肖 克，陳 婷，趙其平，朱順海，董 輝，劉曼玉，于 鈺，黃 兵，韓紅玉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

雞球蟲病是由幾種艾美耳球蟲寄生雞腸道引起的一種全球寄生蟲病，該病每年都會(huì)給世界各地的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞感染球蟲后會(huì)呈現(xiàn)精神萎靡、被毛蓬亂、食欲不振、糞便帶血等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)死亡。在幾種艾美耳球蟲中，柔嫩艾美耳球蟲()是最具致病性的蟲株之一。

目前，對(duì)球蟲病的控制主要依賴于藥物防治和使用強(qiáng)毒或減毒活卵囊疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。長(zhǎng)期以來(lái)，大規(guī)模使用抗球蟲藥物一直是一種高效的控制方法，然而，由于長(zhǎng)期及不合理地使用抗球蟲藥物，球蟲幾乎對(duì)所使用過(guò)的抗球蟲藥物都產(chǎn)生了耐藥性，且對(duì)新藥產(chǎn)生耐藥性的時(shí)間縮短，耐藥性的程度日趨嚴(yán)重，并由單一的抗性變?yōu)閷?duì)多種藥物的交叉耐藥性。在美國(guó)等市場(chǎng)，隨著大眾對(duì)“永遠(yuǎn)不使用抗生素”的食品需求的增長(zhǎng)，離子載體類抗球蟲藥物使用進(jìn)一步減少，這促使40%以上的生產(chǎn)者每年將疫苗接種納入一個(gè)或多個(gè)生產(chǎn)周期。球蟲活疫苗主要有強(qiáng)毒疫苗和弱毒疫苗兩種，強(qiáng)毒疫苗感染毒力較強(qiáng)，使用不當(dāng)易導(dǎo)致雞群感染球蟲，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致球蟲病的暴發(fā)，與強(qiáng)毒疫苗相比，弱毒疫苗由于采用一定方法使球蟲毒力顯著降低，提高了疫苗的安全性，但弱毒疫苗的研發(fā)需要花費(fèi)更多的資金，同時(shí)弱毒疫苗的穩(wěn)定性和毒力返強(qiáng)也是需要解決的問(wèn)題。球蟲活疫苗在蛋雞和種雞中應(yīng)用較為廣泛，肉雞由于飼養(yǎng)周期較短，接種疫苗產(chǎn)生免疫力需要一定時(shí)間，且疫苗接種后短期內(nèi)可能出現(xiàn)接種副反應(yīng)對(duì)雞群生產(chǎn)性能產(chǎn)生較大影響，因此在肉雞生產(chǎn)中主要還是使用抗球蟲藥對(duì)該病進(jìn)行防治。基于這些原因研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制變得尤為重要，雖然各國(guó)學(xué)者對(duì)球蟲耐藥性產(chǎn)生原因進(jìn)行了探索，但是耐藥性形成的分子機(jī)制至今不明。

對(duì)雞球蟲及其他頂復(fù)門原蟲的耐藥性研究發(fā)現(xiàn)部分基因在耐藥株中的表達(dá)與敏感株相比存在明顯的差異。如Mok等對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析， 發(fā)現(xiàn)與對(duì)青蒿素敏感的瘧原蟲相比，抗青蒿素瘧原蟲體內(nèi)參與未折疊蛋白反應(yīng)通路的兩個(gè)主要伴侶復(fù)合物——活性氧化應(yīng)激復(fù)合體和T-復(fù)合蛋白1環(huán)復(fù)合體表達(dá)增加。在瘧原蟲受到青蒿素作用后，主要通過(guò)這些伴侶復(fù)合物的上調(diào)表達(dá)，以加速去除細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中毒性蛋白的積累或者恢復(fù)這些蛋白的正確折疊，從而減輕青蒿素對(duì)蟲體的損害，但其分子機(jī)制目前還不清楚。青蒿素抗雞的作用與微線蛋白 (microneme, MIC)有關(guān)。Doliwa等采用差異凝膠電泳(DIGE)結(jié)合質(zhì)譜的方法來(lái)鑒定在弓形蟲磺胺嘧啶耐藥菌株中差異表達(dá)的蛋白，獲得68個(gè)差異表達(dá)蛋白，耐藥株中過(guò)表達(dá)蛋白為44%，敏感株中過(guò)表達(dá)蛋白為56%。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn),與敏感株相比，對(duì)磺胺嘧啶耐藥的弓形蟲體內(nèi)棒狀體激酶家族蛋白(ROP2A)上調(diào)表達(dá)，烯醇化酶2(enolase 2)和膜骨架蛋白(IMC1)下調(diào)表達(dá)。Bhandari等通過(guò)對(duì)10株耐銻和4株敏感利什曼原蟲臨床分離株中的表面抗原-2(PSA-2)基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在臨床分離的耐藥株中，PSA-2基因表達(dá)顯著升高(1.5倍)。Chen等利用 cDNA 微陣列技術(shù)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲莫能菌素耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株與敏感株的基因表達(dá)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)莫能菌素耐藥株與敏感株相比有 318 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，57 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；馬杜拉霉素耐藥株有 133 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，408 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

