光甘草定/環(huán)糊精固體包合物的制備和性質(zhì)

姚培培，樊金玲，李德鋒，張曉宇，任國艷，杜 琳

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

光甘草定（glabridin，GLD）是光果甘草特有的疏水性異黃酮類化合物，含量為0.1%～0.3%，具有抗色素異常沉積、抗氧化、抗細胞增殖、抗炎、增強記憶力、抗骨質(zhì)疏松和抗菌等多種生物活性。GLD難溶于水（7 μg/mL，25 ℃），導致其在體內(nèi)胃腸道中的溶出率低、吸收和生物利用率差，在水溶性基質(zhì)的食品和藥品等相關領域的應用也因此受到極大的限制。因此，提高GLD在水中的溶解度是開發(fā)其潛在應用價值的關鍵所在。

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環(huán)狀碳水化合物的總稱，最常見的是-、-、-CD，分別由6～8 個葡萄糖單元通過-1,4-糖苷鍵連接而成。CD各葡萄糖單元的2、3、6位羥基由不同的官能團取代，可得到一系列衍生物，如6-羥丙基--環(huán)糊精（6-hydroxypropyl-cyclodextrin，6-HP--CD）、2,6-二甲基--環(huán)糊精（2,6-di--methyl--cyclodextrin，2,6-M--CD）和2-磺丁基--環(huán)糊精（2-sulfobutyl--cyclodextrin，2-SBE--CD）等。CD及其衍生物均具有一個由親水的外表面和相對疏水的中心空腔構成的圓筒式結構，這種獨特的結構特性使CD能夠通過非共價力（范德華力、靜電相互作用和氫鍵）與多種化合物尤其是疏水性化合物相互作用，將后者包合在空腔中，形成主-客體包合物，從而提高難溶性化合物的溶解度，進而提高在體內(nèi)的吸收及生物利用率?？涨淮笮『腿〈姆N類是影響CD及其衍生物對客體包合能力的重要因素。

本研究通過分子對接和相溶解度結合的方法篩選出適宜包合GLD的CD，并進行固體包合物的制備；考察不同干燥方法、不同投料比對固體包合物的包合率、載藥量和溶解度的影響；采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）法、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法和分子對接技術對固體包合物的形貌、GLD的存在形式、GLD與2-SBE--CD的相互作用和空間構象等結構表征進行分析；并在此基礎上進一步研究GLD/2-SBE--CD固體包合物的體外溶出特性及GLD/2-SBE--CD固體包合物對HepG-2細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLD 泌陽草木青生物科技有限公司；2-SBE--CD、6-HP--CD 湖北恒碩化工有限公司；-CD、-CD、-CD、2,6-M--CD、噻唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、乙腈、石油醚、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 天津市德恩化學試劑有限公司；溴化鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；鋁坩堝上海菁儀化工材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Fetal Bovine Serum生物科技有限公司；胎牛血清 江蘇恩莫阿賽科技有限公司；胰消化酶 合肥Biosharp科技有限公司；HepG-2細胞 ATCC細胞庫。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；pHS-3C pH計、L5S紫外分光光度計上海儀電科學儀器股份有限公司；TENSPOR27 FTIR儀德國Bruker儀器公司；DSC1型DSC儀 瑞士Mettler-Toledo公司；6000Y型噴霧干燥機 上海Bilon儀器有限公司；TM3030 SEM 日本日立高新技術公司；E191IR恒溫培養(yǎng)箱 美國西蒙公司；CKX41SF倒置電子顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；RS-232C酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 CD的篩選

