尼古丁依賴男大學(xué)生運(yùn)動(dòng)習(xí)慣與認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)研究：基于腸道菌群和非靶向代謝的聯(lián)合組學(xué)分析

董瑋仲，宋 剛，羅 炯，廖帥雄，杜然浩，苗偉杰，張華明，賴明航

（1.西南大學(xué) 體育學(xué)院，重慶 400715；2.浙江大學(xué) 體育系，浙江 杭州 310058；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 體育教學(xué)部，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

我國吸煙人口數(shù)約占全國人口數(shù)的25%，男子吸煙率接近 50%（Wang et al.，2019b）。2019年，全球吸煙者的數(shù)量達(dá)到了11億的新高，世界上大約每3個(gè)吸煙者中就有1個(gè)來自中國（GBD 2019 Tobacco Collaborators，2021）。最新研究預(yù)測，未來20年中國因吸煙引發(fā)的相關(guān)癌癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)將增加約50%（Li et al.，2021）。吸煙已經(jīng)成為我國重要的公共健康問題。吸煙的危害主要來自尼古丁成癮。成癮物質(zhì)導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)和功能的持久改變（Wang et al.，2019a），引發(fā)認(rèn)知功能損傷（胡鵬娟 等，2018），尤其是降低工作記憶和抑制能力（Fried et al.，2006；Swan et al.，2007）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)尼古丁損害認(rèn)知功能（周躍輝 等，2016；Leslie，2020）。

運(yùn)動(dòng)有助于尼古丁成癮的戒斷（Masiero et al.，2020；Ussher et al.，2019），能有效地抑制吸煙者對香煙的渴求（Van Rensburg et al.，2012）。有研究表明，吸煙狀態(tài)與輕度認(rèn)知功能相關(guān)（Sonoda et al.，2016），提高認(rèn)知功能有助于提高戒煙成功率（Evans et al.，2019），而運(yùn)動(dòng)能改善認(rèn)知能力（Landrigan et al.，2020）。大量的研究結(jié)果證實(shí)，運(yùn)動(dòng)對不同年齡段、多種退行性疾病患者的認(rèn)知功能具有改善作用（Bidzan-Bluma et al.，2018；Carson et al.，2016；Watson et al.，2007；Zeng et al.，2017）。其機(jī)制包括：1）運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)不同腦區(qū)的脊髓液生成，對突觸結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行保護(hù)（Van Dongen et al.，2016）；2）運(yùn)動(dòng)與海馬體體積增大有關(guān)（Erickson et al.，2009）；3）運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過調(diào)節(jié)小腦和運(yùn)動(dòng)皮層影響認(rèn)知功能（Zhang et al.，2019）；4）運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BNDF）的分泌，從而改善認(rèn)知功能（Cassilhas et al.，2016）；5）運(yùn)動(dòng)通過腸道菌群-腸-腦軸影響認(rèn)知功能——運(yùn)動(dòng)可以增加體內(nèi)有益菌種的豐度（雙歧桿菌等），提高腸道菌群多樣性（Zhong et al.，2021），腸道菌群及其產(chǎn)生的腸道代謝物含有大量神經(jīng)遞質(zhì)（短鏈脂肪酸等），這些代謝物參與維持大腦功能的調(diào)節(jié)（宋剛等，2019；Alam et al.，2014；Dalile et al.，2019）。

研究表明，吸煙也可改變腸道菌群組成（Capurso et al.，2017；Wang et al.，2019c）。吸煙會導(dǎo)致吸煙者的擬桿菌門增加，厚壁菌門和變形桿菌門減少（Huang et al.，2019），同時(shí)吸煙會導(dǎo)致腸道菌群多樣性的減少（Savin et al.，2018）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，小鼠腸道菌群的Christensenellaceae、Mogibacteriaceae等菌種受到尼古丁的影響（Chi et al.，2017）。最近，刊發(fā)的Fluhr等（2021）的研究發(fā)現(xiàn)，暴露于煙草煙霧3周后小鼠腸道菌群出現(xiàn)改變，戒煙后仍不能恢復(fù)正常。

來自于動(dòng)物和人類的研究都已證實(shí)，運(yùn)動(dòng)對尼古丁依賴個(gè)體的認(rèn)知功能有積極影響；同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群的變化會影響認(rèn)知功能（Cryan et al.，2012；Mohajeri et al.，2018；Sharon et al.，2016）。但從腸道菌群-腸-腦軸的角度對運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能的報(bào)道鮮見。據(jù)此我們推測，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)腸道菌群及其代謝物的改變可以改善尼古丁依賴大學(xué)生的認(rèn)知功能。本研究為將來以腸道菌群及其代謝物為靶點(diǎn)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能提供證據(jù)。