為深入研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期利用柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感株(DS)成功誘導(dǎo)出柔嫩艾美耳球蟲地克珠利耐藥株(DZR)和馬杜拉霉素耐藥株(MRR)，隨后對(duì)誘導(dǎo)的耐藥株和敏感株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白(HD domain-containing protein,HDCP)在耐藥株(DZR、MRR)中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于DS。HD結(jié)構(gòu)域是一種保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含一對(duì)組氨酸和天冬氨酸(HD)的保守殘基，它們的活性位點(diǎn)與金屬離子結(jié)合，主要執(zhí)行磷酸水解酶的活性。迄今為止，已經(jīng)鑒定出幾種HD結(jié)構(gòu)域蛋白，包括環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(cNMPPDEs)、脫氧鳥苷三磷酸水解酶(dGTPase)、tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、dNTP三磷酸水解酶(dNTPase)、大腸桿菌 5′-脫氧核糖核苷酸酶YfbR和嚴(yán)緊反應(yīng)四磷酸鳥苷(ppGpp)水解酶/合成酶(SpoT/RelA)；在真核生物和細(xì)菌古生菌中，研究發(fā)現(xiàn)一些含HD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核苷酸代謝等。為了分析柔嫩艾美耳球蟲含HD域蛋白的功能特性以及與藥物的關(guān)系，本研究克隆了柔嫩艾美耳球蟲HDCP、表達(dá)并純化了重組蛋白rHDCP，通過(guò)熒光定量PCR(qPCR)、Western blot、間接免疫熒光定位和體外抑制試驗(yàn)對(duì)該基因的分子特性和功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和質(zhì)粒

1日齡三黃雞購(gòu)自上海奉賢區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境確保無(wú)球蟲存在。8周齡新西蘭大白兔購(gòu)自上海甲干生物科技有限公司，6周齡BALB/c小鼠購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司。雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)和原核表達(dá)載體pGEX-4T-2均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存提供。

1.2 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感蟲株為本實(shí)驗(yàn)室保存的DS，該蟲株于20世紀(jì)80年代分離自上海市某雞場(chǎng)。DZR和MRR均由DS通過(guò)藥物誘導(dǎo)獲得，利用10日齡無(wú)球蟲雛雞對(duì)蟲株進(jìn)行大量繁殖、收集孢子化卵囊于2.5%的重鉻酸鉀中保存。

在無(wú)球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)1日齡三黃雞1周，經(jīng)檢查確定雛雞未被球蟲感染后，口服接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊5×10個(gè)·羽，7 d后從盲腸中收集未孢子化卵囊(unsporulated oocysts，UO)并進(jìn)行純化，孢子化卵囊(sporulated oocysts，SO)可通過(guò)UO體外氧化獲得。純化后的SO利用玻璃珠通過(guò)渦旋振蕩進(jìn)行體外脫囊，用膽汁和胰蛋白酶配制消化液消化孢子囊使子孢子(sporozoites，SZ)逸出，隨后對(duì)SZ進(jìn)行純化和收集。第二代裂殖子(second generation merozoites，SM)在雞接種SO后112 h可從其盲腸黏膜中收集純化獲得。

1.3 試劑

RNase-free DNase I、Trizol、2×Taq PCR Master Mix、SYBR green Ⅰ熒光染料(TaKaRa)；DNA膠回收試劑盒、DL2000(DNA Marker)、質(zhì)粒小提試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(天根)；RNA Easy Mini Kit、QIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN)；pGEM-T-Easy Vector、T4 DNA連接酶(Promega)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)；限制性核酸內(nèi)切酶：HⅠ和Ⅰ(美國(guó)NEB)；VybrantTM CFDA SE Cell Tracer Kit(Invitrogen)。