通過分子對接技術和相溶解度法測定不同種類CD與GLD的包合能力及穩(wěn)定性，篩選適宜包合GLD的CD。

1.3.1.1 分子對接法

從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載GLD的3D模型（CID編號為124052），用Gaussian 09軟件中的DFT方法（B3LYP/6-31G）對3D模型進行優(yōu)化。-CD、-CD和-CD的3D模型從劍橋晶體數(shù)據(jù)庫（https://ccdc.cam.ac.uk/）得到，編號分別為1106001、1107194和1529141。用Gauss View 5.0軟件打開去水后的-CD模型，用相應的取代基將葡萄糖單元中對應2,3,6位取代，得到-CD衍生物模型；其中，2,6-M--CD、單-6-氨基--CD、三乙?；?-CD的取代度分別為14、1、21，其他-CD衍生物取代度均為7；用Gaussian 09軟件半經(jīng)驗算法中的PM6基組對-CD衍生物模型的幾何構型進行優(yōu)化。

采用AutoDockTools 4.2軟件處理受體（-CD、-CD、-CD及-CD衍生物（6-HP--CD、2,6-M--CD、2-SBE--CD、6-硫酸鹽--CD、單-6-氨基--CD、6-羧甲基--CD、三乙?；?-CD、6-季銨--CD））與配體（GLD），添加H原子與原子電荷，并設置GLD分子內(nèi)可旋轉單鍵數(shù)量及根原子。將設置好的受體和配體保存為pdbqt格式。在分子對接過程中，均以受體幾何中心為中心，建立尺寸為60 ?×60 ?×60 ?的反應約束盒子。搜索參數(shù)選用拉馬克遺傳算法，算法對接的輪數(shù)設為100，能量評估的最大數(shù)目設為250 000，其他參數(shù)取默認值。對接方法采用半柔性對接。

1.3.1.2 相溶解度法

根據(jù)1.3.1.1節(jié)計算機模擬得到的結果選擇恰當?shù)?CD衍生物用于本實驗。準確稱取適量-CD、-CD、-CD及-CD衍生物，用去離子水配制濃度分別為0、10、20、30、40、50 mmol/L的CD溶液；其中，-CD和-CD溶解度較小，配制其溶液濃度為0、2、4、6、8、10 mmol/L。向上述不同濃度的CD溶液中加入過量的GLD，置于恒溫振蕩器中，25 ℃、200 r/min避光條件下孵育24 h。取出樣品溶液，5 000 r/min離心5 min，取上清液。用80%乙醇溶液（/）適當稀釋，在281 nm波長處測其吸光度，計算GLD的濃度。以CD濃度為橫坐標，GLD濃度為縱坐標，繪制相溶解度圖。

計算包合平衡常數(shù)（）和包合效率（complexation efficiency，CE）：

式（1）、（2）中：為相溶解度圖直線斜率；為直線截距。

計算GLD和CD物質(zhì)的量比（∶）：

計算包合的吉布斯自由能（Δ）：

式（4）中：R為氣體常數(shù)，數(shù)值為8.314 J/（mol·K）；為開氏溫度/K。

1.3.2 GLD/CD固體包合物的干法制備

采用捏合法制備固體包合物。將GLD與篩選出最適宜的CD按物質(zhì)的量比1∶1稱量。用2 倍CD質(zhì)量的去離子水溶解CD，研磨均勻。用無水乙醇溶液溶解GLD，配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液。將GLD乙醇溶液全部滴加到CD溶液中，研磨45 min，60 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，得到固體包合物。

1.3.3 GLD/CD固體包合物的濕法制備

將GLD與篩選出最適宜的CD按的物質(zhì)的量比1∶1稱量。用去離子水溶解CD，配制成0.04 mol/L的CD溶液。用少量無水乙醇溶解GLD，配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液。將GLD乙醇溶液加入到CD溶液中，使體系中乙醇體積分數(shù)為30%，于25 ℃、200 r/min的條件下振蕩24 h。分別將所得溶液用冷凍干燥法、噴霧干燥法和共蒸發(fā)干燥法進行干燥，制備固體包合物。

