基于SSR標(biāo)記與化學(xué)成分構(gòu)建十堰地區(qū)天師栗核心種質(zhì)庫＊

劉志格，葉利春，熊 超，劉義飛，鄭國華，石召華，胡志剛，許 攀 ，施 川 ，4＊＊，張景景 ＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 武漢 430023；3. 武漢愛民制藥股份有限公司 鄂州 436070；4. 湖北李時珍藥物研究有限公司 鄂州 436070）

天師栗（Aesculus chinensisvar.wilsonii）是七葉樹科七葉樹屬落葉喬木，主要產(chǎn)于河南西南部、湖北西部、四川東部等地[1]，是《中國藥典》（2020 版）收載的中藥材娑羅子的基原植物之一[2]。娑羅子具有疏肝理氣，和胃止痛的功效，用于治療肝胃氣滯，胸腹脹悶，胃脘疼痛等。歷代本草中記載其功效有《肘后備急方》、《藥性考》等，主治心腹痛，宿食不消，胃脘脹痛、癰疽疔腫，解毒等[3-4]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明其主要藥用成分為七葉皂苷，具有抗炎、抗?jié)B出、提高毛細(xì)血管的張力、加快靜脈回流、改善血液循環(huán)等藥理作用[5-8]，臨床上常用于腦水腫、傷口腫脹及靜脈回流障礙性疾病的治療[9-14]，近年較多學(xué)者探索發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉對坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷所致神經(jīng)性疼痛的改善[15]、治療慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）合并肺心病心力衰竭改善患者肺功能[16]、對糖尿病大鼠心臟自主神經(jīng)病變的減弱[17]等作用。已在國內(nèi)外上市的七葉皂苷系列制劑如七葉皂苷鈉凍干粉針劑、搽劑、復(fù)方凝膠、片劑、膠囊等劑型被廣泛用于治療心腦血管系統(tǒng)、軟組織損傷和其他滲出性疾病，國外也開發(fā)用于緩解運(yùn)動后肌肉局部酸痛的外用乳霜[18]等。隨著上述產(chǎn)品臨床應(yīng)用范圍和市場規(guī)模的擴(kuò)大，市場對娑羅子中藥材需求量逐年上漲。目前娑羅子藥材多為野生資源，極少量為引種栽培，由于缺乏系統(tǒng)的種質(zhì)資源保護(hù)和規(guī)范化種植技術(shù)研究，引種混亂，導(dǎo)致藥材基原混亂，導(dǎo)致娑羅子藥材品質(zhì)良莠不齊，偽品摻雜使用常見，無法滿足監(jiān)管法規(guī)要求及市場需求。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和理論的快速發(fā)展，對藥品的監(jiān)管日趨科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)，要求固定其基原、產(chǎn)地等，以保證原料質(zhì)量穩(wěn)定[19]。據(jù)《本草綱目》記載，十堰所產(chǎn)娑羅子即是宋代《益部方物略記》中記載的天師栗，表明十堰地區(qū)為天師栗道地產(chǎn)區(qū)之一[20]，國內(nèi)已有學(xué)者對娑羅子藥材資源開展了品質(zhì)評價等研究，湖北十堰地區(qū)的娑羅子品質(zhì)優(yōu)良[21]。但還未見有報道基于分子標(biāo)記結(jié)合化學(xué)成分篩選娑羅子優(yōu)良種質(zhì)的研究，在道地產(chǎn)區(qū)篩選優(yōu)良的種質(zhì)資源，構(gòu)建天師栗的核心種質(zhì)庫，篩選出優(yōu)良的天師栗種質(zhì)資源對七葉皂苷鈉系列藥品的生產(chǎn)企業(yè)從源頭保證優(yōu)質(zhì)中藥材的品質(zhì)尤為重要。近年較多的學(xué)者基于簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat, SSR）分子標(biāo)記，開展藥用植物的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種鑒別、遺傳連鎖圖譜等研究,其是基于串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性的技術(shù)，其具有結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富等特點[22]，可為藥用植物育種和種質(zhì)資源保護(hù)等提供基因資源和材料選擇[23-28]。本研究收集了湖北十堰娑羅子產(chǎn)區(qū)的114 份天師栗種質(zhì)，根據(jù)天師栗近緣物種七葉樹基因組開發(fā)高多態(tài)性SSR 分子標(biāo)記，結(jié)合遺傳多樣性數(shù)據(jù)和有效成分七葉皂苷A 和七葉皂苷B 的含量，構(gòu)建十堰地區(qū)天師栗的核心種質(zhì)庫。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇湖北十堰地區(qū)三個居群共114 份生長良好且已掛果的天師栗為研究對象，詳細(xì)記錄地理位置，于展葉期采集其幼葉，用硅膠干燥保存后用于總DNA提取。于白露采集果實，用于成分含量檢測。所有樣本經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)胡志剛教授鑒定為天師栗（A.chinensisvar.wilsonii）。

