付寬寬，王小兵，汪曉麗，陳 悅，程 通

（揚州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇揚州 225127）

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化調(diào)整，我國設(shè)施農(nóng)業(yè)也迎來了高速發(fā)展期。其中，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)更是從粗放型逐漸向集約型轉(zhuǎn)變。因為設(shè)施蔬菜種植環(huán)境的密閉性和模式的單一性，導(dǎo)致設(shè)施蔬菜連作現(xiàn)象嚴(yán)重，很容易出現(xiàn)土壤質(zhì)量退化和土傳病害發(fā)生嚴(yán)重等問題。

我國將通過碳源和淹水結(jié)合的方式創(chuàng)造厭氧環(huán)境殺死土傳病害來改善土壤連作障礙的方法叫做強(qiáng)還原土壤滅菌法（Reductive Soil Disinfestation，RSD）。RSD 方法的特點是將易分解的碳源和灌溉結(jié)合，刺激好氧菌的快速生長，加快土壤中氧氣的消耗，厭氧環(huán)境使土壤菌落結(jié)構(gòu)從以好氧菌為主轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬蹙蛘呒嫘詤捬蹙鸀橹?。在厭氧環(huán)境下，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝有毒物質(zhì)可進(jìn)一步對病原菌起到抑制作用。施用土壤改良劑（石灰氮等）是新興起的一種快速恢復(fù)土壤退化的方法，相比傳統(tǒng)方法具有方便快捷和經(jīng)濟(jì)高效的特點。石灰氮改良機(jī)制是水解后生成氰氨，對土壤病原菌有滅殺作用，氰氨還可以水解形成可被植物直接吸收利用的尿素或氨。它的優(yōu)勢是水解過程無酸根殘留，不會導(dǎo)致土壤酸化加重。土壤微生物群落失衡是導(dǎo)致土傳病害發(fā)生的直接原因，土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成是衡量土壤健康情況的重要指標(biāo)。有研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)、施肥方式、土壤質(zhì)地等有關(guān)。目前，研究微生物的方法很多，高通量測序技術(shù)因具有檢測信息豐富、準(zhǔn)確率高和成本較低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。

芹菜作為我國深受歡迎的傘形科多葉植物，具有廣泛的種植面積。但在設(shè)施栽培條件下，芹菜常因次生鹽漬化、病蟲害發(fā)生等問題導(dǎo)致減產(chǎn)嚴(yán)重。針對芹菜連作障礙，國內(nèi)通常采取施用石灰氮等改良劑、芹菜合理間作等治理方式。莫娟等研究表明石灰氮能有效防治芹菜根腐病的發(fā)生。袁濤等通過菜豆、芹菜間作來提升芹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，基于Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)分析不同改良措施對連作芹菜土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究較少。筆者通過灌水高溫悶棚聯(lián)合施用有機(jī)物或石灰氮的處理措施來緩解芹菜土壤連作障礙，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，以期為緩解芹菜連作障礙和提高芹菜產(chǎn)量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

蔬菜大棚位于江蘇省太倉市三市村。太倉市處于地勢平坦的平原地區(qū)，地勢自東北向西南傾斜，屬于北亞熱帶南部濕潤氣候區(qū)，光照充足，夏季炎熱多雨，冬季寒冷少雨，7 月平均氣溫為27.7 ℃，1 月平均氣溫為2.8 ℃，年平均氣溫為15.3 ℃。太倉市年平均降水量為1017 mm，年平均降雨日為130 d，太倉市全年受到的日照時長可達(dá)4 423.7 h。試驗前供試土壤的基本理化性質(zhì)測定結(jié)果：pH 值為5.94、全氮含量（，后同）為0.53 g·kg、有效磷含量為72.7 mg·kg、有機(jī)質(zhì)含量為22.1 g·kg、硝態(tài)氮含量為100 mg·kg、電導(dǎo)率為68 mS·m。

1.2 材料及試驗設(shè)計

供試材料：芹菜（）品種為美國西芹文圖拉，由北京思貝奇種子有限公司提供。有機(jī)物料（麥糠）、石灰氮［（總氮）≥21%，（氰氨化鈣）≥55%］由山東金耐特環(huán)?？萍加邢薰咎峁?；前茬作物：大蒜；棚齡：5 年。