將GLD與CD按物質(zhì)的量比1∶1.5和1.5∶1稱量，重復上述操作，經(jīng)冷凍干燥后，得到不同投料比的固體包合物。

1.3.3.1 冷凍干燥法

用45 ℃的旋轉蒸發(fā)器除去所得溶液中的乙醇，將溶液置于－20 ℃冰箱中預凍12 h。置于冷凍干燥機中凍干后，過80 目篩。

1.3.3.2 噴霧干燥法

用45 ℃的旋轉蒸發(fā)器除去所得溶液中的乙醇。將溶液置于噴霧干燥器中干燥，采用1 mm的加壓霧化器，進樣速度2.3 mL/min，進風溫度180 ℃，排風溫度110 ℃，霧化氣流速度3.9 m/min。

1.3.3.3 共蒸發(fā)干燥法

將所得溶液置于60 ℃的旋轉蒸發(fā)器中旋轉蒸發(fā)至干。

1.3.4 GLD/CD固體包合物飽和溶解度的測定

分別在1 mL去離子水中加入過量的經(jīng)不同制備方法得到的GLD/CD固體包合物，在室溫條件下超聲溶解至平衡狀態(tài)。0.45 μm濾膜過濾，用80%乙醇溶液逐步稀釋濾液到合適濃度（稀釋10 000 倍）。在281 nm波長處測定吸光度，計算GLD的含量，即為飽和溶解度。

1.3.5 GLD/CD固體包合物包合率和載藥量的測定

分別稱取兩份10 mg經(jīng)不同制備方法得到和不同投料比的GLD/CD固體包合物。一份溶于1 mL去離子水中，加入9 mL乙腈25 ℃超聲處理20 min。5 000 r/min離心5 min后，收集上清液，用乙腈稀釋10 倍。測定其在281 nm波長處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算GLD的質(zhì)量，即為包合物樣品中GLD總質(zhì)量。

另一份加入400 μL石油醚，充分混勻。5 000 r/min離心5 min，去上清液（用來洗去未被包合的GLD），重復洗2 次，置于烘箱中使石油醚揮發(fā)。按上述包合物樣品中GLD總質(zhì)量的測定步驟測定此樣品中的GLD質(zhì)量，即被包合的GLD質(zhì)量。計算包合率和載藥量：

1.3.6 GLD/CD固體包合物及相關樣品的結構表征

1.3.6.1 SEM分析

對GLD、CD、GLD/CD物理混合物（以質(zhì)量比1∶100混合均勻）及經(jīng)不同制備方法得到的GLD/CD固體包合物進行掃描電子顯微鏡測試。用導電雙面膠將樣品固定在樣品臺上，噴鍍鉑金后在3 kW條件下，分別于300、400、1 200 倍觀察樣品的表面形態(tài)。

1.3.6.2 DSC分析

分別稱取GLD、CD、GLD/CD物理混合物及經(jīng)不同制備方法得到的GLD/CD固體包合物各5 mg，溫度掃描范圍25～300 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮氣流量10 mL/min，以空盤作為參比，記錄各樣品的DSC圖線。

1.3.6.3 FTIR分析

分別稱取適量的GLD、CD、經(jīng)不同制備方法得到的GLD/CD固體包合物和GLD/CD物理混合物，分別與溴化鉀粉末混合，放入研缽內(nèi)充分研磨，再采用壓片法制得樣品薄片。將樣品薄片放入儀器內(nèi)進行光譜掃描，掃描范圍4 000～400 cm，分辨率4 cm，掃描次數(shù)32 次。以純溴化鉀粉末作背景進行單通道掃描。