1 研究對象與研究方法

1.1 研究對象

在西南大學(xué)校內(nèi)招募200名男性吸煙大學(xué)生，發(fā)放尼古丁依賴檢驗(yàn)量表（The Fagerstrom Test of Nicotine Dependence，F(xiàn)TND）和國際體力活動(dòng)量表（International Physical Activity Questionaire），結(jié)合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，篩選出有運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生（HE組）和無運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生（n-HE組）各15人。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：1）每天吸煙數(shù)量在5根及以上；2）近期沒有服用抗生素；3）通過FTND測評達(dá)到尼古丁依賴中度及以上水平；4）本人及直系親屬?zèng)]有醫(yī)療和精神疾病；5）沒有尼古丁之外的藥物濫用或依賴障礙；6）身體健康，沒有軀體殘疾或醫(yī)療問題而影響行為學(xué)測試；7）近一周無腹瀉等腸胃道癥狀。有任何一條不滿足者排除出正式實(shí)驗(yàn)。

如表1所示，兩組被試除了身體活動(dòng)量外其他人口學(xué)變量沒有顯著性差異。本研究獲得西南大學(xué)體育學(xué)院倫理委員會審批（SWU-TY20200701），所有被試在實(shí)驗(yàn)前均已簽署知情同意書。

表1 本研究被試基本情況Table 1 Basic Information of the Subjects

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正式實(shí)驗(yàn)前一周完成被試的篩選并通知被試實(shí)驗(yàn)時(shí)間。被試來到實(shí)驗(yàn)室后告知被試整體實(shí)驗(yàn)流程，對可能的問題進(jìn)行說明講解，同時(shí)簽署知情同意書。隨后進(jìn)行認(rèn)知能力測試。為了避免測試順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，一半被試先進(jìn)行工作記憶測試，另一半被試先進(jìn)行抑制能力的測試。在測試完成后收集腸道菌群分析和宿主代謝分析所需要的糞便樣本。

1.3 數(shù)據(jù)收集

1.3.1 認(rèn)知能力

工作記憶能力測試選取改編版的斯騰伯格范式（周躍輝，2016；圖1A）。如果探測數(shù)字是編碼刺激中出現(xiàn)過的，則要求被試按“F”鍵反應(yīng)；相反，如果探測數(shù)字沒有在編碼刺激中出現(xiàn)過，則要求被試按“J”鍵反應(yīng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，要求被試盡可能迅速地正確按鍵反應(yīng)，記錄其反應(yīng)時(shí)與正確率。正式實(shí)驗(yàn)包括60個(gè)試次，其中編碼刺激1位數(shù)字、3位數(shù)字和5位數(shù)字出現(xiàn)的數(shù)量各占1/3，出現(xiàn)的順序隨機(jī)。

圖1 認(rèn)知測試任務(wù)示意圖Figure 1.Schematic Diagram of Cognitive Test Tasks

抑制能力測試任務(wù)選取標(biāo)準(zhǔn)的Go/NoGo范式（圖1B），實(shí)驗(yàn)刺激由X和Y兩個(gè)字母組成，其中X和Y呈現(xiàn)的順序隨機(jī)。當(dāng)電腦屏幕呈現(xiàn)出的字母為X時(shí)，則為Go試次，要求被試按“0”鍵反應(yīng)；當(dāng)電腦屏幕呈現(xiàn)出的字母為Y時(shí)，則為NoGo試次，要求被試抑制自己的按鍵操作。被試需要完成1個(gè)組塊，共120個(gè)試次，其中Go試次和No-Go試次的比率為4∶1（96個(gè)Go試次，24個(gè)NoGo試次）。

1.3.2 腸道菌群

樣品采集和DNA提?。杭S便樣品在某大學(xué)校醫(yī)院采集，采樣后3 h內(nèi)于-80℃冰箱冷凍。使用QIAamp快速DNA糞便迷你試劑盒（美國加利福尼亞州Qiagen）進(jìn)行DNA提取。使用納米滴管2 000（美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆熱科學(xué)公司）測量細(xì)菌DNA的濃度。

