PLCγ1基因?qū)d羊早期胚胎體外發(fā)育的影響

吳曉雪，袁利明，劉欣杰，劉素平，陳 寧，賽務(wù)加甫

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

哺乳動物卵母細(xì)胞從成熟發(fā)育到早期胚胎的過程十分復(fù)雜，研究人員發(fā)現(xiàn)，哺乳動物卵母細(xì)胞正常發(fā)育過程中存在減數(shù)分裂Ⅰ前期雙線期停滯和減數(shù)分裂Ⅱ中期停滯，克服這些停滯使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂是至關(guān)重要的。哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)需要激活鈣調(diào)蛋白Ⅱ從而提高卵母細(xì)胞內(nèi)Ca濃度，卵母細(xì)胞內(nèi)Ca的波動以及胚胎發(fā)育的過程中要受到多種基因的調(diào)控。劉紅林等研究表明，顯微注射Ca可激活小鼠MⅡ卵母細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)，1被磷酸化后可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca通道開放。1被激活后，水解為磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate, PIP2)生成第二信使三磷酸肌醇(inositol phosphate, IP3)及甘油二酯(diglyceride, DAG)，繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca釋放從而將細(xì)胞外信息傳遞給下游效應(yīng)分子，參與動物中配子的形成、受精、細(xì)胞增殖、早期發(fā)育到細(xì)胞分化、分泌、收縮、光感覺等許多生物學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)。研究表明，1可誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。Runft等研究發(fā)現(xiàn)，1參與海星卵受精時Ca的釋放；在哺乳動物卵子中，1的活性是受精時Ca釋放所必需的。

1是磷脂酶C(phospholipase C, PLC)的一個亞型，胞內(nèi)Ca的觸發(fā)機(jī)制與1的激活息息相關(guān)，1被激活后可生成IP3和DAG，生成的IP3可激活胞內(nèi)Ca的釋放機(jī)制，而Ca的升高是卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的關(guān)鍵，DAG可以直接激活蛋白激酶C，研究表明蛋白激酶C參與了卵母細(xì)胞受精過程、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)和減數(shù)分裂Ⅰ和Ⅱ中紡錘體的調(diào)控。

本研究利用顯微注射技術(shù)將pcDNA3.1-EGFP-1導(dǎo)入MⅡ期卵母細(xì)胞中為試驗組，以顯微注射空載體pcDNA3.1-EGFP作為對照組，經(jīng)48 h 后統(tǒng)計其卵裂率，120 h后統(tǒng)計桑椹胚率；并利用Ca探針Rhod 2-AM監(jiān)測MⅡ卵母細(xì)胞，顯微注射后16、48、72、96、120 h時卵母細(xì)胞和早期胚胎體外發(fā)育過程各時期Ca波動。這些將為進(jìn)一步探究1基因?qū)d羊早期胚胎發(fā)育機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，為提高綿羊早期胚胎體外發(fā)育能力等方面的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒與卵巢

試驗用重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-1 和pcDNA3.1-EGFP空載均為石河子大學(xué)動物科技學(xué)院實驗室所保存；綿羊卵巢(=60)采自石河子市屠宰場。

1.2 主要試劑

HEPES、NaCl、KCl、NaHCO、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、石蠟油、必需氨基酸、非必需氨基酸、乳酸鈉、細(xì)胞松弛素等試劑均購自美國Sigma公司；HMG購自石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院；生理鹽水、抗生素均購自藥店；TCM199粉末、FBS購自GIBCO公司；Rhod 2-AM 鈣離子熒光探針購自新疆恒朝生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

微量移液器(Eppendorf)；超凈工作臺(Zhjh-1112)；立式高壓滅菌鍋(Zeal-Gr60 da)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；顯微鏡加熱板(Cryologic)；倒置顯微注射操作儀(Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon)等。