1.4 cDNA模板的制備和基因克隆

取適量實(shí)驗(yàn)室保存的柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊，根據(jù)Trizol說(shuō)明書上的步驟提取卵囊總RNA，隨后對(duì)總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。經(jīng)檢測(cè)符合要求后，將提取的總RNA按照M-MLV Reverse Transcriptase說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA第一鏈。根據(jù)HDCP基因(GenBank登錄號(hào)：XM_013378851.1)的編碼區(qū)(462 bp)序列，用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，其中，上游引物：5′-GCATGAGCGGAGAAGAAAG-3(HⅠ)，下游引物：5′-GCTTAAAAACTTGAAAATTTGAA-3′(Ⅰ)。以cDNA為模板，用上述所設(shè)計(jì)的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物膠回收后與pGEM-T-easy載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌()TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，于37 ℃培養(yǎng)13 h后挑取白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并送上海生工生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序結(jié)果與HDCP全長(zhǎng)序列進(jìn)行BLAST相似性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，使用ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具預(yù)測(cè)HDCP的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)。采用SignalP4.0(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TMHMM服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析HDCP基因編碼的蛋白有無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。隨后利用Motifscan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)對(duì)氨基酸序列含有的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.6 重組蛋白的表達(dá)、純化和多克隆抗體的制備

從測(cè)序正確的菌液中提取重組質(zhì)粒pGEM-HDCP，將pGEM-HDCP和原核表達(dá)載體pGEX-4T-2雙酶切后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，隨后回收目的片段進(jìn)行連接。連接成功的重組表達(dá)質(zhì)粒重命名為pGEX-4T-HDCP，經(jīng)PCR鑒定結(jié)合測(cè)序結(jié)果將確定正確的重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。將含重組質(zhì)粒pGEX-4T-HDCP的大腸桿菌菌液用1.0 mmol·LIPTG在37 ℃條件下于180 r·min的搖床中培養(yǎng)8 h進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，在加入IPTG后立即搖勻菌液并取出1 mL于4 ℃冰箱暫存作為0 h的對(duì)照。菌液培養(yǎng)結(jié)束取出1 mL誘導(dǎo)了8 h的菌液，用于分析蛋白的表達(dá)情況，剩下的菌液離心后用滅菌PBS重懸并在冰浴的條件下進(jìn)行超聲(超聲功率設(shè)置為300 W，以“啟動(dòng)5 s，停止3 s”的方式超聲30 min)，隨后通過(guò)SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式。在發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行切膠純化，并通過(guò)SDS-PAGE鑒定其純度，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后置于-80 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑乳化后，首次免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠。并用純化后的重組蛋白和弗氏不完全佐劑對(duì)上述動(dòng)物進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫。每只新西蘭大白兔每次免疫的蛋白劑量為200 μg，每只BALB/c小鼠每次免疫的蛋白劑量為50 μg。免疫結(jié)束后一周收集試驗(yàn)所需的動(dòng)物血清。

1.7 重組EtHDCP(rEtHDCP)蛋白的反應(yīng)原性分析

取適量純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，隨后置于5%脫脂奶粉中于4 ℃條件下過(guò)夜封閉。封閉結(jié)束后用PBS洗膜3次，隨后分別用兔抗子孢子全蛋白血清(1∶100稀釋)、抗GST標(biāo)簽單克隆抗體(1∶5 000稀釋)以及健康兔血清(1∶100稀釋)作為一抗于37 ℃孵育2 h，用PBS洗膜3次，然后用HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)或HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse(1∶10 000稀釋)作為二抗在室溫條件下于脫色搖床上緩慢輕搖孵育45 min，用PBS洗膜3次后再用顯影液孵育2 min,于ChemiDocTouch Imaging System 成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。兔抗子孢子全蛋白血清以及健康兔血清均由實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

1.8 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EtHDCP在DS四個(gè)不同發(fā)育階段中的轉(zhuǎn)錄水平

為研究基因HDCP在DS 4個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平差異，分別提取處于4個(gè)不同階段(UO、SO、SZ、SM)的總RNA，然后去除基因組DNA，將蟲體總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用DNA純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，將得到的終產(chǎn)物作為qPCR的模板。上游引物：5′-GATCATTCTTTCGGAGTTGCATTTC-3′，下游引物：5′-CGTTCGTATTCTTCCCAGAGTTCGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度269 bp；用18S RNA作為內(nèi)參，其上游引物：5′-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3′，下游引物：5′-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3′, 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度207 bp。利用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒通過(guò)ABI 7500定量PCR儀對(duì)HDCP在蟲體四個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，最終的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-ΔΔ的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行計(jì)算以獲得相對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.9 利用Western blot分析EtHDCP在DS 4個(gè)不同發(fā)育階段和不同蟲株的翻譯水平

