線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3 在甲狀腺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

孫美濤，趙恒宇，李曉燕，馮琛卓，熊 偉

（1.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，浙江，杭州 310053；2.杭州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，浙江，杭州 310053；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南，大理 671000）

甲狀腺癌（Thyroid Carcinoma，THCA）嚴(yán)重威脅人類健康，已成為威脅中國女性健康的第五大癌癥，并且是兒童最常見的內(nèi)分泌腫瘤[1-2]。全世界約有4%的女性腫瘤病例和11%的青少年腫瘤病例為甲狀腺癌[3]。據(jù)有關(guān)報(bào)道，甲狀腺結(jié)節(jié)檢出率高達(dá)20%到76%，并且該結(jié)果已經(jīng)得到了尸檢的驗(yàn)證[4]。檢出甲狀腺結(jié)節(jié)的人群中，約有7%～15%的人患有甲狀腺癌[5]。目前，針對甲狀腺結(jié)節(jié)人群，臨床上多使用超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢的方法，但該方法在不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)操作方法差異較大，有較多的禁忌癥，故仍有局限性[5]。而甲狀腺癌的治療方法主要為手術(shù)治療、放射性碘治療、促甲狀腺激素抑制療法等，但上述治療方法缺乏可靠的臨床證據(jù)，仍存在一定的爭議[6-7]。因此，甲狀腺癌仍缺乏特異性強(qiáng)的分子標(biāo)志物供臨床診斷與治療使用。目前，尋找甲狀腺癌特異分子標(biāo)志和靶標(biāo)是醫(yī)學(xué)研究亟待解決的問題。

細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（Mitochondrial transcription termination factor 3，MTERF3）是細(xì)胞內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（Mitochondrial transcription termination factor，MTERF）家族成員之一，是核基因編碼并依賴高遷移蛋白轉(zhuǎn)移到線粒體的蛋白質(zhì)，該基因定位于8q22.1，是結(jié)合于線粒體DNA啟動(dòng)子區(qū)域的負(fù)調(diào)控因子，抑制線粒體DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的功能，對細(xì)胞能量代謝和氧化應(yīng)激有著重要作用[8-10]。Park 等[9]的研究表明，MTERF3是胚胎發(fā)育中不可或缺的基因，敲除MTERF3 將引起小鼠胚胎死亡。MTERF3 蛋白表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展都密切相關(guān)[11]。目前該基因的異常表達(dá)與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的相關(guān)性研究報(bào)道較少。

本研究分析MTERF3 在甲狀腺癌與癌旁組織中表達(dá)差異，構(gòu)建蛋白互作模型分析其生物學(xué)功能，分析其表達(dá)異常對于腫瘤免疫浸潤的影響，探究MTERF3 表達(dá)異常對于患者生存的影響，分析臨床基線資料明確其臨床意義，旨在為甲狀腺癌診療領(lǐng)域提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理

我們研究組使用TCGA 的THCA 項(xiàng)目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM 格式的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并將FPKM 格式轉(zhuǎn)化為了TPM 格式，隨后進(jìn)行了log2 轉(zhuǎn)換。同時(shí)使用UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages）處理后的TCGA 和GTEx 中TPM 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換[12]。本研究使用的R 軟件版本為3.6.3，生存分析Cutoff 設(shè)定為50%，P＜0.05被考慮為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 MTERF3 細(xì)胞定位及功能分析

使用Protter 數(shù)據(jù)庫以明確MTERF3 在細(xì)胞內(nèi)外的定位[13]。從HPA 數(shù)據(jù)庫中下載EFO-21、HEL、U-2 OS 細(xì)胞的細(xì)胞核、微管、MTERF3 免疫熒光染色圖片，以精確MTERF3 的亞細(xì)胞定位[14-16]。使用GPS-Prot 篩選與MTERF3 相關(guān)的40 個(gè)基因以探究MTERF3 的功能，并使用R 軟件的clusterProfiler包進(jìn)行富集分析[17-18]。

