盧宏全，黃國定，林影，張誠勝

（1.海南西部中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，海南 儋州 571700；2.海南西部中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571700；3.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，海南 ?？?570311）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是惡性程度最高的一種類型，占乳腺癌的15%～20%[1-2]。TNBC具有發(fā)展迅速、易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差、病死率高的特點。目前TNBC 缺乏特異性治療靶點，因此了解TNBC 的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療靶點對于治療TNBC 具有重要意義[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一種無編碼蛋白功能的RNA，近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG6 在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上能調(diào)控基因表達(dá)，從而在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[4-5]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)TNBC 組織與正常組織、TNBC 細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞的SNHG6表達(dá)差異顯著，TNBC 組織及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG6高表達(dá)。且microRNA-26b-5p（miR-26b-5p）在乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用已得到證實[6-7]。因此，本文旨在探究lncRNA SNHG6 通過miR-26b-5p 對TNBC 細(xì)胞行為學(xué)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

人TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 細(xì)胞（上海弘順生物科技有限公司）。

1.2 主要試劑及儀器

miR-26b-5p 抑制物、SNHG6 敲減的慢病毒載體（南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司），Lipofectamine 2000 試劑（美國Invitrogen 公司），TRIzol 試劑（上海聯(lián)碩生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）試劑盒（上海一研生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（上海漢恒生物工程有限公司），基質(zhì)膠（美國Corning 公司），熒光素酶檢測劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：120300，北京澤平科技有限責(zé)任公司），倒置熒光顯微鏡（型號：DMi8A，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司），生物發(fā)光檢測儀（型號：lucetta 2，北京澤平科技有限責(zé)任公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將MDA-MB-231 細(xì)胞解凍至室溫，接種于DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)CO2濃度為5%，溫度為37℃，飽和濕度。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細(xì)胞，按1×105個/孔的密度接種于6 孔板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

分別設(shè)置對照組、SNHG6 敲減組、miR-26b-5p抑制組、共轉(zhuǎn)染組。對照組采用空載質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，SNHG6 敲減組采用si-SNHG6 慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-26b-5p 抑制組采用空載質(zhì)粒及miR-26b-5p-inhibitor 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染組同時采用si-SNHG6慢病毒載體及miR-26b-5p-inhibitor 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作，參照細(xì)胞分組的干預(yù)內(nèi)容進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（綠色熒光檢測）[8]。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染效率＞70%。MDA-MB-231 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，后續(xù)所有實驗均設(shè)置4 個復(fù)孔，各實驗重復(fù)3 次，并取均值。

1.5.2 qRT-PCR 檢測細(xì)胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA 的表達(dá)采用TRIzol 試劑盒提取MDA-MB-231 細(xì)胞總RNA，并檢測RNA 濃度及純度，以RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cRNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，SYBR 10 μL，正向、反向引物各1 μL，純水6 μL。擴(kuò)增條件：95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 s，共40 次循環(huán)[9]。采用2-ΔΔCt法計算SNHG6、miR-26b-5p 相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.3 CCK-8法檢測MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力MDA-MB-231 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，在96 孔板中，每孔接種0.1 mL 細(xì)胞懸液，分別于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h，每孔加入0.1 mL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處光密度（optical density,OD）值，根據(jù)OD 值判斷細(xì)胞增殖能力。

1.5.4 劃痕實驗檢測MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力MDA-MB-231 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，于6 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔取2×103個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁生長，采用移液槍頭于培養(yǎng)孔背后垂直劃線，沖洗后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h 與24 h 取出，觀察劃痕愈合情況，拍照取樣后利用Image 軟件測量劃痕區(qū)寬度，計算不同時間的劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（d0hd24h）/d0h×100%）[10]

1.5.5 Transwell 實驗檢測MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲能力MDA-MB-231 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，制成細(xì)胞密度為2×104個/mL 的細(xì)胞懸液，向Transwell 小室上室加入50 μL 稀釋的基質(zhì)膠，凝固后加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入500 mL DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，移去培養(yǎng)液，輕輕擦去上室剩余細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后，加入0.1%結(jié)晶紫染色，15 min 后顯微鏡下觀察，記錄紫色細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取3 個視野的均值[11]。