取適量純化后的敏感株4個(gè)階段的蟲體(UO、SO、SZ、SM)于離心管中，加入RIPA強(qiáng)裂解液對(duì)蟲體進(jìn)行裂解，同時(shí)加入少許蛋白酶抑制劑抑制裂解蟲體過(guò)程中釋放出來(lái)的蛋白酶，防止提取的蛋白被其降解，隨后加入與蟲體等體積的玻璃珠將離心管于渦旋振蕩器進(jìn)行振蕩，按照振蕩2 min，冰浴30 s的方法間或振蕩60 min。之后于離心機(jī)中4 ℃條件下12 000 r·min離心10 min。上清即為提取的可溶全蛋白，取少量進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測(cè)蛋白的質(zhì)量，并用BCA試劑盒檢測(cè)濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣，使4個(gè)階段蟲體蛋白的含量一致，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，用兔抗HDCP多克隆抗體作為一抗進(jìn)行孵育，并用鼠抗α-Tubulin作為內(nèi)參，然后用相應(yīng)抗性的二抗進(jìn)行孵育。照膜后，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。利用同樣方法處理不同耐藥株和敏感株孢子化卵囊，分析HDCP在敏感株和不同耐藥株SO階段的蛋白翻譯水平。

1.10 EtHDCP的間接免疫熒光定位

提前將細(xì)胞飛片置于6孔板中，并于每孔中接種1.8×10個(gè)DF-1細(xì)胞，隨后放入37 ℃、5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，次日收集純化子孢子并以3∶1的比例接入細(xì)胞于41 ℃、5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，在子孢子入侵DF-1細(xì)胞2、12、24、48、60、72和84 h后各取出一個(gè)細(xì)胞板，用4%細(xì)胞固定液室溫固定30 min，并用PBS洗滌數(shù)次。之后用1% Triton X-100 在室溫條件下進(jìn)行通透30 min，PBS洗滌數(shù)次后，用2%胎牛血清白蛋白(BSA)4 ℃封閉過(guò)夜。兔抗rHDCP多克隆血清(1∶100稀釋)作為一抗37 ℃孵育2 h，隨后洗去一抗，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶500稀釋)避光孵育1 h， 洗滌數(shù)次后用10 μg·mLDAPI室溫標(biāo)記10 min， 洗滌數(shù)次后，用抗熒光淬滅劑封閉細(xì)胞飛片，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。用相同的方式處理沒(méi)有入侵DF-1細(xì)胞的子孢子和裂殖子。

1.11 兔抗rEtHDCP多克隆抗體對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的影響

試驗(yàn)前1 d，24孔板的每孔中接種2.0×10個(gè)DF-1細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。提取新鮮的子孢子用標(biāo)記液(CFDASE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑)進(jìn)行標(biāo)記15 min(CFDA SE是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，無(wú)毒性，不影響細(xì)胞活性)，隨后將其懸浮于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,用50、100、200、300、400 μg·mL的兔抗rHDCP多克隆抗體IgG37 ℃孵育2 h，用同樣濃度的健康兔IgG作為陰性對(duì)照，預(yù)留不用任何IgG孵育的標(biāo)記蟲體入侵DF-1細(xì)胞作為空白對(duì)照(通過(guò)流式細(xì)胞儀可獲得未經(jīng)抗體作用的子孢子入侵率，抗體作用的子孢子入侵抑制率需要利用該數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算)。孵育后的子孢子用含5%胎牛血清和3%雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸并加入到細(xì)胞中于41 ℃、5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中入侵8 h。最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算子孢子的入侵率[入侵抑制率=(1-抗體作用的子孢子入侵率/未經(jīng)抗體作用的子孢子入侵率)×100%]。

2 結(jié) 果

2.1 EtHDCP基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以DS蟲株的cDNA第一鏈為模板，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳獲得與目標(biāo)序列(462 bp)大小一致的擴(kuò)增條帶。隨后將回收的目的條帶與克隆載體pGEM-T-easy進(jìn)行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-HDCP，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞并經(jīng)藍(lán)白斑篩選后送公司測(cè)序。序列經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)該序列編碼的氨基酸與已知柔嫩艾美耳球蟲HD結(jié)構(gòu)域蛋白(HD-domain containing protein，GenBank：XM_013378851.1)的相似性為100%，與卡耶塔環(huán)孢子蟲()、布氏艾美耳球蟲()的HD結(jié)構(gòu)域蛋白的相似性分別為61%和71%，據(jù)此推測(cè)該蛋白屬于HDc超家族。由上述比對(duì)結(jié)果可知該基因成功克隆，并將其命名為HDCP。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，該基因編碼153個(gè)氨基酸，分子量為17.3 ku，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.8，其編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白含有1個(gè)-糖基化位點(diǎn)，6個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)細(xì)胞附著序列和1個(gè)雙核定位信號(hào)(圖1)。

