淫羊藿種子變溫層積過(guò)程中胚形態(tài)及生理生化變化

徐寵然， 葛 慧， 賈襲偉， 李 飛， 久西加， 趙 鑫， 張 妍， 陳紅剛,2， 杜 弢,2*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心， 甘肅 蘭州 730000)

淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpimediumLinn.)多年生草本植物，全草入藥，是常用中藥之一，其性溫，味辛、甘，入肝、腎二經(jīng)?！侗静菥V目》謂其有益氣、堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力等功效[1]，主治陽(yáng)萎早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神經(jīng)衰弱、健忘、耳鳴、目眩等癥[2]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性物質(zhì)之一，對(duì)骨質(zhì)疏松、阿爾茲海默病、帕金森、腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕病等多種疾病均有顯著改善作用[3]。淫羊藿藥材的市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，但因其種子存在休眠現(xiàn)象，發(fā)芽率低且生長(zhǎng)緩慢[4]，導(dǎo)致其野生資源日漸匱乏，目前已被列為近危植物(IUCN標(biāo)準(zhǔn))。

種子休眠是指具有生活力但在適宜的環(huán)境條件下經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后仍不能發(fā)芽的現(xiàn)象[5]。層積過(guò)程中種胚的發(fā)育和生理生化的變化是種子休眠解除的重要途徑。變溫層積通過(guò)促進(jìn)胚形態(tài)發(fā)育、萌發(fā)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化及能量積累從而解除種子休眠，這在北五味子[6]、圓齒野鴉椿[7]等植物種子上已有驗(yàn)證。在層積過(guò)程中，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水解與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)種胚生長(zhǎng)發(fā)育，為打破休眠奠定了形態(tài)基礎(chǔ)。同時(shí)，呼吸途徑相互轉(zhuǎn)化也是種子休眠解除的關(guān)鍵條件，呼吸途徑論指出，種子休眠解除是呼吸代謝糖酵解途徑(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)途徑向磷酸戊糖途徑(PPP)轉(zhuǎn)化的結(jié)果[8]。另外，激素是植物自身合成的具有調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)的有機(jī)物質(zhì)。在植物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素類、赤霉素類、細(xì)胞分裂素類、脫落酸和乙烯等激素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮調(diào)控作用[9]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseYing)[10]種子存在胚形態(tài)及生理后熟。朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)種子在自然層積的條件下種胚發(fā)育快，率先完成形態(tài)后熟[11]。王晶等[12]研究表明變溫層積處理可加速胚的發(fā)育，同時(shí)減少胚乳中萌發(fā)抑制物質(zhì)含量，隨著層積時(shí)間延長(zhǎng)，朝鮮淫羊藿種子胚率和活力顯著增加，變溫層積5個(gè)月胚的活力達(dá)到95%。同時(shí)研究表明淫羊藿種子同樣具有休眠現(xiàn)象[13]，韓偉等[14]研究認(rèn)為低溫層積淫羊藿種子有利于種子內(nèi)大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解，促進(jìn)胚的進(jìn)一步發(fā)育，然而目前對(duì)于淫羊藿種子有關(guān)變溫層積的研究未見(jiàn)報(bào)道，變溫層積對(duì)其種胚發(fā)育及生理生化特性的影響仍不明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)淫羊藿種子進(jìn)行變溫層積處理，測(cè)定不同層積時(shí)間種子胚形態(tài)及生理生化物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，旨在探究淫羊藿種子胚形態(tài)變化及生理生化物質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為今后研究淫羊藿種子變溫層積提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