1.3.6.4 分子對接法

采用1.3.1.1節(jié)的步驟，運用AutoDockTools 4.2軟件對GLD與篩選出最適宜的CD包合模式進行模擬得到主客體間的構象及氫鍵相互作用。

1.3.7 GLD/CD固體包合物在模擬胃腸液中累積溶出率測定

按照Maltais等所述方法配制不含消化酶的模擬胃、腸液。準確稱取2.0 g NaCl置于燒杯中，加入100 mL去離子水，用12.0 mol/L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.2，即為模擬胃液。準確稱取6.8 g KHPO，溶于250 mL去離子水中，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9，即為模擬腸液。分別量取900 mL模擬胃液和腸液作為溶出介質(zhì)，放入1 000 mL燒杯中，置于水浴加熱磁力攪拌器，溫度保持在（37±0.5) ℃，轉速50 r/min。分別準確稱取一定質(zhì)量的GLD、GLD/CD物理混合物及經(jīng)不同制備方法得到的GLD/CD固體包合物樣品（樣品中GLD質(zhì)量均為100 mg），放入燒杯中，并立即開始計時。于2、4、6、8、10、15、20、30、45、60 min時吸取溶出液1 mL，同時補充等體積新鮮的溶出介質(zhì)。用0.45 μm微孔濾膜過濾溶出液，取濾液0.5 mL，加入4.5 mL乙腈，充分混勻。5 000 r/min離心5 min后，取上清液。在281 nm波長處測定吸光度，計算累積溶出率：

式（7）中：為某一時間點每1 mL溶出液中溶出的GLD質(zhì)量/μg；為之前所有時間點取出的1 mL溶出液中GLD質(zhì)量/μg。

繪制溶出曲線，按下式計算差異因子（）和相似因子（），進行相同條件下各溶出曲線間的差異顯著性分析。

式（8）、（9）中：為取出點的數(shù)量；R為參考曲線在時間點的溶解率；T為比較曲線在時間點的溶出率。

當＝0、＝100，表明測試曲線和參考曲線完全相似；當值在0～15內(nèi)且值在50～100內(nèi)，表明兩條曲線相似；當＞15且＜50時，表明兩條曲線差異顯著；其余情況無法判定曲線間的差異顯著性。

1.3.8 GLD/CD固體包合物對HepG-2細胞增殖的抑制率測定

1.3.8.1 樣品制備

樣品組中GLD、CD和GLD/CD的系列濃度均為30、60、90、120、150、200 μmol/L。將GLD溶于DMSO中，配制50 mmol/L母液，用DMEM培養(yǎng)基稀釋得到不同濃度的GLD樣品，記為GLD/DMSO組。將GLD溶于DMEM培養(yǎng)基中得到不同濃度的GLD樣品，記為GLD/HO組。將篩選出最適宜的CD溶于DMEM培養(yǎng)基中得到不同濃度的CD樣品，記為CD組。將經(jīng)冷凍干燥得到的GLD/CD固體包合物復溶于DMEM培養(yǎng)基中得到不同濃度的GLD/CD樣品，記為GLD/CD組。

1.3.8.2 MTT法測定HepG-2細胞增殖的抑制率

將含體積分數(shù)10%的胎牛血清、100 U/mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、含5% CO氣體的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)HepG-2細胞至80%的細胞鋪滿瓶底。用胰酶消化2 min后，以1×10個/mL的濃度接種至96 孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)16 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入200 μL新鮮培養(yǎng)基或樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液清洗兩次，每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒掉培養(yǎng)基中液體，吸掉泡沫，加150 μL DMSO反應10 min。用酶標儀測定550 nm波長處樣品孔的吸光度。加MTT的樣品孔記為，加等體積培養(yǎng)基的孔記為，不加MTT的孔為記，每個樣品做6 個復孔，按式（10）計算細胞抑制率，并根據(jù)濃度-細胞抑制率曲線求得半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除說明外，其他所有實驗重復3 次，采用DPS軟件進行差異顯著性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 CD與GLD的包合能力及包合物的穩(wěn)定性分析

2.1.1 分子對接法篩選CD的結果分析

不同種類CD與GLD對接的最佳結合能見表1。-CD和-CD最佳結合能低于-CD，說明與-CD相比，-CD、-CD與GLD可形成更加穩(wěn)定的包合物。在-CD的衍生物中，三乙?；?-CD和6-季銨--CD這兩種-CD衍生物經(jīng)取代后與GLD的最佳結合能均高于-CD；2-SBE--CD、6-HP--CD、2,6-M--CD、6-硫酸鹽--CD、單-6-氨基--CD和6-羧甲基--CD經(jīng)取代后與GLD的最佳結合能均低于-CD。其中，2-SBE--CD與GLD對接的結合能明顯低于其他種類CD，為－8.60 kcal/mol。這些結果說明，CD空腔大小和取代基的種類是影響CD及其衍生物對客體包合能力的重要因素，2-SBE--CD與GLD包合的穩(wěn)定性最好。