高通量測序：細(xì)菌群落通過IlluminaMiSeq高通量測序進(jìn)行研究。選擇16S rDNA基因的V3和V4區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物被條形碼標(biāo)記為338 F（5’-ACTCCTAGGGAGCAGCAG-3’）和806 R（5’-GGACATCHVGGGTWTTCTAAT-3’），其中條形碼是每個(gè)樣品特有的8堿基序列。20μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物由4μL 5×FastPFU緩沖液、2μL 2.5 mmol/L脫氧核糖核酸、5μmol/L正向和反向引物、0.4μL TransStartFastpfu DNA聚合酶（轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)公司，北京）和10μg DNA模板組成。進(jìn)行以下循環(huán)參數(shù)：保持在95℃2 min，27個(gè)循環(huán)（95℃30 s、55℃30 s和72℃30 s），最后在72℃延伸5 min。每個(gè)樣品收集3份反應(yīng)混合物，用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（美國加利福尼亞州聯(lián)合城Axygen）純化，用定量熒光-ST熒光定量系統(tǒng)（美國威斯康星州麥迪遜市Promega）定量。來自不同樣品的擴(kuò)增子被發(fā)送到深圳微生態(tài)科技有限公司的IlluminaMiSeq平臺上進(jìn)行測序。

測序數(shù)據(jù)的處理：使用QIIME（1.9.1）按照Song等（2017）提到的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對原始fastq文件進(jìn)行解復(fù)用和質(zhì)量過濾。使用UPARSE（7.12）以97%的相似性截止值對操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）進(jìn)行聚類，并使用UCHIME識別和去除嵌合序列。每個(gè)16S rRNA基因序列的分類用RDP分類器對照Silva（SSU128）16S rRNA數(shù)據(jù)庫通過使用70%的置信閾值進(jìn)行分析。腸道菌群的有關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所國家組學(xué)數(shù)據(jù)百科全書（National Omics Data Encyclopedia，NODE）數(shù)據(jù)庫（Sample ID：OEX012780）。

1.3.3 腸道代謝物

代謝物的提?。壕_稱量樣本100 mg（±1%）于2 mL的EP管中，準(zhǔn)確加入0.6 mL 2-氯苯丙氨酸（4 ppm）甲醇（-20℃）配制，渦旋振蕩30 s后加入100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，50 Hz研磨90 s；再進(jìn)行室溫超聲10 min；隨后12 000 rpm 4℃離心 10 min，取上清液 300 μL過0.22 μm膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中；自每個(gè)待測樣本各取20μL混合成QC樣本，用剩余待測樣本進(jìn)行色譜-質(zhì)譜（LC-MS）檢測（Wang et al.，2020）。

基于LC-MS的代謝物檢測：色譜條件儀器采用Thermo Ultimate 3000，使 用 ACQUITY UPLCHSS T3 1.8 μm（2.1×150 mm）色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為8℃，以0.25 mL/min的流速，40℃的柱溫，進(jìn)樣2 μL進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負(fù)離子5 mmol/L甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98%B/D；12～13.5 min，98%B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2%D正模式（14～17 min，2% B-負(fù)模式）。質(zhì)譜條件儀器使用Thermo Q Exactive Plus，電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為4.20 kV，負(fù)離子噴霧電壓為3.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325℃，以分辨率70 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍81～1 000，并采用HCD進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息（Ponnusamy et al.，2011；Want et al.，2010）。

代謝物的鑒定：代謝物的鑒定首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行確認(rèn)（分子量誤差為＜=30 ppm），后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對Human Metabolome Database（HMDB）、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound等數(shù)據(jù)庫確認(rèn)注釋獲得代謝物（Smith et al.，2006）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

考慮到腸道菌群的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，為了保證統(tǒng)計(jì)分析的一致性，認(rèn)知功能的組間差異采用曼-惠特尼U（Mann-Whitney U）檢驗(yàn)檢驗(yàn)；腸道菌群α多樣性使用mothur軟件進(jìn)行指數(shù)分析，組間差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。組間差異分析采用線性判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）。代謝組學(xué)的分析中，使用偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）對不同組別尼古丁成癮大學(xué)生的代謝物進(jìn)行分析，最后進(jìn)行富集分析（Enrichment Analysis），通過過代表分析（over representation analysis，ORA）方法判斷代謝物在代謝通路中的富集程度，隨后使用拓?fù)浞治觯╰opology analysis）進(jìn)一步明確代謝通路的重要性，并與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫比較確定可能影響的代謝通路。采用斯皮爾曼相關(guān)分析（Spearman’s correlation analysis）對認(rèn)知功能、腸道菌群和非靶向代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究中P＜0.05為有顯著性差異；P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能差異分析