淫羊藿種子于2020年7月采于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園(35°15′48″ N，103°24′21″ E)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定為淫羊藿種子。采收后揉搓去除外種皮，再過(guò)篩剔除癟粒，自然陰干。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子變溫層積處理 將河沙洗凈過(guò)篩(40目)，高壓滅菌鍋滅菌(121℃，30 min)，鋪至距容器底部3～4 cm處，將淫羊藿種子裝入紗布網(wǎng)袋，平鋪于河沙之上，再覆蓋3～4 cm河沙，保證種子處于容器中部，沙子濕度為9%～11%，用保鮮膜封住容器，打孔透氣。第1～90 d將容器放置于室內(nèi)(20～25℃)，第91～150 d置于4℃冰箱中。每隔30 d取樣一次，樣品置于—80℃冰箱保存，用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2種子胚形態(tài)及胚率觀測(cè) 從各層積時(shí)期樣品中分別隨機(jī)選取15粒種子，蒸餾水浸泡24 h，OCT膠水常溫包埋10 min，冷凍包埋5 min(-20℃)，Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)切片(厚0.12 mm)，0.1%固綠醇溶液染色30 s，LeicaDM 500顯微鏡觀察種子形態(tài)結(jié)構(gòu)，測(cè)量胚長(zhǎng)和種子長(zhǎng)，并用如下公式計(jì)算胚率。

1.2.3種子營(yíng)養(yǎng)及生理生化指標(biāo)測(cè)定 淀粉含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量均采用試劑盒(南京建成)測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性、赤霉素(GA)含量、吲哚乙酸(IAA)含量、脫落酸(ABA)含量均采用ELISA酶聯(lián)免疫法試劑盒(上海欽誠(chéng))測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿種子胚形態(tài)、胚率變化

淫羊藿種子存在形態(tài)后熟現(xiàn)象，即種子在采收后種胚尚未發(fā)育完全，且種子成熟度不一致。在常溫層積過(guò)程中由球形胚階段逐漸發(fā)育為心形胚階段，低溫層積中種胚繼續(xù)發(fā)育，最終達(dá)到子葉期胚階段(圖1A～1F)。

圖1 淫羊藿種胚形態(tài)Fig.1 Embryo morphology of Epimedium brevicornu Maxim.注：A.未層積；B.層積30 d；C.層積60 d；D.層積90 d；E.層積120 d；F.層積150 dNote:A. non stratification;B. stratification 30 d;C. stratification 60 d;D. stratification 90 d;E. stratification 120 d;F. stratification 150 d

胚率在整個(gè)層積過(guò)程中總體呈上升趨勢(shì)(圖2)。常溫層積期間(1～90 d)胚率呈現(xiàn)階梯式增長(zhǎng)趨勢(shì)，30～60 d期間顯著升高(P<0.05)，胚率在低溫層積(90～150 d)期間顯著升高(P<0.05)，并在層積150 d時(shí)達(dá)到最大值(73.30%)。

圖2 不同層積時(shí)期淫羊藿種子胚率變化Fig.2 Changes of embryo rate of Epimedium brevicornu Maxim. seeds in different stratification periods注：不同小寫字母表示處理時(shí)間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示處理時(shí)間之間在0.01水平差異顯著(P<0.01)。下同Note：Different lowercase letters indicate that there are significant differences between treatment times at the 0.05 level；Different capital letters indicate that there are significant differences between treatment times at the 0.01 level. The same as below

2.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

變溫層積過(guò)程中，種子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量變化顯著(圖3)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量整體呈上升趨勢(shì)，層積150 d時(shí)的含量(58.47 mg·g-1)約是處理前(7.22 mg·g-1)的8倍?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量在常溫層積(1～90 d)期間含量顯著升高(P<0.05)，在層積30 d時(shí)含量增加量最大，并在90 d時(shí)達(dá)到最大值(62.53 mg·g-1)，進(jìn)入低溫層積(90～150 d)后，含量逐漸下降(圖3A)。

隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖含量先下降再上升，最后再下降，最終含量(59.34 mg·g-1)較處理前(78.68 mg·g-1)減少約24.58%?？扇苄蕴呛吭趯臃e的前60 d含量下降顯著，60～120 d期間小幅上升后保持平穩(wěn)，層積的后30 d顯著下降(P<0.05)。

淀粉含量在層積的前30 d顯著下降(P<0.05)，并在30 d時(shí)達(dá)到最小值(25.77 mg·g-1)，此后逐漸上升，至層積150 d時(shí)與初始含量基本持平(圖3B)。