在試驗中共設(shè)計8 個處理，（1）CK，裸地；（2）CW，灌水高溫悶棚；（3）O1W，灌水高溫悶棚+5000 kg·hm麥糠；（4）O2W，灌水高溫悶棚+10 000 kg·hm麥糠；（5）O3W，灌水高溫悶棚+15 000 kg·hm麥糠；（6）S1W，灌水高溫悶棚+300 kg·hm的石灰氮；（7）S2W，灌水高溫悶棚+600 kg·hm的石灰氮；（8）S3W，灌水高溫悶棚+900 kg·hm的石灰氮。每個試驗小區(qū)長9 m，寬3 m，面積27 m，小區(qū)間隔25 cm，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。將不同用量的麥糠或石灰氮均勻撒在對應(yīng)的試驗小區(qū)，用旋耕機(jī)將麥糠和石灰氮深翻入土，然后在小區(qū)四周做小拱，拱寬20 cm、高30 cm，在小拱上覆蓋一層塑料薄膜，對小區(qū)進(jìn)行灌水處理讓土層處于淹水狀態(tài)。在試驗小區(qū)表面覆蓋一層塑料薄膜，密封大棚25 d 后揭棚排水，通風(fēng)5 d 晾干土層，翻耕土壤后即可進(jìn)行芹菜播種。每個小區(qū)種植大約500 株芹菜，株距大約為20 cm。2019 年8 月5 日施用基肥：尿素375 kg·hm、有機(jī)復(fù)合肥1200 kg·hm、磷肥225 kg·hm、鉀肥150 kg·hm。為保持氮素平衡，灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施不施用尿素。在植株生長旺盛期追肥，施用量為復(fù)合肥225 kg·hm、尿素75 kg·hm、鉀肥30 kg·hm。

1.3 土壤樣品的采集

在芹菜收獲期用五點取樣法采集深度為20 cm的根際混合土樣。采樣時間為2019 年11 月11 日，將土樣分為2 份，1 份保存于-70 ℃的超低溫冰箱用于土壤根際微生物分析（混合樣本，不設(shè)重復(fù)）；1份風(fēng)干后去除雜物，研磨、過篩后保存。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤微生物群落、基本理化性質(zhì)和產(chǎn)量的測定 土壤理化性質(zhì)按照指定標(biāo)準(zhǔn)測定，土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法（NY/T 1121.6—2006）測定，硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法（GB/T 32737—2016）測定，pH 值采用電位法（HJ 962—2018）測定，電導(dǎo)率采用電極法（HJ 802—2016）測定，有效磷含量采用紫外分光光度法（NY/T 1121.7—2014）測定，全氮含量采用半微量開氏法（NY/T 53—1987）測定。在芹菜收獲期，采摘每個小區(qū)的芹菜分別計產(chǎn)，并計算各處理芹菜產(chǎn)量平均值。

1.4.2 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因序列的擴(kuò)增 使用引物：515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）對細(xì)菌16S rDNA 基因序列V4～V5 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（20 μ L）如下：5 × 高保真緩沖液4 μ L，2.5 mmol·LdNTPs 2 μ L，正反向引物（5 μmol·L）各0.8 μL，高保真DNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板10 ng，補(bǔ)加ddHO 至20 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，25 個循環(huán)；72 ℃5 min。從2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增產(chǎn)物送至凌恩生物科技有限公司（上海）完成測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，然后將正反向reads 配對，并剔除有問題序列以及嵌合體，構(gòu)建物種分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）豐度表（97%相似度）?；贠TU聚類分析結(jié)果，對OTU 進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析。利用Mothur 做rarefaction 分析，利用R 語言工具制作曲線圖。以O(shè)TU 的物種分類結(jié)果為依據(jù)，在門的分類級別上對8 組土壤樣品中細(xì)菌的組成和結(jié)構(gòu)以及相對豐度進(jìn)行分析，并利用R 語言工具作圖。土壤理化性質(zhì)等采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS statistics 21 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同改良措施對根際土壤理化性質(zhì)的影響

分析不同的改良措施對芹菜根際土壤理化性質(zhì)的影響。由表1 可知，經(jīng)改良措施后土壤pH值顯著提高，O3W 處理達(dá)到峰值6.78，比CK 增加了14.1%；土壤全氮含量在灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物或石灰氮措施中均顯著提高，S3W 處理達(dá)到峰值0.80 g·kg，比CK 增加了45.5%；土壤有機(jī)質(zhì)含量在灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物措施中顯著提高，O3W 處理達(dá)到峰值34.4 g·kg，比CK 增加了43.9%；土壤有效磷含量在灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物和石灰氮措施中均顯著提高，O3W 處理達(dá)到峰值為87.3 mg·kg，比CK 增加了20.1%；電導(dǎo)率值在灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物措施中顯著降低，O3W 處理最小，為30 mS·m，比CK 降低了49.2%；土壤硝態(tài)氮含量在灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮措施中顯著降低，S3W 處理最低，為49.0 mg·kg，比CK 降低了40.7%；土壤容重經(jīng)改良措施后顯著降低，S3W 處理最小，為1.05 g·cm，比CK 降低了19.8%。

表1 不同處理對根際土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 不同改良措施對芹菜產(chǎn)量的影響