1.2 基因組DNA提取

取約30 mg 天師栗葉片，按改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，Cetyltrimethylammonium Bromide，）法提取DNA，利用NanoDrop 超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳評估基因組DNA的總量和質(zhì)量，合格后調(diào)整每份樣品DNA 濃度至50 ng·μL-1，并保存至-20℃冰箱中備用。

1.3 SSR引物的篩選和PCR擴(kuò)增

利用MISA（微衛(wèi)星識別工具，MIcro SAtellite identification tool）軟件，以天師栗近緣種七葉樹基因組DNA 為參考進(jìn)行SSR 位點篩選，在Primer3.0 軟件中進(jìn)行SSR 引物設(shè)計，引物設(shè)計完成后合成熒光引物。PCR 反應(yīng)體系總體積為 10 μL，含 DNA 模板 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 5μL、正向引物 0.04 μL、反向引物 0.25 μL、M13 通用引物 0.15 μL、DDH2O 2.6 μL。PCR 反應(yīng)程序為：預(yù)變性（95℃，5 min），變性（95℃，30 s），退火（50-55℃，30 s），延伸（72℃，30 s），共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4 核心種質(zhì)庫構(gòu)建

采用最小距離逐步取樣策略（the least distance stepwise sampling strategy，LDSS），結(jié)合遺傳多樣性數(shù)據(jù)和有效成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行取樣，連續(xù)去除遺傳相似性大且有效成分含量相對較低的種質(zhì)，多次聚類直至獲得占總種質(zhì)資源50%的第一個核心種質(zhì)，再按照相同方法依次獲得分別占總種質(zhì)資源40%、30%、20%、10%的4 個核心種質(zhì)。對上述初步得到的5 個比例的核心種質(zhì)庫進(jìn)行遺傳多樣性評價，結(jié)合遺傳多樣性與七葉皂苷含量確定最終核心種質(zhì)，并利用SPSS軟件對原始種質(zhì)與核心種質(zhì)、原始種質(zhì)與保留種質(zhì)進(jìn)行T檢驗，以驗證最終核心種質(zhì)是否具有顯著性差異。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Popgen1.32軟件對以下遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行評估，包括：等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon’s 信息指數(shù)（I）、近交系數(shù)（Fis）、遺傳分化系數(shù)（Fst）、基因流（Nm）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）；利用PIC_CALC 軟件計算多態(tài)性信息含量（PIC）；使用NTsys1.2 軟件基于UPGMA 進(jìn)行聚類分析；采用GenALEx 6.5軟件進(jìn)行PCoA 和 AMOVA 分析；采用 Structure3.0 軟件進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于SSR標(biāo)記分析天師栗的遺傳多樣性

2.1.1 SSR分子標(biāo)記開發(fā)

采用天師栗的近緣種七葉樹的全基因組序列，共發(fā)掘出57,349 個SSR 位點，以復(fù)合形式存在的SSR 有7,246 個。從基因組染色體序列總共獲得PCR 擴(kuò)增效果好、多態(tài)性高的SSR引物13對（表1）。

表1 13對SSR引物信息

2.1.2 SSR位點的多態(tài)性水平檢測

13 對SSR 位點在114 份天師栗種質(zhì)中共擴(kuò)增出94 個等位基因（表2），等位基因（Na）數(shù)量從2（SQ7 和SQ8）到 15（SQ18）不等，平均擴(kuò)增出7.2308 個等位基因；有效等位基因（Ne）的范圍從 1.4824（SQ6）至9.9624（SQ18），平均值為3.3712；觀測雜合度（Ho）和預(yù)期雜合度（He）的范圍分別是0.2368（SQ6）-0.7105（SQ22）和0.3268（SQ6）-0.9036（SQ18），平均值分別為0.5067 和0.6059；13 個位點的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）范圍在0.3134（SQ6）-0.8911（SQ18）之間，平均值為0.5593，表明所選SSR 位點具有較高的多態(tài)性。Shannon’s 信息指數(shù)（I）的變化范圍是0.6270（SQ8）-2.4446（SQ18），平均值為1.2679。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）平均為0.6032。基因流（Nm）水平為2.2634（SQ30）-15.1299（SQ53）。遺傳分化系數(shù)（Fst）和近交系數(shù)（Fis）分別為0.0406 和0.1374。以上結(jié)果表明，天師栗的遺傳分化水平較小，存在著較大的基因流。其中，SQ6 和SQ18 具有較高的識別效率及鑒定效率，將在未來娑羅子DNA 指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和品種鑒定中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表2 篩選出的13對SSR引物的多態(tài)性水平