1.3 MTERF3 表達(dá)差異與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系分析

使用R 軟件的ggplot2 對TCGA 中MTERF3 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如樣本不服從正態(tài)分布，則使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。同時(shí)使用ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫中收錄的Huiling He 等[19]的研究結(jié)果進(jìn)行論證。

使用TIMER 在線工具分析MTERF3 表達(dá)高低對B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤程度的影響，分析MTERF3 臂刪除和臂增益變化對上述免疫細(xì)胞浸潤程度造成的影響[20-21]。

1.4 MTERF3 表達(dá)差異與生存預(yù)后、患者相關(guān)特征的關(guān)系

使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析MTERF3 表達(dá)差異對患者總生存期和無病生存期的影響[22]。用R 軟件的survival 包和surviminer 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌的臨床信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[23]。如服從正態(tài)分布，則使用卡方（x2）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTERF3 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并參與線粒體基因表達(dá)調(diào)控

MTERF3 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示其定位于胞內(nèi)（如圖1A）。對免疫熒光圖片進(jìn)行分析可知MTERF3 在EFO-21、HEL、U-2 OS 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中均有分布，且MTERF3 抗體的熒光不與細(xì)胞核和微管重疊（圖1E 和1B）。該基因在肺鱗癌、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌等腫瘤中都存在異常表達(dá)的情況。通過對MTERF3 及其相關(guān)蛋白進(jìn)行富集分析，可知其主要參與核糖體大亞基組裝及線粒體基因表達(dá)等生物過程（圖1C 和1D）。

圖1 MTERF3 的細(xì)胞定位、蛋白互作及主要功能Fig.1 Cell localization,protein interaction and main functions of MTERF3

2.2 MTERF3 在甲狀腺癌與癌旁組織中表達(dá)差異及預(yù)后意義

通過使用TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)以及ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫，Huiling He 等[19]研究也同樣表明MTERF3 轉(zhuǎn)錄組在甲狀腺癌組織中表達(dá)低于癌旁組織（P＜0.05）（如圖2A、2B、2C）。

MTERF3 在甲狀腺癌中表達(dá)與患者預(yù)后具有相關(guān)性，甲狀腺癌組織中MTERF3 低表達(dá)提示患者預(yù)后不良。腫瘤組織中MTERF3 低表達(dá)甲狀腺癌患者無病生存期（disease free survival，DFS）和無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）與高表達(dá)的患者的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2D和2E），但其總生存期（overall survival，OS）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2F）。因此，甲狀腺癌組織MTERF3 低表達(dá)提示患者預(yù)后不良。

圖2 MTERF3 在甲狀腺癌中的表達(dá)差異和生存分析Fig.2 Expression difference and survival analysis of MTERF3 in Thyroid Carcinoma

2.3 MTERF3 表達(dá)差異與免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)

MTERF3 表達(dá)水平與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤水平負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（如圖3A）。MTERF3臂刪除使B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤水平顯著降低（P＜0.01）（圖3B）。

圖3 MTERF3 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤情況相關(guān)性Fig.3 Correlation between MTERF3 expression and immune cell infiltration

2.4 MTERF3 表達(dá)與甲狀腺癌患者特征關(guān)聯(lián)性

MTERF3 的表達(dá)與T 分期（P=0.035）、年齡（P=0.025）、甲狀腺外延展情況（P=0.006）、PFS（P=0.013）明顯相關(guān)。而與N 分期、性別、甲狀腺疾病史及OS 無關(guān)（P＞0.05），如表1 所示。