表1 不同種類CD與GLD的最佳結合能Table 1 Optimal binding energy between different CDs and GLD

2.1.2 相溶解度法篩選CD的結果分析

選取-CD、-CD、-CD及3 種結合能較小的-CD衍生物（6-HP--CD、2,6-M--CD和2-SBE--CD），采用相溶解度法進一步研究其與GLD的包合作用。其中，-CD未能與GLD形成包合物，其他5 種CD與GLD包合的相溶解度曲線如圖1所示。所有曲線線性回歸方程的相關系數(shù)（）均大于0.98（表2），即相溶解度曲線為A型，表明CD與GLD以1∶1物質(zhì)的量比進行包合。值與包合物穩(wěn)定性有關，值越大，表明GLD與CD形成的包合物穩(wěn)定性越好。由表2可知，-CD以及3 種-CD衍生物的均大于-CD，表明其與GLD的包合穩(wěn)定性均優(yōu)于-CD；其中，2-SBE--CD與GLD包合的最大，與GLD形成的包合物最穩(wěn)定。GLD與不同CD包合過程中的Δ均為負值，表明包合過程在25 ℃時均可自發(fā)進行；-CD以及3 種-CD衍生物的Δ均低于-CD，2-SBE--CD與GLD包合的Δ低于其他CD，與上述分子對接的結合能結果吻合。

圖1 不同種類CD與GLD的相溶解度曲線Fig. 1 Phase solubility of different CDs and GLD

表2 CD和GLD包合的擬合方程、K1∶1、CE及熱力學相關參數(shù)Table 2 Fitting equations, K1:1, CE and thermodynamic parameters for inclusion complexation between CD and GLD

對于難溶性藥物或生物活性成分（水溶性＜0.1 mmol/L），其固有溶解度通常遠小于相溶解度曲線的，導致值計算誤差較大。CE值越大，∶值越大，表明主體分子對客體分子的包合能力更強，增溶能力越好；CE和∶值的大小與客體分子的固有溶解度（或）無關，因此可以更準確地反映包合效果。從表2可知，與-CD相比，3 種-CD衍生物的CE和∶均增大，表明-CD衍生物與GLD的包合能力均優(yōu)于-CD；其中，2-SBE--CD與GLD包合的CE和∶值最高，說明其包合能力最強。

上述結果可以看出，通過分子對接模擬技術發(fā)現(xiàn)2-SBE--CD與GLD對接的結合能最低、最穩(wěn)定；相溶解度實驗證明2-SBE--CD對GLD的包合效果最好；因此，選取2-SBE--CD進行后續(xù)實驗。

2.2 GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的包合率、載藥量及飽和溶解度分析

2.2.1 制備方法對GLD/2-SBE--CD固體包合物的影響

圖2 冷凍干燥法（a）、捏合法（b）、噴霧干燥法（c）及共蒸發(fā)法（d）制得的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物Fig. 2 Pictures of GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complexes prepared by freeze drying (a), kneading (b), spray drying (c) and co-evaporation (d)

GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比為1∶1時，經(jīng)干法制備和3 種濕法制備方法得到的GLD/2-SBE--CD固體包合物如圖2所示。由表3可知，4 種制備方法所得包合物的包合率和載藥量差異不顯著，包合率為93.33%～97.68%，載藥量為11.19%～11.89%；不同干燥法制備的包合物能夠明顯提高GLD的飽和溶解度（未經(jīng)包合的GLD飽和溶解度為7 μg/mL），這是因為CD具有一個親水的表面結構，其空腔內(nèi)壁由碳鏈骨架構成，表現(xiàn)出疏水性，因此可以和難溶性化合物通過范德華力或氫鍵作用形成包合物，從而提高難溶性化合物的溶解度。除了共蒸發(fā)法制得的包合物的飽和溶解度顯著低于噴霧干燥法外，其他3 種制備方法（冷凍干燥法、噴霧干燥法和捏合法）制得的包合物的飽和溶解度差異不顯著，均大于83 mg/mL。