2.1.1 工作記憶

Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），在較為簡單的1位數(shù)字任務(wù)中，不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的被試反應(yīng)時(shí)和正確率沒有顯著性差異（反應(yīng)時(shí)：Z=-1.265，P=0.217；正確率Z=-0.565，P=0.624）；而在難度較高的3位數(shù)字任務(wù)和5位數(shù)字任務(wù)中，HE組反應(yīng)時(shí)顯著快于n-HE組（3位數(shù)字任務(wù)：Z=-2.592，P=0.009＜0.01；5位數(shù)字任務(wù)：Z=-2.800，P=0.004＜0.01），正確率HE組也顯著高于n-HE組（3位數(shù)字任務(wù)：Z=-2.950，P=0.003＜0.01；5位數(shù)字任務(wù)：Z=-3.217，P=0.001＜0.01）。研究結(jié)果表明，HE組被試數(shù)字記憶識別能力顯著好于n-HE組，尤其是在難度較高的數(shù)字記憶識別中。

圖2 不同任務(wù)類型尼古丁依賴男大學(xué)生的反應(yīng)時(shí)和正確率Figure 2.Response Time and Accurary of Male College Students with Nicotine Dependence of Different Task Types

2.1.2 抑制能力

在測試抑制功能的Go/NoGo任務(wù)中，不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的大學(xué)生在反應(yīng)時(shí)和正確率上也有區(qū)別（圖3）：在Go任務(wù)上，兩組被試的正確率沒有顯著性差異（Z=-1.763，P=0.098），但 HE組反應(yīng)時(shí)顯著低于 n-HE組（Z=-2.219，P=0.026＜0.05）；在NoGo任務(wù)中，HE組被試正確率顯著高于n-HE組（Z=-1.982，P=0.050）。結(jié)果表明，HE組被試的抑制功能好于n-HE組被試。

圖3 Go/NoGo任務(wù)尼古丁依賴男大學(xué)生的反應(yīng)時(shí)和正確率Figure 3.Response Time and Accuracy of Male College Students with Nicotine Dependence in Go/NoGoTask

2.2 腸道菌群差異分析

對不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴大學(xué)生的腸道菌群多樣性進(jìn)行α多樣性分析，采取Faith-pd指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示，各多樣性指數(shù)在組間并沒有顯著性差異。

圖4 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生腸道微生物α多樣性指數(shù)檢驗(yàn)Figure 4. α Diversity Index Test of Gut Microbiota with Different Exercise Habits Nicotine Dependent Male College Students

此外，如圖5所示，HE組和n-HE組之間的樣本沒有形成明顯的聚類，主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）的區(qū)分度不明顯，不能將兩組腸道菌群按群落組成劃分為不同的類群，表明HE組和n-HE組被試腸道菌群OTU組成結(jié)構(gòu)相似，差異程度較小。

圖5 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群OTU水平的主坐標(biāo)分析Figure 5.Principal Coordinate Analysis of OTU Level of Gut Microbiota in Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

LEfSe多級物種差異判別分析結(jié)果顯示，HE組和n-HE組在各分類水平上均存在顯著差異的物種，差異結(jié)果如圖6所示。n-HE組豐度顯著高于HE組的有埃希氏菌屬（Escherichia，P=0.002），在HE組豐度顯著高的腸道菌群中，綱水平（class）上有β-變形菌綱（Betaproteobacteria，P=0.005）和丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia，P=0.026），在目層級（order）上有伯克氏菌目（Burkholderiales，P=0.005）和丹毒絲菌目（Erysipelotrichales，P=0.026），科水平（family）上有產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae，P=0.006）、克里斯滕森菌科（Christensenellaceae，P=0.035）和丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae，P=0.026），屬水平（genus）上有薩特氏菌屬（Sutterella，P=0.005）和克里斯滕森氏菌屬（Christensenella，P=0.035）。

圖6 不同組別尼古丁依賴大學(xué)生腸道菌群LEfSe分析Figure 6.LEfSe Analysis of Gut Microbiota in Different Groups of Nicotine Dependent College Students

2.3 代謝物差異分析

2.3.1 代謝物含量統(tǒng)計(jì)

將所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫br08001進(jìn)行注釋，得到代謝物的生物學(xué)作用，然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)代謝物的百分比含量，繪制百分比含量堆積柱形圖。如圖7所示，縱坐標(biāo)表示各個(gè)代謝物的百分比含量，可以看出，肽類（peptides）作用的代謝物含量最高，其次是脂類（lipids）。