表1 基線資料表Table 1 Baseline data sheet

3 討論

甲狀腺癌已成為世界上最常見的內(nèi)分泌腫瘤之一，并且已成為我國發(fā)病增長率最高的內(nèi)分泌惡性腫瘤[24]。根據(jù)病理組織類型分型，甲狀腺癌可分為甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、未分化型甲狀腺癌等[24]。目前，甲狀腺癌發(fā)生的分子機(jī)制尚未闡明，較多學(xué)者研究認(rèn)為，促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和磷脂酰肌醇通路（PI3K-Akt signaling pathway）與甲狀腺癌的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)[25-26]。有研究表明，受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）突變也與甲狀腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，RTK 突變后可活化下游通路從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[25]。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)的學(xué)者認(rèn)為，甲狀腺乳頭狀癌是一種MAPK 驅(qū)動(dòng)的腫瘤，MAPK 信號通路可以促進(jìn)正常的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的癌化[27-28]。RAS 是一種與鳥嘌呤結(jié)合的蛋白，它的功能類似于分子開關(guān)，它在RAS-GTP 和RAS-GDP 兩種結(jié)合形式中轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)控下游PI3K-Akt 等信號通路[29-30]。RAS 突變在甲狀腺癌中較常見，在甲狀腺癌各亞型中占比可達(dá)10% ～50%，RAS 突變能夠激活PI3K-Akt 信號通路，導(dǎo)致該信號通路的分子異常表達(dá)，從而促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)展[31,26]。

隨著現(xiàn)代分子測序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA在甲狀腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用也逐漸受到學(xué)界重視。李勇等[32]認(rèn)為小RNA（MicroRNA，miRNA）在甲狀腺癌患者的體液和外泌體中存在表達(dá)差異，在甲狀腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮重要作用。朱楚夢等[33]學(xué)者認(rèn)為，長鏈非編碼RNA（LncRNA）也在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。LncRNA 能夠調(diào)節(jié)自噬、凋亡、PI3K-Akt等信號通路[33]。LncRNA 可以作為miRNA 的前體分子調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)，調(diào)控編碼基因的啟動(dòng)子影響基因表達(dá)，能與特定蛋白結(jié)合從而調(diào)節(jié)蛋白活性[33]。劉長路等[34]研究表明，攝碘不足、電離輻射、激素和遺傳等因素與甲狀腺癌的發(fā)生相關(guān)。雖然甲狀腺癌病死率低，但其發(fā)病率極高，并且在女性中的發(fā)病率高于男性[35]。在體檢觸診中，甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率極高，引起人們的高度關(guān)注[4,36]。近年來，多種新型檢查技術(shù)的運(yùn)用顯著提高了甲狀腺癌的確診率，但有創(chuàng)的檢查存在禁忌癥和潛在的不良反應(yīng)，從而對患者造成負(fù)面影響。有研究報(bào)道，使用蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)尋找甲狀腺癌的核心蛋白，對甲狀腺癌的確診有較高的預(yù)測效率[37]。此外，放化療對甲狀腺癌患者療效較差[38]。因此，明確甲狀腺癌的分子診斷標(biāo)記和尋找靶向藥物治療是亟待解決的問題。在醫(yī)學(xué)臨床上，對甲狀腺癌患者多采用手術(shù)治療，并聯(lián)合放射性碘治療[39]。但隨著臨床技術(shù)的提高，熱消融、免疫治療和分子靶向治療也成為了輔助治療甲狀腺癌患者的手段[39-41]。

MTERF 是一個(gè)比較保守的蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)該家族由4 個(gè)成員組成（MTERF1～MTERF4），存在于動(dòng)、植物的細(xì)胞中，定位于植物的葉綠體和動(dòng)、植物的線粒體，與線粒體DNA 結(jié)合，從而影響線粒體的功能[11,42]。該家族成員調(diào)控線粒體DNA轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)線粒體RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（NOP2/Sun RNA methyltransferase 4，NSUN4）靶向線粒體核糖體大亞基，從而在調(diào)節(jié)線粒體基因的翻譯中發(fā)揮重要作用[43-46]。MTERF3 是MTERF 蛋白家族的重要成員，結(jié)合于線粒體DNA 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，抑制線粒體DNA 的轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞能量的產(chǎn)生[11]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，MTERF3 在線粒體DNA 的轉(zhuǎn)錄中起到負(fù)調(diào)控的作用，該基因與線粒體DNA 的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，對線粒體DNA 的基因表達(dá)發(fā)揮其抑制作用[9]。