表3 不同干燥方法制得的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的包合率和載藥量Table 3 Inclusion rates and drug-loading rates of GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complexes prepared by different drying methods

2.2.2 投料比對GLD/2-SBE--CD固體包合物的影響

由表4可知，伴隨GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比增大，包合率下降、載藥量提高。GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比為1.5∶1時，包合率為86.09%，載藥量為22.39%，與GLD和2-SBE--CD物質(zhì)的量比為1∶1、1∶1.5相比，包合率分別下降了7.75%、8.58%，載藥量則分別提高了88.31%、141.14%。

表4 不同投料比制得的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的包合率和載藥量Table 4 Inclusion rates and drug-loading rates of GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complexes prepared with different GLD/2-SBE-β-CD ratios

上述研究結果表明：不同制備方法對GLD/2-SBE--CD固體包合物的包合率和載藥量均無顯著影響，但對包合物的水溶性有一定影響。適當提高GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比，包合率雖有一定程度下降，但可顯著提高載藥量。

2.3 GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的表征

2.3.1 SEM結果分析

如圖3所示，2-SBE--CD為大小不一、表面光滑并有凹陷的球狀結構，與文獻報道相符；GLD呈柱狀晶體結構，輪廓清晰；GLD/2-SBE--CD物理混合物中可同時觀察到球狀2-SBE--CD和柱狀的GLD，表明是兩者的簡單混合。GLD/2-SBE--CD包合物的形貌特征明顯不同于物理混合物，表明主客體分子之間發(fā)生了相互作用；且制備方法不同，包合物的外部形貌有較大差異：冷凍干燥法制備的包合物呈邊緣鋒利的片狀結構；捏合法和共蒸發(fā)法制備的包合物為不規(guī)則的塊狀結構；噴霧干燥法制備的包合物為表面光滑、粒徑很小的球形顆粒（小于10 μm），顆粒尺寸顯著小于冷凍干燥法、捏合法和共蒸發(fā)法制得的包合物。

圖3 2-SBE-β-CD（a）、GLD（b）、GLD/2-SBE-β-CD物理混合物（c）及不同制備方法得到的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物（d～g）的SEM圖Fig. 3 SEM images of 2-SBE-β-CD (a), GLD (b), GLD/2-SBE-β-CD physical mixture (c) and GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complexes (d–g)obtained by different drying methods

2.3.2 DSC結果分析

如圖4所示，GLD在233 ℃處有尖銳的熔融峰，此溫度是該晶體的熔點。2-SBE--CD有兩個峰，在40～160 ℃內(nèi)出現(xiàn)一矮而寬的吸熱峰，為水由其空腔內(nèi)釋放的吸熱峰；在270 ℃有一個吸熱峰，此峰代表2-SBE--CD分解，這與文獻報道的結果一致。GLD/2-SBE--CD物理混合物在233 ℃和270 ℃處均有吸熱峰，體現(xiàn)為GLD與2-SBE--CD吸熱峰的簡單疊加，表明GLD在物理混合物中仍表現(xiàn)出晶體特征。通過冷凍干燥法、噴霧干燥法、捏合法和共蒸發(fā)法制得的GLD/2-SBE-CD固體包合物DSC圖無明顯差別（圖中d曲線是經(jīng)冷凍干燥法制備并測定所得，其余略）。與2-SBE--CD相比，GLD/2-SBE-CD固體包合物的第1個峰的峰強度降低且發(fā)生了偏移，表明將GLD插入空腔中會使水分子發(fā)生遷移，偏移的發(fā)生推測是GLD與2-SBE--CD之間形成了相互作用的氫鍵；第2個峰位偏移至276 ℃，對應于GLD/2-SBE-CD固體包合物中2-SBE--CD的分解；包合物的DSC曲線中無GLD的熔融峰，表明由于GLD/2-SBE-CD固體包合物的形成，晶態(tài)的GLD轉變?yōu)榉蔷B(tài)。上述結果均說明了2-SBE--CD已將GLD包合在空腔內(nèi)形成了固體包合物。