星號(hào). 終止密碼子；單橫線. N-糖基化位點(diǎn)；綠色字體. 酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；灰色陰影. N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)；雙橫線. 蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；紅色字體. 細(xì)胞附著序列；波浪線. 雙核定位信號(hào)Sterisk. Stop codon; Transverse line. N-glycosylation site; Green. Casein kinase II phosphorylation site; Gray. N-myristoylation site; Double-line. Protein kinase C phosphorylation site; Red. Cell attachment sequence; Wavy line. Bipartite nuclear localization signal圖1 EtHDCP基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatic analysis of EtHDCP cDNA and deduced amino acids

2.2 重組蛋白的表達(dá)和多克隆抗體的制備

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-HDCP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示成功誘導(dǎo)表達(dá)了重組蛋白rHDCP，并且該蛋白以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)(圖2A、B)。隨后利用切膠的方式純化rHDCP，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明通過(guò)該方式可獲得較純的rHDCP融合蛋白(圖2C)。

用純化后的rHDCP免疫動(dòng)物并收集血清，隨后利用Protein A+G Agarose從兔抗血清中純化出多克隆抗體。并用SDS-PAGE對(duì)純化效果進(jìn)行檢測(cè)(圖2D)，結(jié)果顯示純化出的多克隆抗體有大、小兩條主要條帶(分別為55和25 ku)，即為IgG的重鏈和輕鏈，說(shuō)明IgG純化成功。

A. 重組蛋白的成功表達(dá)；B. 重組蛋白表達(dá)形式分析；C. 重組蛋白的純化；D. 多克隆抗體的制備; M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 純化后的 EtHDCP 重組蛋白; 2. 純化后的多克隆抗體A. Successful expression of recombinant protein; B. Analysis of expression forms of recombinant protein; C. The purification of recombinant protein; D. The preparation of polyclonal antibodies; M. Protein marker;1. Purified EtHDCP; 2. Purified polyclonal antibody圖2 EtHDCP重組蛋白的表達(dá)、純化以及多克隆抗體的制備Fig.2 The expression and purification of EtHDCP recombinant protein and preparation of polyclonal antibody

2.3 重組蛋白的反應(yīng)原性分析

以健康兔血清、兔抗子孢子全蛋白血清以及GST標(biāo)簽單克隆抗體為一抗對(duì)純化的rHDCP蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，以健康兔血清孵育的重組蛋白沒(méi)有條帶出現(xiàn)，而用兔抗子孢子全蛋白血清和GST標(biāo)簽單克隆抗體孵育的重組蛋白在43 ku處均出現(xiàn)了條帶(圖3)，說(shuō)明rHDCP反應(yīng)原性良好。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A. EtHDCP；1. 以陰性兔血清為一抗孵育；2. 以GST標(biāo)簽單抗為一抗孵育；3. 以兔抗子孢子血清為一抗孵育M. Protein marker; A. EtHDCP; lane 1. Rabbit IgG as first antibody; lane 2. GST-tag monoclonal antibody as first antibody; lane 3. Anti-sporozoite polyclonal sera as first antibody圖3 重組蛋白抗體的反應(yīng)原性分析Fig.3 Reactionogenicity of recombinant protein

2.4 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個(gè)不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以基因18S rRNA為內(nèi)參，對(duì)HDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株不同發(fā)育階段(UO、SO、SZ、SM)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示該基因在SM階段的轉(zhuǎn)錄水平最高，而其他三個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄水平都極低(圖4A)。

A. EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平；B、C. EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)發(fā)育階段的翻譯水平[Western blot(M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))及其灰度分析]。柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)A. Transcription levels of EtHDCP in four developmental stages of E.tenella； B, C. Translation levels of EtHDCP in four developmental stages of E. tenella， Western blot (M. Protein marker) and its gray scale analysis. Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05)圖4 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平Fig.4 Transcription and translation levels of EtHDCP in 4 developmental stages of E.tenella

通過(guò)Western blot對(duì)天然HDCP在柔嫩艾美耳球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段的蟲體全蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以鼠抗α-Tubulin作為試驗(yàn)所用內(nèi)參。天然HDCP蛋白大小在17 ku左右，結(jié)果顯示HDCP蛋白在SM階段的翻譯水平最高，而其在另外3個(gè)階段的表達(dá)量都很低(圖4B、C，其中,圖4C為圖4B的灰度值分析結(jié)果)，與qPCR結(jié)果一致。