有諸多學(xué)者研究表明，該基因?qū)δ[瘤、線粒體相關(guān)疾病、神經(jīng)退行性疾病的診療有潛在的價(jià)值[47-48]。該基因在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌、大腸腺癌、肝細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)水平顯著高于正常組織[49-55]。有研究報(bào)道，MTERF3 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中上調(diào)白介素6 和白介素11，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[56]。原因可能是MTERF3高表達(dá)抑制了線粒體DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，造成線粒體呼吸酶活性降低，從而細(xì)胞內(nèi)ATP 合成減少[11,52]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)MTERF3 在甲狀腺癌中的表達(dá)顯著低于正常甲狀腺組織，與胃癌、肺癌、子宮頸癌等腫瘤組織的表達(dá)情況不同。因此，后續(xù)研究應(yīng)注重闡明該基因在甲狀腺癌中異常表達(dá)的原因。

本研究分析多組學(xué)數(shù)據(jù)可知，MTERF3 定位于線粒體，與線粒體和核糖體的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，它通過影響線粒體基因轉(zhuǎn)錄、線粒體核糖體大亞基裝配從而對線粒體基因表達(dá)產(chǎn)生影響；該基因在甲狀腺癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁組織；該基因低表達(dá)的患者無進(jìn)展生存期更短，提示患者預(yù)后較差；該基因低表達(dá)有著較高的免疫細(xì)胞浸潤水平；該基因表達(dá)情況與患者的疾病分期、甲狀腺是否外延伸及患者的預(yù)后有一定的相關(guān)性。

本研究針對MTERF3 在甲狀腺癌中的表達(dá)及預(yù)后情況進(jìn)行了相對全面的生物信息學(xué)分析。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展并不是由單一的基因起決定性作用，目前已有研究者對甲狀腺癌相關(guān)的基因集通路進(jìn)行分析，以期待為甲狀腺癌診斷、預(yù)后、靶向治療提供可靠的生物標(biāo)記物[42,57]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MTERF3 低表達(dá)的甲狀腺癌患者的預(yù)后較差。也有研究報(bào)道，MTERF3 表達(dá)降低會(huì)促進(jìn)線粒體DNA 轉(zhuǎn)錄，并阻礙線粒體中核糖體大亞基的組裝[11,58]。因此，MTERF3 在甲狀腺癌患者中表達(dá)較低的原因可能為，MTERF3 低表達(dá)的患者有較少數(shù)量的MTERF3 與線粒體DNA 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域結(jié)合，從而對線粒體DNA 的負(fù)性調(diào)控作用較弱，線粒體DNA 的基因表達(dá)增加，同時(shí)影響線粒體中核糖體的功能，促進(jìn)ATP 合成，使得MTERF3 低表達(dá)的患者腫瘤細(xì)胞能量代謝更為旺盛，有利于甲狀腺癌細(xì)胞的增殖[11,55,58]。盡管本研究通過多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床基線資料初步得出MTERF3 低表達(dá)與甲狀腺癌進(jìn)展有關(guān)聯(lián)的結(jié)論，但仍缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來明確其具體的機(jī)制。在后續(xù)研究中，我們將使用小干擾RNA 在甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建MTERF3 基因沉默模型，明確MTERF3 低表達(dá)對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響，探究MTERF3 低表達(dá)對于甲狀腺癌細(xì)胞能量代謝和線粒體功能的影響及相關(guān)機(jī)制，從而為甲狀腺癌診療領(lǐng)域提供理論參考。