圖7 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道具有生物學(xué)作用的代謝物百分比堆積Figure 7.Column Chart of Metabolite Percentage Accumulation with Biological Effects in Gut Tract of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

聚類結(jié)果如圖8所示，可以看出，HE組和n-HE組被試的樣本在不同代謝物上的含量不同，其中與認(rèn)知功能有關(guān)的代謝物γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和乙酰膽堿（acetylcholine）在HE組的含量顯著高于n-HE組，肌氨酸（creatin）和鞘氨醇（sphingosine）含量HE組顯著低于n-HE組。

圖8 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物聚類結(jié)果Figure 8.Heatmap of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.3.2 特征代謝物的篩選

使用PLS-DA對不同組別代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9所示，在標(biāo)記出的36種重點(diǎn)關(guān)注的代謝物中，與認(rèn)知功能有關(guān)的包括丙酮酸（pyruvic acid）、米非司酮（mifepristone）、芥子酸（sinapic acid）和鞘氨酸（sphinganine）等。

圖9 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物PLS-DA結(jié)果Figure 9.PLS-DA results of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.3.3 代謝物通路分析

通過富集分析探究差異代謝物結(jié)果如圖10A所示，其橫坐標(biāo)富集倍數(shù)=觀測代謝物數(shù)/理論代謝物數(shù)。圖10B中藍(lán)色區(qū)域的代謝通路是拓?fù)浞治鲋杏酗@著差異的代謝通路，可以看到，2組被試間代謝物通路有顯著差異的是精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）、賴氨酸降解（lysine degradation）和戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway）。

圖10 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物ORA富集分析和拓?fù)浞治鯢igure 10.EnrichmentAnalysis and TopologicalAnalysis of Metabolite ORAof Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4 認(rèn)知功能與腸道菌群及腸道代謝物的相關(guān)性

2.4.1 認(rèn)知功能與腸道菌群的相關(guān)性

選取不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣大學(xué)生存在差異的認(rèn)知結(jié)果與其腸道微生物在科水平上的豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖11所示?？梢钥闯?，認(rèn)知功能與酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria）有關(guān)。與工作記憶準(zhǔn)確性（N3_ACC、N5_ACC）呈顯著正相關(guān)的細(xì)菌有產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae，P＜0.01），呈顯著負(fù)相關(guān)的有噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae，P＜0.05）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，P＜0.05）；與工作記憶反應(yīng)時(shí)（N3_RT、N5_RT）呈顯著負(fù)相關(guān)的有擬桿菌科（Bacteroidaceae，P＜0.05）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae，P＜0.05）、孿生菌科（Gemellaceae，P＜0.05）、巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae，P＜0.05）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae，P＜0.05）和臭桿菌科（Odoribacteraceae，P＜0.05）等；與抑制能力反應(yīng)時(shí)呈顯著正相關(guān)的有mb2424菌科（P＜0.05），呈顯著負(fù)相關(guān)的則有柄桿菌科（Caulobacteraceae，P＜0.05）等。

圖11 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生認(rèn)知能力與腸道菌群相關(guān)性Figure 11.Correlation between Cognitive Function and Gut Microbiota of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4.2 認(rèn)知功能與腸道代謝物的相關(guān)性

從圖12可以看出，吡哌酸（pipecolic acid，P＜0.01）、吲哚（indole，P＜0.05）等代謝物與NoGo任務(wù)準(zhǔn)確率呈顯著正相關(guān)，肌氨酸（creatine，P＜0.01）、三乙胺（triethylamine，P＜0.01）與5位數(shù)字任務(wù)準(zhǔn)確率呈顯著負(fù)相關(guān)。在反應(yīng)時(shí)方面，與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈顯著正相關(guān)的有油酸（oleic acid，P＜0.01）、左旋天冬氨酸（L-aspartic acid，P＜0.01）、L-谷氨酰胺（L-glutamine，P＜0.05）、L-絲氨酸（L-serine，P＜0.05）等，呈顯著負(fù)相關(guān)的有京尼平（genipin，P＜0.05）等；與Go任務(wù)反應(yīng)時(shí)呈負(fù)相關(guān)的有石碳酸（phenol，P＜0.01）、4-（乙酰氨）-2-氨基丁酸（4-acetamido-2-aminobutanoic acid，P＜0.05）等，呈正相關(guān)的有 1，5-戊二胺（cadaverine，P＜0.01）。

