郭子涵，秦春力，張芳芳，趙 娜，王 彬，賀稚非，李洪軍,5，呂景智*

(1.西南大學動物科學技術學院 生物飼料與分子營養(yǎng)實驗室，重慶 400715； 2. 四川省巴中市巴州區(qū)農業(yè)農村局，巴中 636000； 3. 四川省巴中市巴州區(qū)畜牧站，巴中 636000； 4. 西南大學食品科學學院，重慶 400715； 5. 川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400715)

近年來，肉兔作為畜產(chǎn)品、寵物和科研實驗動物的重要來源，出欄量逐年提高，對運輸?shù)男枨笠蚕鄳哟?。道路運輸是畜禽常見的一種應激源，粗暴裝籠、混群、斷水斷食、不良氣味、噪音、擁擠和遠途等惡劣的運輸條件給家畜帶來了諸多應激。在運輸途中，肉兔血液中皮質酮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、葡萄糖、紅細胞壓積、肌酸激酶、乳酸、乳酸脫氫酶、總蛋白等的濃度隨之發(fā)生變化。運輸還提高了肌肉的滴水損失，影響肌肉的構形參數(shù)與肉色，但不影響pH、吸水力和剪切力。另外，道路運輸應激還提高了家畜的站立、排尿和排糞等行為的頻次和持續(xù)時間，降低了興奮性，使家畜表現(xiàn)出抑郁樣行為。一般來說，家畜被運輸?shù)酵涝讏龊蟛⒉恢苯油涝祝窃谕涝讏鋈霗陟o養(yǎng)一段時間，這樣有助于家畜從應激中恢復。屠宰前禁食與肉質、胴體重和肉類安全性有關，是目前動物生產(chǎn)中常用的措施。運輸后禁食可提高肉色、pH和系水力。研究表明，屠宰前48 h內禁食能最大限度地減少不良微生物的生長。然而，有學者認為屠宰前的禁食和非禁食與胴體微生物感染無關，胴體污染可能是由不同的肉類包裝工廠的工藝和操作不同所導致的。屠宰前禁食增加了DFD肉的發(fā)生率，降低了胴體質量。同時，運輸前禁食會使動物饑餓，沮喪、疲勞和興奮增加，家畜裝載時抗拒和喊叫更加明顯，而在屠宰場入欄期間提供飲食可以一定程度上緩解家畜的應激。所以，探索合理的運輸后處理方式，尋找緩解肉兔運輸后應激的措施是非常必要的。本試驗從肉兔血清生化指標、肉品質、應激基因表達和行為等方面探究運輸后禁食、非禁食對肉兔應激的影響，希望能提高肉兔的福利水平，減少運輸應激造成的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試驗動物

將80只體重(2.5±0.5) kg的伊拉公兔隨機分為8個組：對照組(不運輸)、運輸后0 h組(運輸后與對照組一起立即屠宰)、禁食6 h組、禁食24 h組、非禁食6 h組、非禁食24 h組、禁食行為觀察組(不屠宰)和非禁食行為觀察組(不屠宰)，每組10只肉兔。預試期為7 d。運輸籠的大小為750 mm × 550 mm × 270 mm，裝載密度為10 只·籠。在試驗當日6:00，將肉兔經(jīng)貨車以80 km·h的平均時速運輸2 h后返回兔場后，并被轉移至兔籠中。禁食組不采食飼料，非禁食組自由采食，但均可自由飲水。除行為觀察組外，在運輸后0、6、24 h將其余各組的肉兔分批屠宰。使用海康威視1200萬高清星光攝像頭攝像記錄2個行為觀察組運輸后36 h內的行為變化。

1.2 飼養(yǎng)管理

將兔舍定期清掃并嚴格消毒，兔舍采用自然光照、定時通風，室內溫度為(22±2)℃。每個兔籠裝兩只肉兔。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 血清生化指標的測定 將肉兔頸部脫臼處死后倒掛，用10 mL離心管收集血液。血液在室溫靜置30 min后，3 500 r·min離心10 min后采集血清，在-80 ℃冰箱保存。血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)等的含量在Olympus AU400全自動生化分析儀進行檢測。