1.4 方法

1.4.1 重組質(zhì)粒的驗證 對實驗室保存的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-1的陽性克隆菌液進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)Primer 5.0設(shè)計1(登錄號：NC_040264.1)引物(表1)，菌液PCR鑒定體系：Mix 7.5 μL，ddHO 4.5 μL，上、下游引物各1 μL， 菌液1 μL。將菌液接種于20 mL含抗性LB的液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃、180 r·min過夜培養(yǎng)。利用DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒按照說明書提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-1雙酶切驗證，雙酶切反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 10.0 μL，ddHO 6.0 μL，1×H Buffer 2.0 μL，d Ⅲ 1.0 μL,I 1.0 μL,并將陽性菌液送至睿博興科公司測序，將鑒定結(jié)果正確的陽性菌液接種于含抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min過夜培養(yǎng)并按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.4.2 綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 用加入抗生素的生理鹽水(37 ℃預(yù)熱)沖洗綿羊卵巢 2～3次， 剔除結(jié)締組織后繼續(xù)用含抗生素的生理鹽水洗滌2次，將卵巢放入已預(yù)熱平衡2 h的割卵液中并用鑷子固定卵巢，用11 cm手術(shù)刀將卵巢表面卵泡切開，然后用撿卵針收集割卵液中胞質(zhì)均勻、包裹卵丘細(xì)胞3層及以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，取出預(yù)熱平衡2 h的成熟液，將挑選好的COCs放入成熟液中清洗3次，然后將其放入成熟液微滴(每個微滴100 μL)中，在溫度為38.5 ℃，5% CO的培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)24 h。

表1 引物序列

1.4.3 綿羊成熟卵母細(xì)胞的選擇 在倒置顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞成熟的情況，未成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞沒有向外擴(kuò)散，并且分布不均勻未分層，成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞呈放射狀向外擴(kuò)散且有分層現(xiàn)象，顆粒細(xì)胞吹打干凈后可明顯看到排出第一極體(圖1)。

A.未成熟COCs；B.成熟COCs；C.成熟卵母細(xì)胞A. Immature COCs; B. Mature COCs; C.Mature oocyte圖1 卵母細(xì)胞成熟情況(40×)Fig.1 Oocytes maturation(40×)

1.4.4 重組質(zhì)粒卵母細(xì)胞內(nèi)顯微注射 COCs培養(yǎng)24 h后，將卵母細(xì)胞在透明質(zhì)酸酶中作用5 min,并用移液槍反復(fù)吹打卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞直至將顆粒細(xì)胞吹打干凈，隨后用成熟液洗滌3次, 挑選排出第一極體的細(xì)胞。將含有第一極體的細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，分別移入操作液的微滴中。

將制備好的固定針、注射針安裝在顯微操作儀上，然后用固定針吸附固定卵母細(xì)胞，用注射針吸取重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-1后，注入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，最后退出注射針，1 h內(nèi)完成所有卵母細(xì)胞的顯微注射操作。對照組卵母細(xì)胞顯微注射pcDNA3.1-EGFP空載體，方法同上。將兩組細(xì)胞分別放入SoFaa液中，在培養(yǎng)條件為5% CO、溫度38.5 ℃和飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后開始統(tǒng)計卵裂率。

1.4.5 卵母細(xì)胞和早期胚胎Ca的測定 分別挑選MⅡ卵母細(xì)胞，顯微注射16、48、72、96、120 h的卵母細(xì)胞放入PBS緩沖液中清洗3次，以除去培養(yǎng)基。將其放入Rhod 2-AM染色液中，在38.5 ℃，5% CO培養(yǎng)箱中孵育1 h,隨后將其放入胚胎發(fā)育液中清洗3次，以除去染色液；最終將各時期細(xì)胞分別放入含有胚胎發(fā)育液的玻璃培養(yǎng)皿中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察Ca的分布情況和熒光強(qiáng)度，對比卵母細(xì)胞和早期胚胎各時期的熒光強(qiáng)度并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗均重復(fù)至少3次，采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本檢驗分析和單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