2.1.3 天師栗居群遺傳多樣性分析

在3 個居群中，周家壩居群擴(kuò)增出最多的等位基因（6.6154）和有效等位基因（3.3270），且Shannon’s 信息指數(shù)（1.2460）最高，表明在3 個采樣點中，周家壩居群擁有較豐富的遺傳變異。普齡的遺傳多樣性最低（表3）。AMOVA 分析結(jié)果顯示，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)部（95%），只有5%的變異發(fā)生在居群間（表4）。3 個居群間遺傳分化較小（0.024-0.105），表明存在著較大的基因流。其中，周家壩和遼葉居群間具有較近的遺傳親緣關(guān)系（表5）。

表3 天師栗3個居群的遺傳統(tǒng)計情況

表4 天師栗3個居群的分子方差分析（AMOVA）分析

表5 3個天師栗居群間的成對遺傳分化系數(shù)矩陣

2.1.4 天師栗居群遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過對基因分型得到的SSR 等位基因數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析和UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)114份天師栗樣本未明顯的劃為不同的亞群（圖1-圖2）。

圖1 天師栗主坐標(biāo)分析圖

圖2 114份天師栗樣本UPGMA構(gòu)建聚類樹

2.2 不同種質(zhì)的娑羅子七葉皂苷的含量測定

2.2.1 方法學(xué)考察

用甲醇制備七葉皂苷鈉對照品儲備液，濃度為4.30 mg·mL-1，并逐級稀釋成每 1 mL 含七葉皂苷 A 1.44 mg、0.72 mg、0.36 mg、0.18 mg、0.09 mg，含七葉皂苷 B 1.35 mg、0.675 mg、0.3375 mg、0.1688 mg、0.0844 mg，參照2020 版《中華人民共和國藥典》娑羅子中含量測定項下[5]，記錄色譜峰面積。七葉皂苷A 的回歸方程為：y=7,279,566x+136,717（R2=0.9997）；七葉皂苷B 的 回 歸 方 程 為 ：y= 6,176,833x + 125,733（R2=0.9997），表明七葉皂苷A 和七葉皂苷B 線性良好；制備供試品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，七葉皂苷A 和七葉皂苷B 的峰面積RSD 值分別為0.52%、0.43%，結(jié)果表明儀器精密度良好；將供試品溶液分別放置0、4、8、12、24、36 h 后開展穩(wěn)定性考察，得到七葉皂苷 A 和七葉皂苷B 峰面積的RSD 值分別為0.62%和0.58%，表明在36 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好；平行制備6 份供試品溶液，七葉皂苷A 和七葉皂苷B 的峰面積的RSD值分別為1.27%、1.22%，結(jié)果表明該測定方法重復(fù)性良好。制備9份供試品溶液，分三組，每組分別加入相當(dāng)于含七葉皂苷濃度50%、100%、150%的對照品溶液，七葉皂苷A、七葉皂苷B 平均回收率分別為99.87%，100.31%，RSD 分別為1.28%，1.04%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.2.2 不同種質(zhì)娑羅子有效成分含量測定

114 份娑羅子樣品按上述方法制備娑羅子樣品供試品溶液，計算每份娑羅子藥材中七葉皂苷A 和七葉皂苷B的含量（%），3個居群的兩種七葉皂苷化合物含量測定結(jié)果見表6。3 個居群的娑羅子藥材均達(dá)到了2020 版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的含量要求，即七葉皂苷A 含量不低于0.7%。其中周家壩居群中娑羅子的七葉皂苷A 和七葉皂苷B 含量均最高，而在遼葉居群中含量均最低。