圖12 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生認(rèn)知能力與代謝相關(guān)性Figure 12.Correlation between CognitionFunction and Metabolism of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4.3 腸道菌群和腸道代謝物的相關(guān)性

將個(gè)體代謝物與腸道菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖13所示，在與認(rèn)知有關(guān)的代謝物中，米非司酮（mifepristone）與擬桿菌科等呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與腸桿菌科等呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；鞘氨酸（sphinganine）與理研菌科和擬桿菌科等呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與厚壁菌門的Peptostreptococcaceae菌科和Tissierellaceae菌科呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；丙酮酸（pyruvic acid）與厚壁菌門的Carnobacteriaceae菌科呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），芥子酸（sinapic acid）與厚壁菌門的巴斯德氏菌科、生絲微菌科呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖13 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群與代謝物相關(guān)性Figure 13.Correlation between Gut Microbiota and Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣保護(hù)和提高尼古丁依賴男大學(xué)生的認(rèn)知功能

吸煙會導(dǎo)致多種系統(tǒng)性疾病，認(rèn)知功能損傷是常見的臨床表現(xiàn)之一。長期吸煙甚至?xí)?dǎo)致腦結(jié)構(gòu)的損傷。Peng等（2017）發(fā)現(xiàn)，吸煙會對大腦體積造成影響，中青年吸煙者大腦的灰質(zhì)與白質(zhì)體積均小于正常人。吸煙者大腦減少的灰質(zhì)區(qū)域可能是與認(rèn)知功能有關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域（胡鵬娟等，2018）；來自腦功能和連接組學(xué)的研究數(shù)據(jù)表明，運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對人的認(rèn)知功能存在改善作用（Won et al.，2021），且運(yùn)動(dòng)作為一種干預(yù)手段可以改善藥物依賴造成的腦途徑損傷（Koob et al.，2010）。一些使用Go/NoGo范式的研究表明，吸煙者在抑制控制方面存在困難（Luijten et al.，2011）；另有大量的研究證實(shí)，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)了人體的抑制能力（Akatsuka et al.，2015；Weng et al.，2015）。藥物依賴人群的實(shí)證研究證明，運(yùn)動(dòng)可以重建被藥物劫持的食物獎(jiǎng)勵(lì)途徑，并恢復(fù)對自然獎(jiǎng)勵(lì)的敏感性（Wang et al.，2019a；Zhou et al.，2019）?？梢?，保持運(yùn)動(dòng)習(xí)慣是一種改善成癮者認(rèn)知損害，保護(hù)成癮者認(rèn)知功能的方法。

本研究結(jié)果顯示，HE組被試與n-HE組被試相比，工作記憶反應(yīng)時(shí)更快，且正確率高，提示，運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁依賴男大學(xué)生工作記憶具有積極的改善作用；同時(shí)，抑制能力測試也顯示HE組被試在NoGo條件下的正確率顯著高于n-HE組被試，表明運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁依賴男大學(xué)生抑制能力產(chǎn)生積極保護(hù)作用。結(jié)合尼古丁對認(rèn)知功能損害的已有文獻(xiàn)報(bào)道可見，在尼古丁依賴男大學(xué)生群體中，運(yùn)動(dòng)習(xí)慣可以對認(rèn)知功能，尤其是工作記憶和抑制能力起到保護(hù)作用。

3.2 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群組成

近年來，腸道菌群被認(rèn)為是治療成癮的潛在靶位點(diǎn)（Skosnik et al.，2016），運(yùn)動(dòng)、腸道菌群和成癮三者之間存在關(guān)聯(lián)（宋剛 等，2019；Biedermann et al.，2014）。橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能力較差的高血壓老人其體內(nèi)β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）等菌群豐度顯著低于運(yùn)動(dòng)能力較好的高血壓老人（Yu et al.，2018）。2020年，Nolan-Kenney等在對孟加拉國尼古丁依賴者的腸道菌群分析中發(fā)現(xiàn)，丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）和丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）在正常人群與吸煙人群中的豐度存在顯著性差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對腸道菌群的改善作用體現(xiàn)在菌種豐度的差異方面，而不是腸道菌群多樣性方面。這與目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)豐富腸道菌群多樣性（Allen et al.，2018；Dalton et al.，2019）的研究結(jié)果不太一致。我們推測是吸煙抵消了運(yùn)動(dòng)對腸道菌群多樣性帶來的積極影響。當(dāng)然，這一現(xiàn)象的成因還需要進(jìn)一步的探究。本研究中HE組的β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）的豐度高于n-HE組；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，n-HE組的埃希氏菌屬（Escherichia）豐度顯著高于HE組。埃希氏菌屬被發(fā)現(xiàn)與人體腸道三甲胺和炎癥的發(fā)生有關(guān)，是一種有害菌（Rath et al.，2017），另有研究發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌的豐度在運(yùn)動(dòng)能力降低的患者中會有所增加（Yu et al.，2018）。據(jù)此推測，n-HE組被試腸道菌群里的有害微生物豐度升高，可能對健康造成負(fù)面影響。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，HE組被試的丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）和丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）豐度高于n-HE組，可知這些菌種的豐度也受到運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的影響。綜上認(rèn)為，尼古丁依賴男大學(xué)生體內(nèi)腸道菌群的豐度受到運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的調(diào)節(jié)，運(yùn)動(dòng)提高了腸道菌群中有益菌的豐度，降低了有害菌的豐度，從而產(chǎn)生健康效益。