對菌液進(jìn)行PCR鑒定，后將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小330 bp的目的條帶(圖2)，與預(yù)期相符。將pcDNA3.1-EGFP-1用d Ⅲ和I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)兩條清晰可見的條帶：一條為5 428 bp的載體線性片段，另一條為3 960 bp的目的片段(圖3)，其大小與預(yù)期相符。將菌液送至睿博興科公司測序，測序結(jié)果正確可用于后續(xù)顯微注射試驗。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3. PCR產(chǎn)物;N. 陰性對照M. DNA marker (50-1 031 bp);1-3. The PCR products;N. Negative control圖2 菌液PCR鑒定Fig.2 PCR identification of bacterial solution

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、3. 雙酶切產(chǎn)物；N. 陰性對照M.Super marker; 1,3. Double digestion products;N. Negative control圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double digestion

2.2 卵母細(xì)胞顯微注射后的卵裂率及早期胚胎發(fā)育情況

結(jié)果顯示，兩組卵母細(xì)胞內(nèi)均可觀察到綠色熒光，載體成功在胞內(nèi)表達(dá)。注射pcDNA3.1-EGFP空載體的對照組卵母細(xì)胞沒有卵裂現(xiàn)象(圖4)，而注射pcDNA3.1-EGFP-1重組質(zhì)粒的試驗組卵母細(xì)胞發(fā)生卵裂(圖5)。

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP(明場)；B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP(暗場)A. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP (open field);B. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP (dark field)圖4 顯微注射pcDNA3.1-EGFP卵母細(xì)胞發(fā)育情況 (100×)Fig.4 Development of microinjected pcDNA3.1-EGFP oocytes (100×)

A. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1(明場);B. 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1(暗場)A. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 (open field);B. Microinjecting pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 (dark field)圖5 顯微注射pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1卵母細(xì)胞卵裂情況(100×)Fig.5 Cleavage of microinjected pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1 oocytes (100×)

2.3 卵母細(xì)胞和早期胚胎Ca2+的熒光強(qiáng)度

利用激光共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞以及早期胚胎發(fā)育不同時期Ca的波動情況(圖6)，結(jié)果顯示，1基因可以引起早期胚胎發(fā)育過程中Ca振蕩，Ca都主要分布在胞質(zhì)中，MⅡ卵母細(xì)胞Ca熒光強(qiáng)度最低，顯微注射48 h Ca熒光強(qiáng)度最高與MⅡ卵母細(xì)胞Ca熒光強(qiáng)度相比，差異極顯著(<0.01)， 隨著胚胎的發(fā)育熒光強(qiáng)度開始減弱隨后趨于平穩(wěn)(圖7)。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察各時期Ca2+濃度變化(200×)Fig.6 Laser confocal microscopy observation of Ca2+ concentration in each period (200×)

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different capital letters mean very significant difference (P<0.01), different lowercase letters mean significant difference (P<0.05)圖7 顯微注射PLCγ1后各時期Ca2+熒光強(qiáng)度變化Fig.7 Changes of Ca2+ fluorescence intensity in each period injected PLCγ1

顯微注射48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞卵裂情況并進(jìn)行統(tǒng)計分析(表2)。結(jié)果顯示，注射pcDNA3.1-EGFP空載體的對照組的卵裂率為0；而注射pcDNA3.1-EGFP-1重組質(zhì)粒的試驗組的卵裂率為(19.67±0.2)%，差異極顯著(<0.01)，桑椹胚率為(9.00±0.17)%，差異顯著(<0.05)。