1.3.2 血清激素水平測定 用雙抗體夾心法原理測定血清中皮質醇的含量，試劑盒來自武漢華美生物工程有限公司。

1.3.3 肉品質測定 將肉兔屠宰后取背最長肌，裝在自封袋中，保存在4 ℃冰箱中，于24 h后測定肌肉的pH、肉色、失水率、蒸煮損失率和剪切力。使用pH-STAR直測儀測定pH，使用UltraScan PRO測色儀測定肉色，用GR-150 Warner-Bratzler剪切力儀測定剪切力，指標的測定方法參照NY/T 1333—2007《畜禽肉質的測定》。

1.3.4 實時熒光定量PCR 在采樣時，用錫箔紙包裹肝組織樣品后，快速投入液氮中冷凍，隨后轉移至-80 ℃冰箱。通過GenBank查找并設計、-3基因的引物序列(表1)，由華大基因科技服務有限公司合成。RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒購自美國ABM生物科技有限公司，熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。25 μL的PCR反應體系為Hotstart Fluo-PCR mix 12 μL、 上游和下游引物(25 μmol·L)各1 μL、cDNA 1 μL和ddHO 10 μL。用BIO-RAD CFX實時熒光定量PCR儀測定基因表達水平，儀器設置的反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。每個樣品設3個技術重復。

表1 引物序列

1.3.5 兔行為學觀測 用攝像頭全程記錄行為觀察組肉兔在運輸后的行為，行為定義參考Prebble等的方法。為掌握肉兔運輸后36 h內的行為變化，于每天7:00、13:00、18:00和24:00進行觀察，每次持續(xù)30 min，記錄并計算觀察期內各行為發(fā)生累計時間或頻次占總觀察時間或頻次的百分率。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行處理，其中行為學數(shù)據(jù)用獨立樣本檢驗方法進行分析，其他試驗數(shù)據(jù)用單因素ANOVA法進行分析，分析結果表示為“平均值±標準差”，后用Duncan法進行多重比較。<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 運輸后禁食與非禁食對肉兔應激水平的影響

如表2所示，運輸后0 h組兔血清TP濃度相對于對照組顯著降低(<0.05)，而血清皮質醇濃度相對于對照組顯著升高(<0.05)。禁食6 h組兔血清LDH水平(<0.01)和禁食24 h組兔血清CK水平(<0.05)顯著高于對照組，禁食24 h組兔血清Glu水平顯著低于對照組(<0.05)。與禁食組相比，非禁食6 h組兔的血清LDH水平(<0.01) 和非禁食24 h組兔血清CK水平(<0.05)顯著降低，而非禁食24 h組血清Glu濃度顯著升高(<0.05)。

2.2 運輸后禁食與非禁食對肉兔肌肉品質的影響

表3所示，和對照組相比，運輸后0 h背最長肌pH顯著上升(< 0.05)，肌肉值顯著降低(<0.05)，值極顯著下降(<0.01)，值則無顯著變化(>0.05)。運輸后6 h和運輸后0 h相比，pH、值和剪切力顯著下降(<0.05)，禁食6 h 組和非禁食6 h組之間的pH、、和值差異不顯著(>0.05)，但非禁食24 h組的、和值顯著高于禁食24 h組(<0.05)。各處理組之間背最長肌失水率和蒸煮損失率的差異并不顯著(>0.05)。背最長肌的剪切力隨著時間的增長而依次顯著降低(<0.05)，但禁食組與非禁食組間無顯著差異(>0.05)。

