNA Depletion試劑盒去除rRNA，然后向反應(yīng)體系中加入碎片緩沖液(fragmentation buffer)使RNA片斷化成為短片段，再以片斷后的RNA為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)cDNA第一鏈合成；隨后加入第二鏈標(biāo)記緩沖液(2nd Strand Marking Buffer)、第二鏈/末端修復(fù)混合酶(2nd strand/end repair enzyme mix) 合成cDNA第二鏈，經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭后，通過(guò)磁珠篩選回收目的片段，加UNG酶消化cDNA二鏈，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過(guò)磁珠純化回收目的片段，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。使用NovaSeq 6000 S4對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.4 民豬背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后原始數(shù)據(jù)的處理

測(cè)序得到的原始下機(jī)序列含有測(cè)序接頭序列以及低質(zhì)量序列，需要對(duì)這些序列進(jìn)行過(guò)濾，包括去除接頭污染的Reads，低質(zhì)量的Reads，含N比例大于5%的Reads，以及與rRNA匹配的Reads，得到高質(zhì)量的Clean Reads后再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 民豬背最長(zhǎng)肌中l(wèi)ncRNA的鑒定

首先對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行篩選，保留那些長(zhǎng)度≥200 bp，外顯子個(gè)數(shù)≥2且reads覆蓋度≥5的轉(zhuǎn)錄本；然后利用在線軟件gffcompare同豬的注釋文件進(jìn)行比較，去掉與mRNA及其他非編碼RNA(rRNA、tRNA、 snoRNA、snRNA等)相匹配的轉(zhuǎn)錄本；根據(jù)比較結(jié)果中的class_code信息(“u”、“i”、“x”)篩選潛在的lincRNA、 intronic lncRNA和anti-sense lncRNA； 最后利用CNCI、CPC、PFAM和CPAT這4個(gè)分析軟件對(duì)篩選出的lncRNA是否具有編碼潛能進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用這4個(gè)軟件均判別為非編碼(non-coding)的轉(zhuǎn)錄本定義為最終的lncRNA數(shù)據(jù)集。

1.6 民豬背最長(zhǎng)肌中基因和lncRNA的表達(dá)量分析

使用FPKM定量估計(jì)基因表達(dá)值(附文獻(xiàn))，采用DEseq2進(jìn)行試驗(yàn)組和對(duì)照組間差異表達(dá)基因分析，滿足|logfold change|≥1和q<0.05的差異基因被認(rèn)為達(dá)到顯著水平。根據(jù)兩組間上、下調(diào)基因情況繪制差異表達(dá)基因的火山圖。

1.7 民豬背最長(zhǎng)肌中受低溫脅迫誘導(dǎo)的基因功能分析

GO富集分析：針對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的二級(jí)條目，計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)找出與整個(gè)基因組背景相比，差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目。通路富集分析：對(duì)KEGG中每個(gè)通路應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因顯著性富集的通路。

1.8 民豬背最長(zhǎng)肌中受低溫脅迫誘導(dǎo)的lncRNA與mRNA聯(lián)合分析

尋找差異表達(dá)lncRNA的靶基因，進(jìn)而通過(guò)靶基因間接預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能。目前已知lncRNA和靶基因間主要通過(guò)順式()和反式()兩種方式進(jìn)行調(diào)控，通過(guò)lncRNA的功能與其在基因組座位上臨近的蛋白編碼基因的相關(guān)性進(jìn)行調(diào)控靶基因的預(yù)測(cè)，將lncRNA相鄰位置(上、下游50 kb)的蛋白編碼基因篩選出來(lái)作為靶基因。通過(guò)lncRNA 的功能不依賴于和編碼基因的位置關(guān)系，而是與共表達(dá)基因的相關(guān)性進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)。根據(jù)lncRNA同mRNA表達(dá)量的相關(guān)性系數(shù)(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，corr ≥0.9)進(jìn)行篩選。篩選后獲得的靶基因開(kāi)展功能注釋、GO富集和通路富集分析。

1.9 差異表達(dá)基因的real-time PCR驗(yàn)證

利用Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀LightCycler480Ⅱ?qū)υ囼?yàn)組顯著高表達(dá)的9個(gè)基因和2個(gè)lncRNAs進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，引物信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：cDNA樣品0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，特異性引物上、下游各0.5 μL，滅菌水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè) 循環(huán)。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)2法計(jì)算各模板中目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因-的表達(dá)量。