1.5.6 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG6 與miR-26b-5p 的靶向作用將SNHG6基因插入到熒光素酶基因上游，構(gòu)建SNHG6-Wt（野生型）、SNHG6-Mut（突變型）的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，采用miR-26b-5p-mimics-NC 質(zhì)粒及miR-26b-5p-mimics 質(zhì)粒，與SNHG6-Wt、SNHG6-Mut 共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 細(xì)胞，最終得到 miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Wt、miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Mut、miR-26b-5pmimics-SNHG6-Wt、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Mut，4 種細(xì)胞，并分為4 組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，裂解細(xì)胞并離心，收集上清液，分別向上清液中加入反應(yīng)液及終止液各50 μL，最終采用生物發(fā)光檢測儀檢測熒光素酶活性[12]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA 相對表達(dá)量比較

對照組、SNHG6 敲減組、miR-26b-5p 抑制組、共轉(zhuǎn)染組SNHG6 和miR-26b-5p mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，SNHG6 敲減組SNHG6 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與對照組比較，miR-26b-5p 抑制組SNHG6 mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與SNHG6 敲減組比較，miR-26b-5p 抑制組和共轉(zhuǎn)染組SNHG6 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與miR-26b-5p 抑制組比較，共轉(zhuǎn)染組SNHG6 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與SNHG6 敲減組比較，P＜0.05；③與miR-26b-5p抑制組比較，P＜0.05。

miR-26b-5p mRNA 1.00±0.01 3.26±0.34①0.73±0.07①②1.42±0.15①②③145.535 0.000組別對照組SNHG6敲減組miR-26b-5p抑制組共轉(zhuǎn)染組F 值P 值SNHG6 mRNA 1.00±0.01 0.68±0.07①1.72±0.20①②1.15±0.16②③42.884 0.000

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況比較

對照組、SNHG6 敲減組、miR-26b-5p 抑制組、共轉(zhuǎn)染組24 h、48 h、72 h 的OD 值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點OD 值有差異（F=52.481，P=0.000）。②4 組OD 值有差異（F=50.336，P=0.000），與對照組比較，SNHG6 敲減組及共轉(zhuǎn)染組24 h、48 h 及72 h 的OD 值降低（P＜0.05），miR-26b-5p 抑制組24 h、48 h 及72 h 的OD 值升高（P＜0.05）；與SNHG6 敲減組比較，miR-26b-5p 抑制組和共轉(zhuǎn)染組24 h、48 h 及72 h 的OD 值升高（P＜0.05）；與miR-26b-5p 抑制組比較，共轉(zhuǎn)染組OD 值降低（P＜0.05）。③4 組OD 值變化趨勢有差異（F=20.109，P=0.000）。見表3。

表3 各組不同時間點MDA-MB-231細(xì)胞OD值比較 （±s）

表3 各組不同時間點MDA-MB-231細(xì)胞OD值比較 （±s）

注：①與24 h比較，P＜0.05；②與48 h比較，P＜0.05；③與對照組比較，P＜0.05；④與SNHG6敲減組比較，P＜0.05；⑤與miR-26b-5p抑制組比較，P＜0.05。

72 h 0.68±0.07①②0.32±0.04①③0.84±0.09①②③④0.44±0.05①③④⑤組別對照組SNHG6敲減組miR-26b-5p抑制組共轉(zhuǎn)染組24 h 0.41±0.05 0.15±0.02③0.58±0.08③④0.27±0.04③④⑤48 h 0.57±0.06①0.27±0.03①③0.71±0.07①③④0.38±0.04①③④⑤

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移情況比較

對照組、SNHG6 敲減組、miR-26b-5p 抑制組、共轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率分別為（29.20±3.81）%、（11.61±2.04）%、（52.18±6.25）%和（16.73±3.11）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=79.321，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，SNHG6 敲減組和共轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率降低（P＜0.05），miR-26b-5p抑制組劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與SNHG6 敲減組比較，miR-26b-5p 抑制組和共轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與miR-26b-5p 抑制組比較，共轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移圖

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲情況比較

對照組、SNHG6 敲減組、miR-26b-5p 抑制組、共轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（78.18±8.41）個/HP、（31.84±4.66） 個/HP、（108.38±11.05） 個/HP 和（49.61±5.38）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.945，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，SNHG6 敲減組及共轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），miR-26b-5p 抑制組侵襲細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與SNHG6 敲減組比較，miR-26b-5p 抑制組和共轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與miR-26b-5p 抑制組比較，共轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲情況 （0.1%結(jié)晶紫染色×400）

2.5 雙熒光素酶實驗結(jié)果

miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Wt 組、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Wt 組熒光素酶活性分別為（1.01±0.07）和（0.41±0.10），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=59.445，P=0.000），miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Wt 組熒光素酶活性降低。miR-26b-5pmimics-NC-SNHG6-Mut 組、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Mut 組熒光素酶活性分別為（0.95±0.05）和（1.04±0.08），經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.843，P=0.076）。見圖3。