3.3 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物

運(yùn)動(dòng)會改變體內(nèi)代謝物的含量。馬拉松運(yùn)動(dòng)員血液代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸（pyruvic acid）在參加馬拉松比賽后含量顯著增加（Shi et al.，2020）。眾所周知，丙酮酸是運(yùn)動(dòng)供能體系中的重要物質(zhì)，它在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑中起著重要的樞紐作用（干懿潔等，2006；王翔等，2002）。人體研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以提高丘腦中γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）水平（Streeter et al.，2010）。而在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，長期運(yùn)動(dòng)可以通過提高GABA豐度緩解大鼠認(rèn)知功能損傷（Lin et al.，2019）。血液代謝組學(xué)的研究結(jié)果證實(shí)，運(yùn)動(dòng)時(shí)精氨酸和脯氨酸代謝以及戊糖磷酸途徑2條代謝通路參與肌肉線粒體功能調(diào)節(jié)以及加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡能力（Shen et al.，2021；Shimada et al.，2021）。代謝組學(xué)結(jié)果揭示了眾多代謝物和代謝通路會參與運(yùn)動(dòng)促進(jìn)健康。

本研究利用基于液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）非靶向代謝組學(xué)對腸道代謝物進(jìn)行分析檢測發(fā)現(xiàn)，GABA、鞘氨醇（sphingosine）等代謝物組間存在顯著性差異，對腸道代謝物進(jìn)行PLS-DA分析結(jié)果表明，丙酮酸、米非司酮（mifepristone）、芥子酸（sinapic acid）和鞘氨酸（sphinganine）等代謝物可以作為區(qū)分不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴大學(xué)生的特征代謝物，ORA富集分析結(jié)果提示，在代謝通路方面，精氨酸和脯氨酸代謝以及戊糖磷酸途徑存在組間差異。這些結(jié)果與以往其他代謝組學(xué)的研究一致，即運(yùn)動(dòng)習(xí)慣會對尼古丁依賴大學(xué)生的腸道菌群代謝物產(chǎn)生影響，但改變的代謝物存在差異。需要指出來的是，運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變腸道代謝物的機(jī)制尚不明確，亟待進(jìn)一步研究。

3.4 尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群及腸道代謝物與其認(rèn)知功能存在相關(guān)

腸道菌群與腸道代謝物一起參與對認(rèn)知的調(diào)節(jié)，其通路是腸道菌群-腸-腦軸（Margolis et al.，2021），腸道菌群是認(rèn)知功能重要的生物標(biāo)志物（Morais et al.，2021），不同菌種對于認(rèn)知功能的影響不同厚壁菌門與擬桿菌門間的比值被認(rèn)為可以用來區(qū)分老年癡呆癥患者和正常老年人（Ticinesi et al.，2019）；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）是產(chǎn)生丁酸的主要細(xì)菌，其豐度被證實(shí)與阿爾茲海默癥患者認(rèn)知功能有關(guān)（Tran et al.，2019）；擬桿菌科（Bacteroidaceae）與認(rèn)知功能存在關(guān)聯(lián)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在認(rèn)知障礙小鼠中腸道菌群擬桿菌科豐度顯著低于正常小鼠（Luo et al.，2020），但其背后的機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門的孿生菌科（Gemellaceae）和未分類的梭菌科（Unspecified_Clostridiales）與工作記憶和抑制能力反應(yīng)時(shí)呈顯著負(fù)相關(guān)，擬桿菌門的普雷沃氏菌科與準(zhǔn)確率呈顯著負(fù)相關(guān)，擬桿菌科與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果印證了前人有關(guān)腸道菌群與認(rèn)知能力的相關(guān)研究，表明個(gè)體內(nèi)普雷沃氏菌科、擬桿菌科等菌種豐度與認(rèn)知能力的負(fù)向相關(guān)關(guān)系。