表1 qRT-PCR檢測(cè)用引物信息

2 結(jié) 果

2.1 低溫環(huán)境下民豬背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾處理后，每頭個(gè)體平均獲得98 M的clean reads，與基因組的比對(duì)效率為96.12%，其中，38.94%的序列比對(duì)到外顯子區(qū)域，30.50%的序列比對(duì)到內(nèi)含子區(qū)域，30.56%的序列比對(duì)到基因間區(qū),篩選出的lncRNA經(jīng)CNCI、CPC、PFAM蛋白結(jié)構(gòu)域和CPAT分析后，取四者間的交集，共獲得10 220個(gè)lncRNAs。

2.2 低溫環(huán)境下民豬背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)基因的篩選與分析

民豬在經(jīng)歷58 d的低溫脅迫后，背最長(zhǎng)肌中共有102個(gè)基因發(fā)生了顯著變化，其中86個(gè)基因發(fā)生了顯著上調(diào)，16個(gè)基因發(fā)生了顯著下調(diào)(|logfoldchange|≥1，q<0.05)。186個(gè)lncRNAs發(fā)生了顯著變化，其中112個(gè)lncRNAs發(fā)生了顯著上調(diào)，74個(gè) lncRNAs發(fā)生了顯著下調(diào)(圖2)。由于豬的lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善，因此這186個(gè)lncRNAs均顯示為novel lncRNA。發(fā)生顯著變化的、且有注釋的蛋白編碼基因共計(jì)86個(gè)。其中8個(gè)基因的變化倍數(shù)在3倍以上，27個(gè)基因的變化倍數(shù)在2～3倍之間，51個(gè)基因的變化倍數(shù)在1～2倍之間。上調(diào)變化倍數(shù)最大的是神經(jīng)降壓素受體2(neurotensin receptor 2，2)基因，上調(diào)了7.18倍；下調(diào)變化倍數(shù)最大的是RAS樣蛋白家族11A(RAS like family 11 member A，11A)基因，下調(diào)倍數(shù)為2.75倍(表2)。

圖2 低溫脅迫下民豬背最長(zhǎng)肌內(nèi)差異表達(dá)基因的火山圖Fig.2 Volcanic plot of differentially expressed genes in the longissimus dorsi of Min pigs under low temperature stress

表2 低溫脅迫下民豬背最長(zhǎng)肌內(nèi)發(fā)生顯著變化的基因

2.3 民豬低溫環(huán)境下背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)基因的功能分析

對(duì)低溫環(huán)境下民豬背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)94個(gè)差異基因顯著富集到94個(gè)生物過(guò)程條目、12個(gè)分子功能條目和2個(gè)細(xì)胞組分條目(圖3，僅列出前10個(gè)條目)。在生物過(guò)程(biological process, BP)這個(gè)本體中，富集程度最高的是骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程(skeletal muscle cell differentiation)、學(xué)習(xí)記憶(learning of memory)和MAPKKK活性的激活(activation of MAPKKK activity)；在分子功能(molecular function, MF)這個(gè)本體中，富集程度最高的是RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding)、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合(proximal promoter sequence-specific DNA binding)和RNA聚合酶II調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合(RNA polymerase II regulatory region DNA binding)；在細(xì)胞組分(cellular component, CC)這個(gè)本體中，僅有2個(gè)條目被顯著富集，分別是CHOP-ATF3復(fù)合體(CHOP-ATF3 complex)和CHOP-C/EBP復(fù)合體(CHOP-C/EBP complex)。

圖3 差異表達(dá)基因的GO富集分析Fig.3 Go enrichment analysis of differentially expressed genes

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)僅3條通路被顯著富集，分別是細(xì)胞凋亡通路(apoptosis, q=0.001 98)、直腸癌通路(colorectal cancer, q=0.001 98) 和癌癥中的轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)通路(transcriptional misregulation in cancer, q=0.036 44)。在細(xì)胞凋亡通路中，7個(gè)基因、、45B、45G、45A、3、2L11發(fā)生了顯著上調(diào)。