圖3 淫羊藿種子層積過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量變化Fig.3 Changes of nutrient content in seeds of Epimedium brevicornu Maxim. during seed stratification

2.3 呼吸途徑關(guān)鍵酶活性變化

在變溫層積過(guò)程中，種子內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性整體呈升高趨勢(shì)。層積的前30 d內(nèi)上升顯著(P<0.05)，后期在26.36～30.80 U·gprot-1范圍內(nèi)波動(dòng)。層積150 d時(shí)G-6-PD活性(28.80 U·gprot-1)較處理前(22.90 U·gprot-1)增加約25.77%(圖4)。

圖4 淫羊藿種子層積過(guò)程中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性變化Fig.4 G-6-PD activities in respiratory pathway of Epimedium brevicornu Maxim. seeds during seed stratification

2.4 內(nèi)源激素含量變化

變溫層積過(guò)程中，種子內(nèi)吲哚乙酸(IAA)含量整體呈上升趨勢(shì)。IAA含量在層積的前30 d升高顯著(P<0.05)，后期在20.52～22.36 ng·g-1范圍內(nèi)小幅波動(dòng)，并在150 d時(shí)達(dá)到最大值(22.36 ng·g-1)，較處理前(18.39 ng·g-1)顯著增加約21.63%(圖5 A)。

赤霉素(GA)含量整體呈上升趨勢(shì)。GA含量在層積的前90 d內(nèi)平穩(wěn)上升，90～120 d期間顯著上升(P<0.05)，并在120 d時(shí)達(dá)到最大值(109.47 ng·g-1),而后下降，但最終含量(94.89 ng·g-1)依然較處理前(70.29 ng·g-1)顯著增加約35.01%(圖5 B)。

脫落酸(ABA)含量在層積的前30 d迅速升高，30～120 d期間在157.66～172.52 ng·g-1范圍內(nèi)小幅波動(dòng)，后顯著下降(P<0.05)(圖5C)。

各內(nèi)源激素含量間比值在常溫層積(1～90 d)過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，在低溫層積(90～150 d)過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，并始終表現(xiàn)為(GA+IAA)/ABA最大，GA/ABA次之，IAA/ABA明顯小于前兩者，且變幅較小(圖5D)。

圖5 淫羊藿種子層積過(guò)程中內(nèi)源激素含量及其比值的變化Fig.5 Changes of endogenous hormone content and their ratios in seeds of Epimedium brevicornu Maxim. during stratification

2.5 影響胚率的關(guān)鍵生理特性分析

層積過(guò)程中生理生化指標(biāo)與胚率的相關(guān)分析表明(表1)，除可溶性糖外，其他生理生化指標(biāo)均與胚率呈正相關(guān)關(guān)系，其中淀粉(r=0.539)、GA(r=0.615)、IAA(r=0.652)含量與胚率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

表1 各指標(biāo)與胚率的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between each index and embryo rate

3 討論

3.1 后熟與種胚形態(tài)的關(guān)系

研究表明，休眠分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和綜合休眠5種休眠類型，其中種胚形態(tài)尚未發(fā)育完全被稱為形態(tài)休眠[17]。老山芹種子存在形態(tài)后熟現(xiàn)象，在層積過(guò)程中，種胚由心形胚及魚雷胚階段，逐漸發(fā)育為子葉胚階段，完成形態(tài)后熟過(guò)程[18]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿種子由于種胚尚未發(fā)育完全，種子在層積處理前多數(shù)為球形胚，具有形態(tài)休眠，淫羊藿種胚在變溫層積過(guò)程中伸長(zhǎng)發(fā)育，層積后胚率顯著上升(P<0.05)；胚形態(tài)在層積過(guò)程中由最初的球形胚發(fā)育為心形胚最后形成子葉胚。此結(jié)果與鐵筷子[19]和東北刺人參種子[20]在后熟過(guò)程種胚的發(fā)育過(guò)程相似。