2.3 運輸后禁食與非禁食對JNK通路mRNA表達的影響

如圖1所示，運輸后0 h組和-3的mRNA表達量顯著高于對照組(<0.05)。非禁食組的mRNA表達量顯著低于禁食組(<0.05)， 但禁食與非禁食組間的-3 mRNA 的表達水平并無顯著差異(>0.05)。

柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Column with different lowercase letters mean significant differences among treatments (P<0.05)圖1 非禁食和禁食對運輸后肉兔肝JNK和Caspase-3 mRNA表達水平的影響Fig.1 Effects of non-fasting and fasting on the expression of JNK and Caspase-3 mRNA in liver of rabbits after transportation

2.4 運輸后禁食與非禁食對肉兔行為的影響

由表4和表5可知，非禁食組肉兔進食頻次極顯著高于禁食組、食糞行為頻次極顯著低于禁食組(<0.01)，非禁食組進食行為和飲水行為的持續(xù)時間顯著高于禁食組(<0.05)，而食糞行為的持續(xù)時間顯著低于禁食組(<0.05)。

表4 非禁食和禁食對運輸后肉兔行為頻次的影響

表5 非禁食和禁食對運輸后肉兔行為時間的影響

3 討 論

3.1 運輸后非禁食對血清生化和血清激素的影響

運輸過程中產(chǎn)生的系列應激使動物體內的穩(wěn)態(tài)和代謝遭到破壞，導致血液中ALT、AST、CK、皮質醇、Glu、TP、乳酸等的濃度產(chǎn)生波動。公路運輸常會導致腎上腺皮質活動增加，血液中皮質醇的增加是衡量家畜心理壓力的一個指標，是高度可變的。Kannan等發(fā)現(xiàn)，綿羊血清皮質醇在運輸后0 h上升，靜養(yǎng)一段時間后又顯著下降，與本試驗結果一致。運輸過程中的捕獲、裝載和應激造成家畜肌肉融合不良、缺氧、疲勞，導致了肌膜通透性增加，細胞中AST、ALT、CK和LDH流失，而本試驗中肉兔血清ALT、AST和CK在運輸前后并沒有顯著的變化，可能是由于運輸前未禁食，營養(yǎng)相對充足，肉兔沒有饑餓感，抗拒較少的原因。在本試驗中，非禁食24 h組肉兔血清 CK濃度、禁食6 h組血清的LDH濃度顯著低于禁食組，而非禁食24 h組血清Glu顯著高于禁食組。CK催化高能磷酸鍵從ATP轉移到肌酸上的可逆反應，可以在能量匱乏期間維持適當?shù)腁TP/ADP比例以提供短期活動的能量。LDH作為糖酵解的關鍵酶會在運動后上升，也與細胞損傷有關。葡萄糖參與能量代謝，也可以作為量化應激的有效指標。糖異生與糖皮質激素的增加有關，在應激條件下糖原分解增加，血液中葡萄糖的濃度也隨之增加。本研究，肉兔血清CK、LDH和葡萄糖的數(shù)據(jù)表明，非禁食顯著改善了肉兔運輸后的能量匱乏與機體損傷。Parker等發(fā)現(xiàn)，家畜在運輸過程中脫水時，運輸后血液TP的濃度會增加。但本試驗中運輸卻導致TP濃度顯著下降，可能是由于試驗當天溫度(15～20 ℃)適宜，與de la Fuente等描述的運輸中高溫脫水導致的血液中TP上升的狀況不同，血清TP水平隨著血清皮質醇水平的降低逐漸升高。本試驗中，血清CK、LDH的變化趨勢與血清皮質醇相一致，TP的變化趨勢卻與血清皮質醇相反，對于它們之間的聯(lián)系還有待研究。