2.4 民豬低溫環(huán)境下背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)lncRNA的靶基因預(yù)測(cè)

lncRNA不編碼蛋白，主要通過(guò)或方式作用于編碼蛋白基因。本研究發(fā)現(xiàn)，民豬在經(jīng)歷58 d的低溫環(huán)境后，背最長(zhǎng)肌內(nèi)186個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs順式調(diào)控251個(gè)靶基因，反式調(diào)控1 377個(gè)靶基因。通過(guò)對(duì)lncRNA與mRNA之間的互作分析發(fā)現(xiàn)兩者間的調(diào)控關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。比如MSTRG.13828同時(shí)調(diào)控67個(gè)基因，其中3個(gè)為調(diào)控，64個(gè)為調(diào)控，它所調(diào)控的基因215在兩組間達(dá)到了顯著差異；基因2AIP1則同時(shí)受到14個(gè)lncRNAs的反式調(diào)控。表3列出了變化水平前10位的上調(diào)表達(dá)lncRNAs的靶基因情況及調(diào)控方式。

表3 低溫脅迫下民豬背最長(zhǎng)肌內(nèi)變化倍數(shù)前10位的lncRNAs和其靶基因情況

2.5 民豬低溫環(huán)境下背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)lncRNA的靶基因功能分析

對(duì)差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)在生物過(guò)程本體中，有81個(gè)條目被顯著富集，其中富集程度最高的是核酸代謝過(guò)程(nucleic acid metabolic process)，在分子功能本體中有28個(gè)條目被顯著富集，其中核酸結(jié)合(nucleic acid binding)富集程度最高；在細(xì)胞組分本體中，有19個(gè)條目被顯著富集，其中富集程度最高的在細(xì)胞內(nèi)部分(intracellular part)，每個(gè)本體中富集程度前10的條目情況見(jiàn)圖4。

A. 生物過(guò)程顯著富集的前10個(gè)條目結(jié)果; B.分子功能顯著富集的前10個(gè)條目結(jié)果; C.細(xì)胞組分顯著富集的前10個(gè)條目結(jié)果。橫坐標(biāo)表示富集程度，縱坐標(biāo)表示GO條目。每個(gè)點(diǎn)表示該GO條目的富集程度，顏色越趨近于紅色表示富集程度越高。每個(gè)點(diǎn)的大小表示富集到該GO條目的基因的個(gè)數(shù)，點(diǎn)越大表示富集到該GO條目的基因越多，反之則越少。Rich ratio的計(jì)算公式為：(該通路的差異基因/所有的差異基因)/(注釋到該通路的基因/所有能被注釋到的基因)A. Results of the top 10 terms with significant enrichment in biological processes; B. Results of the top 10 terms with significant enrichment in molecular function; C. Results of the top 10 terms with significant enrichment in cellular components. The abscissa represents the degree of enrichment and the ordinate represents the GO term. Each point indicates the enrichment degree of the GO term， the closer the color to red, the higher the enrichment degree. The size of each point indicates the number of genes enriched into the GO term, the larger the point, the more genes enriched into the GO term, and vice versa. Rich ratio: (differential genes in this pathway / all differential genes) / (genes annotated to this pathway / all genes that can be annotated)圖4 GO條目FDR值富集圖Fig.4 FDR value enrichment map of GO terms

對(duì)差異表達(dá)lncRNA的靶基因進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒1感染通路(herpes simplex virus 1 infection)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)和范可尼貧血通路(fanconi anemia pathway)被顯著富集。

2.6 測(cè)序結(jié)果的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇了8個(gè) 顯著上調(diào)表達(dá)的基因、、5、1、1、1、1、1和6個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的lncRNAs，2個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)的基因146和3以及1個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)的lncRNA73004進(jìn)行了qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，qPCR定量檢測(cè)值與測(cè)序值相比，變化趨勢(shì)基本一致(圖5)，表明測(cè)序結(jié)果可信。

圖5 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 qRT-PCR validation results

3 討 論

自然界的動(dòng)植物都會(huì)受到來(lái)自環(huán)境的低溫脅迫影響，植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)包括膜脂類型和去飽和水平的變化。動(dòng)物因其生理結(jié)構(gòu)和遺傳基礎(chǔ)比植物復(fù)雜的多，因此其低溫耐受機(jī)理還未完全解析清楚。目前研究主要集中在兩個(gè)方面，一個(gè)是低溫環(huán)境下白色脂肪的褐色化機(jī)理，另一個(gè)是低溫環(huán)境下骨骼肌的產(chǎn)熱機(jī)理。骨骼肌是哺乳動(dòng)物成年個(gè)體機(jī)體內(nèi)最豐富的組織，產(chǎn)熱速率的微小變化就會(huì)引起全身產(chǎn)熱的重大變化。在對(duì)小鼠、魚(yú)類和鳥(niǎo)類的研究中發(fā)現(xiàn)，肌漿網(wǎng)Ca循環(huán)是一種不會(huì)干擾ATP合成的產(chǎn)熱機(jī)制。骨骼肌內(nèi)還存在豐富的神經(jīng)組織，能夠?qū)ρh(huán)的腎上腺素能因子作出反應(yīng)；富含線粒體，具有較高的脂質(zhì)氧化能力。缺乏褐色脂肪組織的動(dòng)物(鳥(niǎo)類和豬)或褐色脂肪含量較少的動(dòng)物(成人和大型哺乳動(dòng)物)，都以骨骼肌內(nèi)依賴于肌質(zhì)蛋白的非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱為主。