2.5 EtHDCP在柔嫩艾美耳球蟲敏感株和不同耐藥株中的翻譯水平

提取DS、DZR、MRR孢子化卵囊全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜并用鼠抗rHDCP多克隆抗體血清(1∶100稀釋)作為一抗進(jìn)行孵育，以稀釋后的IRDye 680RDanti-IgG作為二抗(1∶5 000稀釋)進(jìn)行孵育，并用鼠抗α-Tubulin作為試驗(yàn)所用內(nèi)參。通過(guò)Image J軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，發(fā)現(xiàn)HDCP蛋白與DS相比，在DZR、MRR中均為上調(diào)表達(dá)(圖5)。

*.P<0.05圖5 敏感株和耐藥株EtHDCP基因的蛋白翻譯水平 (Western blot及其灰度分析)Fig.5 Protein translation levels of EtHDCP gene in sensitive strain and drug-resistant strains (Western blot and its gray scale analysis)

2.6 EtHDCP蛋白在蟲體上的定位分析

依次用兔抗rHDCP多克隆抗體血清(1∶100稀釋)、FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶500稀釋)孵育封閉固定好的細(xì)胞爬片，并用DAPI核染色液(1∶500稀釋)進(jìn)行標(biāo)記，隨后用熒光顯微鏡觀察處理好的細(xì)胞爬片，分析HDCP蛋白在柔嫩艾美耳球蟲SZ、SM以及SZ體外入侵DF-1細(xì)胞后不同發(fā)育階段的定位情況(用健康兔血清作為陰性對(duì)照)。結(jié)果如圖6所示：該蛋白廣泛分布于SZ表面以及SM的表面和細(xì)胞質(zhì)；當(dāng)SZ入侵DF-1細(xì)胞2 h 后，蛋白也主要位于蟲體表面，隨著蟲體在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育為滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、成熟裂殖體和第一代裂殖子(24、48、60、72和84 h)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。表明蟲體入侵細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中HDCP的表達(dá)量升高。

A. 重懸于PBS的子孢子；B. 重懸于PBS的裂殖子；C. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞2 h；D. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞24 h發(fā)育為滋養(yǎng)體；E. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞48 h發(fā)育為未成熟裂殖體；F. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞60 h發(fā)育為未成熟裂殖體；G. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞72 h發(fā)育為成熟裂殖體；H. 子孢子入侵DF-1細(xì)胞84 h發(fā)育為第一代裂殖子；I. 健康兔IgG孵育的子孢子A. Sporozoites (SZ) in PBS; B. Second generation merozoites (SM) in PBS; C. At 2 hpi, intracellular sporozoites (iSZ); D. At 24 hpi, trophozoites; E. At 48 hpi, immature Schizonts； F. At 60 hpi, immature schizonts; G. At 72 hpi, mature schizonts; H. At 84 hpi, first generation Merozoites；I. SZ incubated with healthy rabbit IgG圖6 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)EtHDCP在不同發(fā)育階段的分布Fig.6 Indirect immunofluorescence assay for detection of distribution of EtHDCP at different stages of development

2.7 抗rEtHDCP多克隆抗體對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞的體外抑制試驗(yàn)

結(jié)果顯示，隨著抗體濃度的增加，兔IgG對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞無(wú)明顯作用，其抑制率在0左右。而抗rHDCP多克隆抗體對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞有明顯的抑制作用，其抑制率隨著抗體濃度的增加而增加，在抗體濃度為400 μg·mL時(shí)可達(dá)到40%(圖7)。

*.P<0.05圖7 抗rEtHDCP多克隆抗體對(duì)子孢子侵入細(xì)胞的抑制試驗(yàn)Fig.7 Inhibition of sporozoite invasion in vitro by anti-rEtHDCP

3 討 論

為了做好球蟲耐藥性的檢測(cè)和球蟲病的防治工作，使得深入了解球蟲耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制變得尤為重要。為此，實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)DS、DZR、MRR進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果顯示，與DS相比，HDCP在耐藥株中上調(diào)表達(dá)[logRatio(DZR/DS)為5.98，logRatio(MRR/DS)為5.64]，該基因在耐藥株中的差異表達(dá)可能與其對(duì)抗球蟲藥產(chǎn)生耐藥有關(guān)。細(xì)胞抑制劑脫氧胞苷類似物阿糖胞苷(Ara-C)是一種可有效治療急性髓系白血病(AML)的化學(xué)療法抗癌藥物，Schneider等指出含有相同HD結(jié)構(gòu)域的新型腫瘤抑制因子無(wú)菌α基序和含HD結(jié)構(gòu)域的蛋白1(SAMHD1)能去除阿糖胞苷活性形式的磷酸鹽殘留物，從而將其逆轉(zhuǎn)成失活狀態(tài)；此外研究人員還發(fā)現(xiàn)，抑制SAMHD1能有效地增加阿糖胞苷抗性AML細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷化療的敏感性。這提示HDCP可能與SAMHD1具有類似的功能，該基因在耐藥株中的高表達(dá)可能是藥物作用的結(jié)果。