表6 3個居群的七葉皂苷A及七葉皂苷B含量測定結(jié)果

2.3 天師栗核心種質(zhì)庫構(gòu)建

2.3.1 核心種質(zhì)庫的初步構(gòu)建及評價

采用LDSS 取樣策略基于遺傳距離進(jìn)行逐步聚類，在全部樣本中不斷刪除遺傳相似性大且有效成分較低的樣本，多次聚類后分別得到57 份、46 份、34 份、23 份、5 份，分別占原始種質(zhì)的50%、40%、30%、20%、10%（表7）。隨著取樣比例的減小，等位基因數(shù)量（Na）逐漸降低，觀察雜合度（Ho）、預(yù)期雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）和Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）分別在0.5734-0.5067、 0.6593-0.6059、 1.3170-1.2594 和0.6400-0.6032 范圍內(nèi)變化。遺傳參數(shù)值除等位基因數(shù)量（Na）和有效等位基因數(shù)量（Ne）外，其余均在抽樣4 中達(dá)到最大值，表明取樣比例為20%時更豐富的遺傳多樣性被保留，最終確定20%抽樣比例下的23份種質(zhì)作為核心種質(zhì)。

表7 不同取樣比例下原始種質(zhì)和五個初步核心種質(zhì)的遺傳多樣性特征

2.3.2 核心種質(zhì)的檢驗及評價

T檢驗結(jié)果表明20%抽樣比例下的核心種質(zhì)在遺傳上與原始種質(zhì)間無顯著性差異（α=0.05），且遺傳多樣性參數(shù)值均高于原始種質(zhì)，表明20%抽樣比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)可以充分代表原始種質(zhì)的遺傳變異，且相對于原始種質(zhì)來說具有更加豐富的遺傳多樣性。3個居群在該核心種質(zhì)中均有保留，其中周家壩居群保留種質(zhì)最多，有12 份，遼葉居群保留6 份、普齡居群保留5份（表8）。

表8 原始種質(zhì)和核心種質(zhì)的Ne，I，H的T檢驗結(jié)果

3 討論

本研究篩選出了13 對高多態(tài)性SSR 分子標(biāo)記用于不同種質(zhì)資源的天師栗遺傳多樣性分析，對十堰地區(qū)3 個居群114 份天師栗樣品進(jìn)行SSR-PCR 擴(kuò)增，共擴(kuò)增得到94個等位基因，平均擴(kuò)增出6.5個等位基因；物種水平上觀測雜合度和期望雜合度分別為0.4233和0.5035；13個SSR位點的F統(tǒng)計量檢測顯示，天師栗的遺傳分化水平很??；各位點的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）平均值為 0.4653，表明 13 個SSR 位點均具備較高的多態(tài)性。在3 個居群中，天師栗種質(zhì)在周家壩居群中具有更豐富的遺傳變異，且居群間可能發(fā)生較高水平的基因流動，其種子娑羅子作為注射用七葉皂苷鈉中藥材原料，從遺傳角度保持較小差異，固定基原及固定種植基地，有利于從源頭控制藥材品質(zhì)。但持續(xù)的高水平基因流動會極大地減弱種群間的遺傳變異，不利于物種延續(xù)，也會引起種質(zhì)退化，需引進(jìn)其他區(qū)域優(yōu)質(zhì)天師栗種群以增加該地區(qū)天師栗種群的多樣性。

娑羅子含有皂苷類、黃酮類、有機(jī)酸類等多種化合物，主要有效藥用成分為七葉皂苷類化合物[29-31]。本研究以七葉皂苷A、七葉皂苷B 為評價指標(biāo)，114 份娑羅子藥材中七葉皂苷A 的平均含量（3.99%）遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，七葉皂苷B 的平均含量為2.66%；3 個居群中的娑羅子藥材的七葉皂苷A 的含量均達(dá)到且高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中周家壩居群兩種成分的含量最高，而遼葉的最低，表明周家壩的娑羅子藥材質(zhì)量比普齡和遼葉的好，為下一步該地區(qū)品種選育提供參考。

核心種質(zhì)可有效地代表原始種質(zhì)的特征并保留豐富的遺傳多樣性[32]。對于中藥材而言，在構(gòu)建核心種質(zhì)庫時，應(yīng)綜合遺傳參數(shù)和有效成分兩個指標(biāo)。最小距離逐步采樣策略（LDSS）方法在很多核心種質(zhì)庫構(gòu)建中被使用，且具有較好的可行性[33]。LDSS 方法在對遺傳相似性較高的材料進(jìn)行選擇時，會優(yōu)先保留有效化學(xué)成分相對豐富的個體，同時保留遺傳變異豐富的材料。本研究最終得到34 份核心種質(zhì)，占原始種質(zhì)的20%，且3 個居群均有種質(zhì)保留。本研究將為天師栗的遺傳資源保護(hù)、新品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新提供科學(xué)依據(jù)。