本研究以經(jīng)歷58 d低溫脅迫的民豬骨骼肌為試驗(yàn)材料，采用RNA-seq技術(shù)對(duì)其進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選與分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因發(fā)生了顯著上調(diào)，如上調(diào)倍數(shù)最高的2基因，它表達(dá)水平的增加可使小鼠對(duì)熱痛覺(jué)和化學(xué)痛覺(jué)產(chǎn)生抵抗力。緊隨其后的基因，是一種神經(jīng)元基因，對(duì)于哺乳動(dòng)物大腦中持久的信息儲(chǔ)存至關(guān)重要，并且與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元細(xì)胞損傷以及腦損傷中發(fā)揮作用，它的高表達(dá)會(huì)抑制AMPK信號(hào)通路的活性，進(jìn)而抑制神經(jīng)元細(xì)胞活性、促進(jìn)炎癥發(fā)生、加速細(xì)胞凋亡。1是一種內(nèi)源性鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，在唐氏綜合征(人類神經(jīng)系統(tǒng)的最常見(jiàn)染色體疾病)中的表達(dá)增加了3倍，它通過(guò)抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)吞作用損害交感神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)支持。

本研究中，溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(solute carrier，SLC)的7個(gè)基因受到低溫誘導(dǎo)，發(fā)生了顯著上調(diào)，包括2A4、2A5、4A10、19A2、20A1、28A1和38A2。該家族介導(dǎo)細(xì)胞與外界或細(xì)胞內(nèi)部各類溶質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，調(diào)節(jié)基本化學(xué)物質(zhì)(包括水分、營(yíng)養(yǎng)素、激素和許多藥物)的跨膜運(yùn)輸，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞膜的完整性，以保護(hù)細(xì)胞的代謝活動(dòng)和遺傳信息免受環(huán)境影響。SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含52個(gè)基因家族和近400個(gè)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。不同家族的SLC負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)不同的基質(zhì)，比如SLC2家族主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，SLC4家族主要負(fù)責(zé)堿基的轉(zhuǎn)運(yùn)，SLC19家族主要介導(dǎo)葉酸和硫銨兩個(gè)重要水溶性維生素的運(yùn)輸，SLC20負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉依賴性磷酸鹽，以維持體內(nèi)的磷酸鹽平衡，SLC28家族專門(mén)負(fù)責(zé)核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)，SLC38家族的轉(zhuǎn)運(yùn)體存在于身體的所有細(xì)胞類型中，介導(dǎo)依賴Na的小中性氨基酸的凈攝取和流出。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫使機(jī)體內(nèi)多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生了顯著變化。

多個(gè)與炎癥和自身免疫反應(yīng)相關(guān)的基因也發(fā)生了顯著上調(diào)，如基因，它是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的配體，炎癥脂質(zhì)、細(xì)胞因子和激素等可刺激它的表達(dá)與釋放，表達(dá)的慢性升高與不同病理?xiàng)l件相關(guān)，主要是炎癥和腫瘤?；?qū)儆诩?xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)家族，會(huì)抑制IL-15介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)，它的上調(diào)表達(dá)會(huì)使先天免疫力下降。1具有免疫調(diào)節(jié)功能，在炎癥狀態(tài)下上調(diào)表達(dá)，特異性抑制IRF3的K63型多泛素化修飾，最終緩解體內(nèi)過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)、降低人體發(fā)生自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡，還可以通過(guò)影響炎癥因子的分泌來(lái)調(diào)節(jié)急慢性炎癥。此外，上調(diào)倍數(shù)在4倍以上的33、都是與免疫相關(guān)的基因。由此可知，低溫脅迫導(dǎo)致骨骼肌出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)還影響了機(jī)體的免疫力。