由圖1 可以看出，灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物或石灰氮對芹菜產(chǎn)量有不同的影響。芹菜產(chǎn)量在O2W、O3W 和S3W 處理中提升最顯著。O2W、O3W 和S3W 處理芹菜產(chǎn)量分別為93.4、95.3、90.4 t·hm，與CK 相比分別提高了34.6%、37.3%和30.2%。O1W、S1W 和S2W 處理芹菜的產(chǎn)量顯著高于CK。CW 處理芹菜的產(chǎn)量高于CK，但差異不顯著。灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物處理措施中，O3W 處理效果最好；灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施中，S3W 處理效果最好。

圖1 不同處理下芹菜的產(chǎn)量

2.3 不同改良措施下芹菜根際土壤的測序結(jié)果分析

利用Illumina Miseq 測序分析平臺對土壤微生物，細(xì)菌16S rDNA 基因序列V3～V4 區(qū)進(jìn)行測序，共得到有效序列355 836 條，序列堿基數(shù)147 858 249 bp，平均長度為415.44 bp（表2）。稀釋性曲線可以用來比較不同樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。由圖2 可知，在相似度97%條件下，所有土壤樣品稀釋性曲線均趨于平緩，表明樣本測序數(shù)據(jù)量有較高的可信度，能夠比較真實地反映不同處理間土壤樣本的微生物群落狀況。

表2 不同處理根際土壤的有效序列數(shù)

圖2 不同樣本的稀釋性曲線圖（相似度97%）

2.4 不同改良措施對根際土壤微生物群落的影響

2.4.1 不同處理下根際土壤微生物的物種分類單元（OTU）數(shù) 基于OTU 豐度的樣本聚類圖（圖3）。觀察各處理共有的OTU 數(shù)為443 個，OTU 總數(shù)和特有的OTU 數(shù)分別是CK（1821，155）、CW（2045，153）、O1W（2575，167）、O2W（2609，203）、O3W（3148，361）、S1W（2656，167）、S2W（2483，181）、S3W（2900，334）?？梢钥闯觯琌3W 處理的OTU 總數(shù)和特有的OTU 數(shù)都是最多的，分別為3148 和361，說明該區(qū)域不僅含有更多的微生物種類，也含有較多的特有微生物種類。

圖3 基于OTU 豐度的不同樣本的聚類圖

2.4.2 不同處理下土壤微生物門水平群落結(jié)構(gòu) 由圖4 可知，在門水平分類上，不同處理間微生物的主要菌門分別為：變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）。灌水高溫悶棚處理措施對土壤微生物相對豐度的影響較?。还嗨邷貝炁锫?lián)合有機(jī)物處理措施使變形菌門和擬桿菌門的相對豐度提高，而放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門的相對豐度降低；灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施提高了厚壁菌門和放線菌門的相對豐度，降低了變形菌門的相對豐度。

圖4 細(xì)菌群落在門水平上的相對豐度結(jié)構(gòu)

2.5 不同改良措施下根際土壤微生物的多樣性分析

2.5.1 樣本多樣性分析（Alpha-diversity，Alpha）從Alpha 多樣性分析可知（表3），經(jīng)過改良措施后，芹菜根系土壤微生物的豐富度指數(shù)（Chao1 指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)）都有顯著提高。以O(shè)3W 處理的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)最高，分別為4 281.7、6.903 7，這說明O3W 處理的微生物數(shù)量和種類都相對較多。Simpson 值代表的是微生物的優(yōu)勢度指數(shù)，CW 處理Simpson 值最高為0.018 4，說明其微生物群落中菌種的分布不均勻、多樣性較差、優(yōu)勢種比重大。Coverage 指數(shù)越高說明土壤樣本序列被測出的概率越高，在試驗中各土壤樣本指數(shù)都在0.9 以上，代表可以反映樣本中微生物群落的真實情況。

表3 不同處理根際微生物多樣性的變化

2.5.2 樣本間比較分析（Bate-diversity，Bate） 由圖5 可知，采用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCOA），以兩坐標(biāo)軸的零基準(zhǔn)線為參考系，CK 和CW 處理距離PC2 較近，說明PC2 主成分對其影響較大，占菌落總影響的16.74%。O1W、O2W和O3W 處理距離PC1 和PC2 都比較近，說明其菌落結(jié)構(gòu)受PC1 主成分和PC2 主成分影響都比較大，分別占總影響的49.91%和16.74%。S1W、S2W 和S3W 處理距離兩坐標(biāo)軸比較遠(yuǎn)，說明其受兩主成分的影響不大。CK、灌水高溫悶棚、灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物、灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮4 種不同處理措施在主坐標(biāo)分析圖上大致分布在4 個方位，說明不同處理措施間有明顯差異。