本研究成功克隆了HDCP基因，通過(guò)對(duì)其生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HDCP含有1個(gè)-糖基化位點(diǎn)，6個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)細(xì)胞附著序列和1個(gè)雙核定位信號(hào)。細(xì)胞膜表面蛋白的-糖基化參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及免疫逃逸等功能。酪蛋白激酶Ⅱ(CKII)是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在體內(nèi)通過(guò)對(duì)底物的磷酸化在細(xì)胞增殖分化和凋亡、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(NMT)是一種細(xì)胞溶質(zhì)單體酶, 主要參與二級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、病毒成熟和腫瘤形成等一些重要的生物學(xué)過(guò)程。蛋白激酶C(PKC)是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，起著將細(xì)胞表面配體-受體相互作用產(chǎn)生的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核的作用；PKC 的激活將觸發(fā)其下游不同信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化等功能。HDCP蛋白存在的糖基化位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)以及磷酸化位點(diǎn)，提示著該蛋白通過(guò)翻譯后修飾發(fā)揮重要功能，可能在蟲體的增殖、對(duì)宿主細(xì)胞的入侵以及逃逸宿主的免疫等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

Western blot分析發(fā)現(xiàn)HDCP在兩個(gè)耐藥株中的蛋白翻譯水平均高于DS，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致，這可能是HDCP參與球蟲抵抗外界的藥物壓力所造成的。據(jù)報(bào)道釀酒酵母中含有多個(gè)HD結(jié)構(gòu)域蛋白，包括30,50-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶2(PDE2)、DNA損傷誘導(dǎo)氰化酰胺水合酶DDI2和DDI3，PDE2通過(guò)控制酵母細(xì)胞胞外cAMP的水平來(lái)保護(hù)細(xì)胞，DDI2或DDI3參與解毒和/或利用環(huán)境中有毒的腈化合物氰酰胺。有研究發(fā)現(xiàn)，在AML異種移植小鼠模型中，與缺乏SAMHD1功能的小鼠相比，Ara-C對(duì)SAMHD1功能良好的小鼠治療效果更好。此外，使用以SAMHD1為靶點(diǎn)的慢病毒蛋白X(Vpx)在原發(fā)性AML細(xì)胞中耗盡SAMHD1，增加了Ara-C的敏感性。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能是由于蟲體內(nèi)HDCP的高表達(dá)影響了相關(guān)水解反應(yīng)的發(fā)生，加速了細(xì)胞內(nèi)藥物的水解，從而提高球蟲對(duì)藥物的耐受力。

q-PCR和Western blot分析顯示，HDCP在第二代裂殖子階段高表達(dá)，而在其他發(fā)育階段表達(dá)量相對(duì)較低，熒光定位也顯示蟲體在細(xì)胞內(nèi)的裂殖生殖發(fā)育階段熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。裂殖生殖是在雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)完成發(fā)育的，裂殖子從裂殖體中釋放的過(guò)程會(huì)對(duì)腸上皮細(xì)胞造成損傷，釋放出來(lái)的裂殖子會(huì)進(jìn)入新的腸上皮細(xì)胞再次進(jìn)行裂殖生殖，如此周而復(fù)始可以進(jìn)行多次裂殖生殖，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞。因此作者推測(cè)HDCP在裂殖子階段的大量表達(dá)可能與其進(jìn)行裂殖生殖和逃逸宿主免疫有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細(xì)胞中CKII存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的增高，以及激酶活性的增加，與已報(bào)道的CKII促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞凋亡的作用一致。由于HDCP蛋白含有CKII磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)裂殖子可能通過(guò)CKII對(duì)高表達(dá)的HDCP蛋白進(jìn)行底物磷酸化促進(jìn)了其在宿主體內(nèi)完成裂殖生殖過(guò)程。除此之外，HDCP蛋白中的-糖基化位點(diǎn)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)都與細(xì)胞增殖有關(guān)，它們可能通過(guò)蛋白的翻譯后修飾作用也參與了蟲體的裂殖生殖過(guò)程。有研究表明，-糖基化結(jié)構(gòu)可以與凝集素結(jié)合，影響T細(xì)胞的激活、信號(hào)傳導(dǎo)和存活，如半乳糖凝集素能夠結(jié)合相關(guān)的-糖基化受體，通過(guò)影響T細(xì)胞的激活、信號(hào)傳導(dǎo)和存活從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)程序性死亡配體1(PD-L1)在N35、N192、N200和N219位點(diǎn)發(fā)生-糖基化，這一代謝過(guò)程能夠通過(guò)拮抗糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)與PD-L1的結(jié)合，阻止PD-L1降解來(lái)提高自身穩(wěn)定性。由于HDCP蛋白中含有-糖基化位點(diǎn)，作者推測(cè)該蛋白可能通過(guò)-糖基化作用完成對(duì)宿主的免疫逃逸。