此外，低溫脅迫還可誘發(fā)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)肌肉萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因也受到了誘導(dǎo)，如1、1、3、和等。

民豬在遭受低溫脅迫后，肌肉組織內(nèi)發(fā)生顯著下調(diào)的基因共計(jì)16個(gè)，在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于發(fā)生顯著上調(diào)的基因。在功能上則較為分散，有抑制細(xì)胞增殖的11A基因，參與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組成的跨膜蛋白139(139)基因，具有調(diào)節(jié)TGF-β生物活性功能的潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(2)基因，參與糖代謝和神經(jīng)節(jié)苷脂分解代謝的唾液酸酶(3)基因以及與晝夜節(jié)律相關(guān)的芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白1()基因等。Dopico等在對(duì)16 000多人的血液和脂肪樣本分析中發(fā)現(xiàn)，人類基因中有將近1/4的基因活性(5 136/22 822)會(huì)隨著季節(jié)的變化而不同，一些基因在冬季更活躍，而另一些則在夏季更活躍。本研究發(fā)現(xiàn),顯著下調(diào)的基因表現(xiàn)出夏季活躍，而冬季不活躍的現(xiàn)象。

本研究中對(duì)差異基因的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程的富集程度最高，該生物過(guò)程中的5個(gè)基因發(fā)生了顯著上調(diào)，分別為轉(zhuǎn)錄激活因子3(3)、MAF bZIP轉(zhuǎn)錄因子F()、Kelch家族成員40(40)、心肌錨蛋白重復(fù)域1(1)基因和生肌因子6(6)。低溫環(huán)境會(huì)抑制豬只生長(zhǎng)，增加機(jī)體能量代謝。Shima和Matsuda研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和人類的成肌細(xì)胞在低溫(30 ℃)下培養(yǎng)時(shí)不能表達(dá)肌生成素，肌細(xì)胞分化受到抑制。而且，來(lái)源于不同部位的肌細(xì)胞對(duì)低溫環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)也存在差異。但本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬在低溫環(huán)境下并未出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，推測(cè)可能與該生物過(guò)程的活化相關(guān)。

對(duì)差異基因的通路富集分析發(fā)現(xiàn)，僅有3條通路被顯著富集，分別為細(xì)胞凋亡、直腸癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)通路。癌癥的本質(zhì)是細(xì)胞分化和增殖異常、生長(zhǎng)失去控制，除了2條富集到癌癥相關(guān)通路上，還有1條是富集到細(xì)胞凋亡通路，這說(shuō)明低溫脅迫影響了骨骼肌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡通路中有3個(gè)45基因被富集，GADD45蛋白可參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、衰老和基因毒性應(yīng)激等多種細(xì)胞功能的調(diào)控，它們的上調(diào)代表著機(jī)體啟動(dòng)了對(duì)細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)功能。

在對(duì)差異表達(dá)lncRNA的分析發(fā)現(xiàn)，由于豬的lncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善，所以無(wú)法對(duì)它們進(jìn)行功能注釋，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA對(duì)靶基因的調(diào)控多以反式調(diào)控為主，且與靶基因間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。對(duì)這些lncRNA預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行功能注釋時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些靶基因顯著富集在3條生物學(xué)通路，其中的MAPK通路是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，包括MKKK、MKK和MAPK三種激酶，這三種激酶能夠依次激活，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程。本研究中有36個(gè)基因富集到該通路上，其中24個(gè)基因上調(diào)，12個(gè)基因下調(diào)，發(fā)生變化的基因主要集中在MAPK通路的JNK和p38/MAPK分支路線上，其中p38/MAPK是促進(jìn)骨骼肌運(yùn)動(dòng)代謝適應(yīng)的信號(hào)通路之一。據(jù)此推測(cè)，低溫脅迫下骨骼肌內(nèi)的MAPK通路受到lncRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

4 結(jié) 論

低溫脅迫對(duì)民豬的神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成了影響，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生了變化，細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化也受到了影響，大量的lncRNA參與了骨骼肌的低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。但發(fā)生顯著變化的基因差異倍數(shù)多集中在1～2倍之間，而且只有細(xì)胞凋亡通路、直腸癌通路和癌癥中的轉(zhuǎn)錄誤調(diào)節(jié)通路受到影響，推測(cè)低溫脅迫并未對(duì)民豬的骨骼肌造成嚴(yán)重?fù)p傷。