圖5 Bate 多樣性的主坐標(biāo)分析

2.6 土壤的主要理化性質(zhì)與微生物群落的關(guān)系

對土壤樣本進(jìn)行亢余分析（RDA）可知（圖6），第一坐標(biāo)軸可以解釋74.27%的信息值，第二坐標(biāo)軸可解釋16.90%的信息值，兩坐標(biāo)軸的總解釋達(dá)到91.17%的信息值，可準(zhǔn)確反映樣本的實際情況。各處理點位分散于不同的象限空間內(nèi)，說明不同處理間微生物群落的差異明顯?？梢钥吹剑鯌B(tài)氮是影響土壤細(xì)菌群落的主要理化性質(zhì)之一。硝態(tài)氮與CK 和CW 處理呈正相關(guān)，與灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物處理措施的相關(guān)性不明顯，但與灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施以及放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門呈負(fù)相關(guān)。pH、有機(jī)質(zhì)、有效磷等與CW 處理和綠彎菌門、疣微菌門呈負(fù)相關(guān)，與灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物或石灰氮處理措施以及放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門呈正相關(guān)。

圖6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的關(guān)系

3 討 論

已有研究表明，單純對連作土壤進(jìn)行淹水處理并不能有效滅殺土壤病原菌，而淹水聯(lián)合有機(jī)物料的處理措施卻能取得顯著效果。在連作土壤中單純施用石灰氮取得的滅菌效果可能會受溫度的影響，而灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮的處理措施卻能有效發(fā)揮石灰氮的滅菌效果。筆者以灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物或石灰氮等改良措施來改善芹菜連作障礙，優(yōu)化土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。經(jīng)灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理后，土壤的pH 值顯著提高、硝態(tài)氮含量顯著降低，這與張蕾等和OH 等的研究結(jié)果相同。在灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施中，硝態(tài)氮的降低可能是因為石灰氮水解生成的雙氰胺，對微生物的硝化反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用。施用石灰氮后土壤全氮含量顯著提升，這與Xiao 等的觀點一致。灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物處理措施提高了土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮和速效磷含量，可能是有機(jī)質(zhì)礦化釋放了作物生長所需的養(yǎng)分，提高了土壤中氮、磷和鉀的含量。

從Alpha 多樣性分析可知，灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物處理措施顯著提高了根際土壤細(xì)菌的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)，這與劉亮亮等的研究結(jié)果一致。PCOA 分析顯示各處理措施根際土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與對照明顯不同，說明各處理措施均能提高土壤中微生物的多樣性和豐富度。高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施中，施用石灰氮后土壤微生物豐富度并沒有大幅度減少，可能是因為施用石灰氮后雖滅殺了大量的土壤微生物，但同時也為土壤微生物提供了生態(tài)位和氮源，為土壤微生物群落的恢復(fù)創(chuàng)造了條件，這與劉高峰等的研究結(jié)果一致。對細(xì)菌門水平的相對豐度分析顯示，灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施提高了土壤中厚壁菌門的相對豐度，這與前人報道相似。厚壁菌門大多是厭氧菌，也是產(chǎn)生有機(jī)酸的主要菌門，其產(chǎn)生的有機(jī)酸等代謝有毒物質(zhì)可以對病原菌起到抑制和滅殺作用。聶園軍等的研究表明，放線菌門和厚壁菌門有利于促進(jìn)連作西瓜的生長。灌水高溫悶棚聯(lián)合有機(jī)物處理措施能提高變形菌門和擬桿菌門的相對豐度，但會降低放線菌門和厚壁菌門等有益菌門的相對豐度。此外，還會使酸桿菌門的相對豐度降低，這與陳靜等的研究結(jié)果相同。通過亢余分析可知，硝態(tài)氮作為影響細(xì)菌群落的主要因素之一，與灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施以及放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門呈負(fù)相關(guān)，說明降低土壤中硝態(tài)氮含量能改善土壤中放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的生長環(huán)境。

4 結(jié) 論

（1）灌水高溫悶棚結(jié)合有機(jī)物或石灰氮處理措施對芹菜連作土壤有改善作用，其中，灌水高溫悶棚聯(lián)合施用15 000 kg·hm麥糠和灌水高溫悶棚聯(lián)合施用900 kg·hm石灰氮的處理措施在緩解土壤酸化、提升土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量方面效果最顯著。

（2）灌水高溫悶棚聯(lián)合石灰氮處理措施能優(yōu)化土壤原有的代謝關(guān)系，使土壤微生物區(qū)系變成了以放線菌門和厚壁菌門等厭氧菌為主的群落結(jié)構(gòu)。

（3）由此可見，灌水高溫悶棚聯(lián)合施用900 kg·hm石灰氮的處理措施不僅能有效緩解芹菜根際土壤的連作障礙問題，還能改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。