3.2 后熟與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

種子在打破休眠的過(guò)程中，伴隨著內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化。淀粉是植物體內(nèi)重要的儲(chǔ)藏物質(zhì)，在維持碳水化合物供需平衡中起到重要作用?？扇苄蕴鞘谴x的中間產(chǎn)物，它是由淀粉降解產(chǎn)生，同時(shí)又作為呼吸底物被消耗，因此，可溶性糖含量的高低既與淀粉降解的速度有關(guān)，又與呼吸消耗的速度有關(guān)[21]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)物質(zhì)，在種子生長(zhǎng)發(fā)育中起到提供氮素的重要作用，為種胚的生長(zhǎng)提供物質(zhì)能量[22]。

在本試驗(yàn)的變溫層積過(guò)程中，淫羊藿種子內(nèi)淀粉含量先降低后升高，其含量在層積前后無(wú)顯著差異，可溶性糖含量下降，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著上升(P<0.05)。在層積的前30 d種子內(nèi)淀粉含量顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明在變溫層積前期淀粉酶加速對(duì)淀粉的分解，種子內(nèi)代謝活動(dòng)加強(qiáng)，種子對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量增加，淀粉被轉(zhuǎn)化成可溶性糖等物質(zhì)，為種子萌發(fā)提供養(yǎng)分。隨著層積天數(shù)的增加，種子內(nèi)的淀粉含量逐漸上升，原因是淫羊藿種子內(nèi)部?jī)?chǔ)存能量，為種子萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，此結(jié)果與薛晨陽(yáng)對(duì)黃精種子的研究結(jié)果相似[23]。結(jié)果顯示種子內(nèi)淀粉含量在層積30～150 d期間顯著上升(P<0.05)，種子胚率在此階段同樣呈上升趨勢(shì)，且相關(guān)性結(jié)果表明淀粉含量與胚率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.539)，說(shuō)明淀粉積累可能利于胚形態(tài)發(fā)育，淀粉含量的升高，對(duì)種子打破休眠、促進(jìn)萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。可溶性糖在層積前期含量顯著減少(P<0.05)，是因?yàn)榉N子中呼吸消耗的速度(即種子中被消耗的可溶性糖)大于種子中淀粉降解的速度(即種子中產(chǎn)生的可溶性糖)，可溶性糖分解產(chǎn)生能量，供應(yīng)給種子維持正常的生理活動(dòng)，在60～120 d期間，可溶性糖含量小幅上升，表明層積過(guò)程中種子內(nèi)大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為可溶性糖，為種子萌發(fā)做準(zhǔn)備，120～150 d含量顯著降低(P<0.05)，可溶性糖逐漸分解，為種子萌發(fā)提供能量，假色槭種子在層積過(guò)程中可溶性糖含量同樣為先下降再上升最后下降，總體呈降低的變化規(guī)律[24]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量在淫羊藿種子層積前后顯著增加(P<0.05)，種子胚率同樣顯著增加，可能與可溶性蛋白質(zhì)是部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)物質(zhì)，在種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程通過(guò)提供氮素，為種胚的生長(zhǎng)提供物質(zhì)能量有關(guān)。這與王妮妮等對(duì)天女木蘭種子進(jìn)行室內(nèi)控制變溫的研究結(jié)果一致[25]。

3.3 后熟與呼吸代謝的關(guān)系

氧化調(diào)節(jié)學(xué)說(shuō)認(rèn)為植物體內(nèi)有三條最基本的呼吸代謝途徑，具體為糖酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(PPP)、三羧酸循環(huán)途徑(TCA)[26]。研究表明種子從休眠到萌發(fā)的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也是EMP和TCA向PPP的轉(zhuǎn)變[27]。G-6-PD作為PPP途徑的關(guān)鍵限速酶，一定程度上反映了相應(yīng)呼吸途徑的活化水平。如華重樓種子休眠解除過(guò)程中G-6-PD活性提高，促進(jìn)PPP途徑順利運(yùn)行,從而促進(jìn)華重樓種子休眠的解除[28]。楊曉玲等[29]在山楂種子的研究中發(fā)現(xiàn)，在種子層積后PPP途徑顯著加強(qiáng),并促進(jìn)了非糖物質(zhì)的氧化分解。本研究結(jié)果表明，在層積處理過(guò)程中，作為PPP途徑的限速酶，G-6-PD活性顯著升高(P<0.05)，PPP途徑逐漸活化。