3.2 運輸后非禁食對肌肉肉品質的影響

屠宰前的應激會影響兔肉的品質。肌肉pH是衡量疲勞的有效指標，也與肉的嫩度、色澤密切相關。肌肉的糖原濃度隨著運輸應激的增加而不斷降低，屠宰后24 h肌肉pH取決于肌肉最初糖原的含量，肌糖原含量越低，pH越高。本試驗中肉兔在運輸應激下，肌糖原快速消耗導致肌肉pH顯著升高(<0.05)。Brown等發(fā)現(xiàn)，長途運輸后肌肉的pH增高，并在屠宰前仍保持較高的水平，與本試驗中運輸后6、24 h后肌肉pH仍較高的結果一致。然而，本研究中運輸后禁食、非禁食對肌肉pH影響并不顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，持水力依賴于肌肉的pHu(屠宰后24 h的pH)，當5.2

3.3 運輸后非禁食對肝JNK和Caspase-3 mRNA表達的影響

在運輸應激造成機體損傷的過程中，應激介導的細胞凋亡通路發(fā)揮了重要的作用。c-Jun N末端激酶(JNK)是MAPK家族的應激激活蛋白激酶，響應多種應激信號，與多種細胞事件有關，通過不同的下游效應物介導自噬與凋亡。-3是JNK下游重要的效應因子，觸發(fā)細胞調亡。本試驗中運輸后0 h肉兔肝組織-3的mRNA表達量顯著高于對照組(<0.05)，在6、24 h后-3 mRNA相對表達量逐漸下降，而禁食與非禁食組間沒有顯著差異。-3 mRNA的表達與血清皮質醇的濃度變化相一致，表明運輸應激激增導致細胞凋亡，應激的緩解會降低細胞凋亡。但是，的mRNA相對表達量與-3和皮質醇的mRNA表達量變化趨勢并不一致，說明JNK通路還可能介導了其他細胞活動如自噬的發(fā)生。自噬是循環(huán)利用細胞質內容物使機體適應饑餓的一種機制，在細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。自噬主要由mTOR通路調節(jié)，mTOR可以激活MAPK8/9，MAPK8/JNK1通過磷酸化BCL2，破壞了BCL2與BECN1的相互作用(BECN1與自噬相關)，并啟動BECN1依賴的自噬。本試驗中非禁食組肝組織中mRNA的相對表達量顯著低于禁食組，表明非禁食比長時間禁食更能有效減少機體由于細胞自噬和凋亡造成的損傷。

3.4 運輸后非禁食對肉兔行為的影響

行為是機體最重要的適應機制之一，是動物適應應激的身體防御，有助于減輕應激，也有可能因應激過強而導致機制性死亡。應激與行為緊密相連，刻板行為比如啃咬、籠子里踱步、過度修飾通常表明動物的無聊與應激。根據(jù)動物不正常行為的描述，家兔過度的社交、啃咬籠具和聞嗅行為都屬于刻板行為。本試驗中禁食組和非禁食組肉兔的社交、啃咬籠具和聞嗅行為并無顯著差異，表明非禁食并不能顯著改善肉兔的刻板行為，這與表3中血清皮質醇的結果相互印證，說明非禁食并沒有通過降低應激的方式改變刻板行為。禁食組食糞行為顯著提升，食糞行為是中小型食草動物在長期的適應性進化過程中為了滿足低營養(yǎng)條件下代謝需要的生理機制，正常的食糞行為能提高肉兔對蛋白質的消化吸收效率，減少腸道菌群及其所含的特殊蛋白質的流失，禁止食糞抑制肝脂質的合成，不利于家兔生長發(fā)育。本試驗中禁食組食糞行為比非禁食組多的原因一方面是對進食不足的替代，與表3中禁食組和非禁食組血清TG濃度變化的結果相印證，即禁食組肉兔通過食糞補充血液中脂質合成；另一方面是禁食組肉兔饑餓的表現(xiàn)，與禁食組JNK介導細胞自噬通路的顯著激活結果一致。非禁食則避免了饑餓，有利于提升肉兔的福利水平。

4 結 論

和禁食相比，運輸后24 h非禁食降低了肉兔的應激水平，提高了肌肉品質，并一定程度改善肉兔的福利水平。