表2 卵母細(xì)胞卵裂率和桑椹胚率統(tǒng)計分析

3 討 論

孤雌激活是可以實現(xiàn)無需精子介入的卵母細(xì)胞激活分裂和發(fā)育，是無性生殖技術(shù)的一種，其對研究胚胎發(fā)育的機(jī)制具有非常重大的意義。為獲得較高的孤雌激活卵裂率和發(fā)育率，研究人員不斷深入探索卵母細(xì)胞孤雌激活的方法，目前較為優(yōu)良的孤雌激活方式主要是6D聯(lián)合離子霉素激活。卵母細(xì)胞激活在胚胎發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)Ca在小鼠卵母細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要作用，Ca的瞬時升高可以導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂從而使其繼續(xù)發(fā)育到早期胚胎。Yeste等闡明，Ca振蕩在卵母細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要作用，維持其在卵母細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制至關(guān)重要，IP3與三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, IP3R)結(jié)合后導(dǎo)致鈣離子通道打開，從而使Ca從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，體細(xì)胞中IP3R的活性受到其他激酶蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和磷酸蛋白PP1、PP2A及鈣調(diào)素的調(diào)控，IP3R在哺乳動物卵母細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制仍有待確定。哺乳動物精卵結(jié)合后鈣離子濃度升高主要是由于精子通過與G蛋白偶聯(lián)的受體作用從而激活磷脂酶C，PLC可水解PIP，產(chǎn)生IP3和DAG；IP3一旦產(chǎn)生可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上儲存的Ca釋放進(jìn)入胞質(zhì)，釋放出來的Ca又可以反過來激活PLC而增加IP3的產(chǎn)量從而形成鈣波；DAG刺激蛋白激酶C的活性從而使PKC的底物蛋白磷酸化,導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活,恢復(fù)減數(shù)分裂。1基因作為磷脂酶C的一個亞型，其含有SH2和SH3兩個主要結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域可使1基因參與小鼠卵母細(xì)胞的激活。

本研究通過顯微注射技術(shù)將1基因?qū)刖d羊MⅡ期卵母細(xì)胞，結(jié)果表明1基因可以使卵母細(xì)胞發(fā)生Ca振蕩，使Ca濃度瞬時升高,激活綿羊卵母細(xì)胞并使其繼續(xù)發(fā)育到桑椹胚，卵裂率為(19.67±0.2)%，桑椹胚率為(9.00±0.17)%,與對照組顯微注射空載體pcDNA3.1-EGFP相比差異顯著。哺乳動物卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中會經(jīng)歷兩次停滯期，在卵泡中的卵母細(xì)胞在第一次減數(shù)分裂的前期受阻，排出卵泡的卵母細(xì)胞會恢復(fù)第一次減數(shù)分裂，在大多數(shù)情況下恢復(fù)第一次減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞會在第二次減數(shù)分裂再次停滯。然而,卵母細(xì)胞無論是通過受精還是孤雌激活都會引起胞內(nèi)Ca振蕩，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)從而使其發(fā)育成胚胎。研究表明，當(dāng)激活胞內(nèi)PLC1信號后，胞內(nèi)Ca濃度會升高。Sette等發(fā)現(xiàn),1基因參與小鼠卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的過程，1被激活后觸發(fā)小鼠卵母細(xì)胞Ca釋放機(jī)制從而使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。研究表明,1可催化PIP2生成DAG和IP3，IP3可使細(xì)胞內(nèi)Ca釋放，若細(xì)胞內(nèi)1基因缺失，細(xì)胞內(nèi)Ca濃度較低且峰值出現(xiàn)較晚。本研究表明，顯微注射1基因48 h后引起胞內(nèi)Ca濃度升高，這可能與1可水解PIP2生成IP3有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，1基因可以通過調(diào)控PTK-1信號通路激活毛翼蟲卵子；1抑制劑U73122可以阻止孤雌生殖卵子的激活。因此，在MⅡ期導(dǎo)入1基因后可導(dǎo)致綿羊卵母細(xì)胞發(fā)生Ca振蕩從而使綿羊卵母細(xì)胞發(fā)生卵裂。但1基因調(diào)控綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育以及胞內(nèi)Ca振蕩的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1基因可以通過提高綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)Ca濃度誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，使其發(fā)生卵裂并可繼續(xù)發(fā)育到桑椹胚。