圖3 miR-26b-5p與SNHG6的靶向關(guān)系

3 討論

TNBC 是一種惡性程度較高的惡性腫瘤，具有發(fā)病急、預(yù)后差、病死率高的特點，其病因復(fù)雜，與性激素環(huán)境、生活方式等有一定關(guān)系[13]。目前臨床主要以化療或靶向治療為主，化療需要長期治療，副作用明顯且療效有限，而TNBC 缺乏治療靶點，因此尋找TNBC 新的治療靶點成為研究的熱點[14-15]。SNHG6 在結(jié)直腸癌、肺癌及膠質(zhì)瘤等癌癥中異常表達(dá)，且有研究顯示，SNHG6 高表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[16-17]。趙焱等[18]研究顯示，SNHG6 在舌癌組織中高表達(dá)，敲減舌癌細(xì)胞中SNHG6 表達(dá)能夠抑制Tca1183 舌癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此推測SNHG6 對TNBC 細(xì)胞的增殖、遷移等具有一定的影響。本課題前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)microRNA 中，干擾SNHG6 對hsa-miR-26b-5p 的影響最明顯，因此本文旨在探究SNHG6 通過miR-26b-5p 調(diào)控TNBC 的作用機(jī)制。

miR-26b-5p 在癌細(xì)胞中一般發(fā)揮抑癌基因的作用，在卵巢癌、胰腺癌及甲狀腺乳頭狀癌中，對癌細(xì)胞的生物學(xué)行為均發(fā)揮一定的調(diào)控作用，影響癌癥的發(fā)展[19-21]。本研究經(jīng)過前期基礎(chǔ)實驗得知，SNHG6 在MDA-MB-231 細(xì)胞中同樣高表達(dá)，但抑制SNHG6 的表達(dá)對調(diào)控miR-26b-5p，影響MDA-MB-231 細(xì)胞的生物學(xué)行為尚不清楚。lncRNA 與miRRNA 存在某種靶向關(guān)系，能夠影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。昝玲玲等[22]研究顯示，抑制miR-30-5p 的表達(dá)，能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)SNHG6 對乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的抑制作用。在張明寶[23]的研究中，lncRNA SNHG5 能夠靶向調(diào)控下游靶點miR-132-3p，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和遷徙，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。本研究在前期基礎(chǔ)實驗中發(fā)現(xiàn)，干擾SNHG6 對hsa-miR-26b-5p 的影響最大，因此通過敲減SNHG6，分析對miR-26b-5p 調(diào)控作用，以及對TNBC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究結(jié)果顯示，敲減SNHG6 能夠降低OD 值、劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)，抑制miR-26b-5p 能夠增加OD 值、劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)，而敲減SNHG6 的同時抑制miR-26b-5p 能夠進(jìn)一步降低OD值、劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)，表明敲減SNHG6 能夠抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，從而延緩TNBC 的發(fā)展，且進(jìn)一步證實miR-26b-5p 同樣具有抑制TNBC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的能力。另外，本研究通過雙熒光素酶實驗及qRT-PCR 檢測進(jìn)一步證實，SNHG6 與miR-26b-5p 基因序列上存在結(jié)合位點，SNHG6 低表達(dá)能夠靶向調(diào)控miR-26b-5p 表達(dá)升高，抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的生物學(xué)行為；而抑制miR-26b-5p 表達(dá)能夠影響SNHG6 的表達(dá)，從而促進(jìn)MDA-MB-231 細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，在敲減SNHG6 及抑制miR-26b-5p 表達(dá)的雙重作用下，抑制miR-26b-5p 表達(dá)能夠抵消掉部分敲減SNHG6 對上調(diào)miR-26b-5p 表達(dá)的促進(jìn)作用，從而影響MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

綜上所述，敲減SNHG6 通過靶向上調(diào)MDAMB-231 細(xì)胞中miR-26b-5p 的表達(dá)，抑制TNBC 增殖、遷移及侵襲，為TNBC 新的治療靶點提供新的研究方向。本文僅通過敲減SNHG6，探究SNHG6 通過miR-26b-5p 調(diào)節(jié)TNBC 的作用，未來可期通過SNHG6 過表達(dá)或miR-26b-5p 過表達(dá)，進(jìn)一步研究SNHG6 對miR-26b-5p 的靶向調(diào)控作用，為TNBC 的靶向治療提供更為科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炑芯恐С帧?/p>