3.4 后熟與內(nèi)源激素的關(guān)系

植物激素對(duì)種子的休眠萌發(fā)具有重要的調(diào)節(jié)作用，ABA可以誘導(dǎo)種子休眠，它對(duì)種子的生理代謝和酶活性有抑制作用，通過(guò)影響核酸與有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，抑制種子萌發(fā)[30]。GA可拮抗ABA的抑制效應(yīng)，是促進(jìn)種胚生長(zhǎng)，激發(fā)種子萌發(fā)的物質(zhì)，通過(guò)刺激誘導(dǎo)水解酶，削弱屏障組織(如胚乳或種皮)，誘導(dǎo)種子中貯藏物質(zhì)的儲(chǔ)備，刺激胚的生長(zhǎng)，以促進(jìn)萌發(fā)，從而打破種子休眠[31]。IAA通過(guò)調(diào)控ABA,GA的合成和傳導(dǎo)影響種子的休眠及萌發(fā)[32]。但有關(guān)IAA對(duì)于種子的休眠與萌發(fā)目前尚有不同說(shuō)法，樹莓種子在打破休眠的過(guò)程中IAA含量呈上升趨勢(shì)[33]，還有研究表明，IAA具有誘導(dǎo)種子休眠的作用[34]。金銀花種子在層積過(guò)程中GA,IAA含量呈升高趨勢(shì)，促進(jìn)休眠的解除[35]。種子休眠的釋放和萌發(fā)是多種激素之間相互作用的結(jié)果,某一種激素含量和敏感性的變化并不能完成這一復(fù)雜的生理過(guò)程[36],種子的休眠與萌發(fā)不僅與植物內(nèi)源激素的絕對(duì)含量有關(guān)，還與各類促生長(zhǎng)的激素與抑制生長(zhǎng)的激素之間的比例及平衡有關(guān)[37]。同時(shí)GA與ABA的比值被認(rèn)為是影響種子休眠的一個(gè)重要原因，是植物種子休眠狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)因素[38]。GA與ABA比值升高會(huì)促進(jìn)種子萌發(fā)、解除種子休眠，反之則抑制萌發(fā)[26]。司倩倩等[39]研究發(fā)現(xiàn)玉鈴花種子在打破種子休眠過(guò)程中GA/ABA，IAA/ABA均呈升高趨勢(shì)。張成才等[40]對(duì)百蕊草休眠解除的研究也得出類似結(jié)論。本研究結(jié)果表明，淫羊藿種子在層積過(guò)程中GA及IAA含量整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，通過(guò)拮抗ABA的抑制作用促進(jìn)種胚生長(zhǎng)發(fā)育，ABA含量在后期顯著降低(P<0.05)。GA/ABA,IAA/ABA,(IAA+GA)/ABA的比值均在低溫層積(90～150 d)中顯著升高，同時(shí)在此階段種子胚率同樣顯著上升(P<0.05)，說(shuō)明低溫層積中萌發(fā)促進(jìn)類激素比例的增高，是種子打破休眠、促進(jìn)萌發(fā)的關(guān)鍵因素。

4 結(jié)論

本研究表明淫羊藿種子存在形態(tài)休眠現(xiàn)象；在變溫層積過(guò)程中種胚發(fā)育與淀粉含量、IAA含量、GA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化為種子打破休眠過(guò)程中的呼吸代謝提供能量，并為種子萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)；促生長(zhǎng)類激素與抑制生長(zhǎng)類激素比值增大，則促進(jìn)種胚生長(zhǎng)發(fā)育。綜上所述，在淫羊藿種子種胚發(fā)育過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及呼吸途徑的相互轉(zhuǎn)化、內(nèi)源激素的合成與傳導(dǎo)，有效促進(jìn)了種子形態(tài)后熟，為淫羊藿種子變溫層積打破休眠提供理論依據(jù)。