間接免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞質(zhì)內(nèi)，而且隨著蟲體在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育為滋養(yǎng)體和裂殖體，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明蟲體入侵細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中HDCP的表達(dá)量升高，與q-PCR和Western blot試驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)Signal P和TMEMM預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。Kopeckova等通過(guò)對(duì)致病細(xì)菌中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的多樣性定位和蛋白質(zhì)結(jié)合能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH可在細(xì)菌表面或細(xì)菌細(xì)胞外檢測(cè)到，并與宿主蛋白相互作用，而GAPDH序列缺乏任何已知的胞外溶解轉(zhuǎn)運(yùn)識(shí)別基序(如N端信號(hào)序列、六肽排序基序或C端疏水尾)，推測(cè)該蛋白定位于除細(xì)胞質(zhì)外的其他部位是通過(guò)翻譯后修飾完成的。作者推測(cè)缺乏信號(hào)肽和跨膜區(qū)的HDCP可能也是通過(guò)翻譯后修飾的方式實(shí)現(xiàn)其在蟲體表面的定位。除此之外，Péroval等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲熱休克蛋白90在子孢子表面、納蟲空泡以及蛋白復(fù)合物中均有檢測(cè)到，而該蛋白也沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，該蛋白最初與宿主細(xì)胞相互作用產(chǎn)生了一連串的事件，從而幫助蟲體入侵宿主細(xì)胞，Hsp90可能在信號(hào)傳遞的級(jí)聯(lián)過(guò)程中發(fā)揮作用，允許其與頂端分泌蛋白結(jié)合并以異復(fù)合物的形式維持分泌。因此，作者推測(cè)HDCP也可能和Hsp90具有類似的機(jī)制，通過(guò)與其他分泌蛋白結(jié)合在入侵過(guò)程中完成自身的釋放，體外抑制試驗(yàn)也證實(shí)HDCP參與了子孢子入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程。然而HDCP的具體分泌機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

通過(guò)體外抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗rHDCP多克隆抗體可明顯抑制球蟲子孢子對(duì)DF-1細(xì)胞的入侵。姜連連等首次報(bào)道了柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1(AMA1)，熒光定位發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在子孢子的頂端和表面，體外抑制試驗(yàn)顯示抗AMA1多克隆抗體處理過(guò)的子孢子對(duì)DF-1細(xì)胞的入侵率下降了70%，表明AMA1對(duì)球蟲入侵宿主細(xì)胞起重要的作用。于鈺等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)子孢子入侵DF-1細(xì)胞后，柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(STP)位于子孢子的表面和帶蟲空泡膜(PV)上，且在耐藥株高表達(dá)，抗rSTP多克隆抗體能顯著降低子孢子入侵DF-1細(xì)胞。劉桂玲等通過(guò)對(duì)柔嫩艾美球蟲表面抗原10(SAG10)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兔抗rSAG10對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的抑制率隨著抗體濃度的增加而增加，在抗體濃度為400 μg·mL時(shí)入侵抑制率可達(dá)60%。相比之下，兔IgG對(duì)入侵沒(méi)有明顯的抑制作用。因此作者推測(cè)抗rHDCP多克隆抗體可能與定位在蟲體表面的HDCP蛋白發(fā)生反應(yīng)，破壞了該蛋白對(duì)蟲體的保護(hù)作用，從而抑制了其對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。

4 結(jié) 論

克隆柔嫩艾美耳球蟲HDCP基因，表達(dá)獲得重組蛋白rHDCP并對(duì)其分子特性和基本功能進(jìn)行了探究。HDCP定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞質(zhì)內(nèi)，并且在裂殖子階段高表達(dá)，其在耐藥株(DZR和MRR)中的表達(dá)水平顯著高于敏感株。此外，體外抑制試驗(yàn)顯示抗rHDCP多克隆抗體可明顯抑制子孢子對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。這些結(jié)果表明HDCP可能在蟲體的發(fā)育、耐藥性的產(chǎn)生以及其對(duì)宿主細(xì)胞的入侵過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。