腸道菌群代謝物也可能會影響個(gè)體的認(rèn)知能力。5-羥色胺（5-HT）是吲哚（indole，腸道菌群代謝物之一）的衍生物，在體內(nèi)參與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)。5-HT水平下降可能會加劇認(rèn)知衰退（Jenkins et al.，2016），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5-HT水平的上調(diào)與認(rèn)知功能的恢復(fù)緊密相關(guān)（Zhang et al.，2020）。研究表明，京尼平被證實(shí)可以改善小鼠的記憶能力（Nam et al.，2013）；石碳酸（phenol）中的丁苯酚在改善血管性癡呆癥患者的認(rèn)知功能中被廣泛應(yīng)用（郭達(dá)云，2017）；L-谷氨酰胺（L-glutamin）豐度與γ-氨基丁酸（GABA）的水平呈正相關(guān)，而GABA在前人的研究中被證實(shí)會影響認(rèn)知功能（Wang et al.，2007）；此外，L-絲氨酸（L-serine）可以保護(hù)認(rèn)知功能，有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充L-絲氨酸對阿爾茲海默癥小鼠的認(rèn)知缺陷起到預(yù)防作用（Le Douce et al.，2020）。也就是說，這些腸道代謝物的豐度會對認(rèn)知能力造成影響。本研究再次驗(yàn)證了這些代謝物與認(rèn)知功能的關(guān)系：吲哚、京尼平和石碳酸豐度與認(rèn)知能力呈正相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，L-谷氨酰胺和L-絲氨酸與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈正相關(guān)，意味著其豐度越高，工作記憶水平越差，這與前人的研究結(jié)果不一致，其原因還需要進(jìn)一步探究。本研究對腸道菌群與代謝物進(jìn)行的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，擬桿菌科豐度與米非司酮豐度呈顯著正相關(guān)，巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）豐度與芥子酸豐度呈顯著正相關(guān)。提示，腸道菌群擬桿菌科、巴斯德氏菌科可能通過代謝物米非司酮、芥子酸影響認(rèn)知功能。Yalin等（2021）在一項(xiàng)針對健康男子視覺空間學(xué)習(xí)和工作記憶的神經(jīng)相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，米非司酮可以增強(qiáng)人類視覺空間記憶的效率，對認(rèn)知功能有積極促進(jìn)作用。Verma等（2020）研究表明，芥子酸對藥物誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙大鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，提示其可以改善阿爾茲海默癥等認(rèn)知功能障礙患者的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)合現(xiàn)有研究來看，米非司酮、芥子酸等物質(zhì)會受到腸道菌群調(diào)控，并對認(rèn)知功能產(chǎn)生正向影響。上述相關(guān)性結(jié)果有助于從腸道菌群-腸-腦軸視角下理解運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能的機(jī)制，從而進(jìn)一步明確尼古丁依賴人群中，運(yùn)動(dòng)對認(rèn)知功能起保護(hù)作用的可能路徑。

本研究還存在以下不足：首先，本研究考察了不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男性大學(xué)生的認(rèn)知能力、腸道菌群和代謝物的差異，并對三者進(jìn)行相關(guān)分析，以揭示腸道菌群和代謝物對認(rèn)知功能的影響，但是橫斷面研究并不能揭示因果關(guān)系；其次，雖然在選取被試時(shí)考慮了個(gè)體腸道菌群的差異性，并盡可能通過納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，但是依然不能避免未知的影響腸道菌群的混雜因素。未來的研究可以通過設(shè)計(jì)縱向干預(yù)的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用無菌動(dòng)物作為研究對象，探明腸道菌群及腸道代謝物在運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能中的中介作用，進(jìn)一步豐富腸道菌群-腸-腦軸相關(guān)理論。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改善尼古丁成癮者的認(rèn)知功能，不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴者腸道菌群和腸道代謝物存在差異，而腸道菌群及腸道代謝物與認(rèn)知功能密切相關(guān)。提示，腸道菌群及腸道代謝物參與運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁成癮者認(rèn)知功能的保護(hù)，是改善尼古丁成癮者認(rèn)知功能的潛在治療途徑。