圖4 GLD、2-SBE-β-CD、GLD/2-SBE-β-CD物理混合物和經(jīng)冷凍干燥法得到的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的DSC分析圖Fig. 4 DSC analysis of GLD, 2-SBE-β-CD, GLD/2-SBE-β-CD physical mixture and GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complex obtained by freeze-drying method

2.3.3 FTIR結果分析

如圖5所示，在GLD的光譜中，3 346 cm波數(shù)處出現(xiàn)一強而寬的峰，為O—H的伸縮振動；1 518、1 464 cm波數(shù)處為芳香環(huán)C＝C的伸縮振動；2 964、2 920 cm波數(shù)處為—CH的吸收峰。在2-SBE--CD的光譜中，3 430 cm波數(shù)前后表現(xiàn)出與O—H伸縮振動相關的特征波段；2 935 cm波數(shù)處為C—H的伸縮振動；1 653 cm波數(shù)處為水分子的彎曲振動；1 163、1 039 cm波數(shù)處為C—O的伸縮振動。在GLD/2-SBE--CD物理混合物的光譜中，GLD和2-SBE--CD的特征吸收峰依舊存在，表明物理混合物只是主客分子的簡單疊加，GLD和2-SBE--CD之間沒有相互作用或僅有微弱的相互作用。不同方法制備的GLD/2-SBE--CD固體包合物的FTIR圖無明顯差別（圖中d曲線是經(jīng)冷凍干燥法制備并測定所得，其余略）。在GLD/2-SBE--CD固體包合物中，GLD芳香環(huán)對應的特征吸收峰消失；2-SBE--CD中3 430 cm波數(shù)處O—H的吸收峰在包合物中移至3 407 cm波數(shù)處，且吸收帶強度增加，這可能是由于GLD和2-SBE--CD之間發(fā)生了相互作用導致羥基數(shù)量增加；2-SBE-CD中1 653 cm波數(shù)處水分子的特征彎曲振動吸收峰在包合物中移至1 645 cm波數(shù)處。基于GLD/2-SBE--CD固體包合物FTIR圖的變化，說明GLD進入了2-SBE--CD的空腔。GLD/2-SBE--CD固體包合物光譜中未出現(xiàn)新的吸收峰，表明包合物中無新的化學鍵產(chǎn)生，主客分子間只是分子間力或氫鍵的相互作用。

圖5 GLD、2-SBE-β-CD、GLD/2-SBE-β-CD物理混合物和經(jīng)冷凍干燥法得到的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物的FTIR分析圖Fig. 5 FTIR analysis of GLD, 2-SBE-β-CD, GLD/2-SBE-β-CD physical mixture and GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complex obtained by freeze-drying method

2.3.4 GLD與2-SBE--CD分子對接結果分析

如圖6所示，GLD分子能夠完整地進入2-SBE--CD的空腔內(nèi)。GLD與2-SBE--CD分子間形成兩個氫鍵：2-SBE--CD某兩個相鄰葡萄糖單元中C2位磺酸基的氧分別與GLD分子B環(huán)上C2位和C3位O—H的氫之間形成氫鍵；氫鍵距離分別為2.1、2.3 ?。表明氫鍵是GLD與2-SBE--CD相互作用的主要作用力之一。

圖6 GLD與2-SBE-β-CD對接的最佳能量構象及相互作用圖Fig. 6 Lowest energy conformation and interaction diagrams for GLD docking with 2-SBE-β-CD

2.4 GLD/2-SBE-β-CD固體包合物在模擬胃腸液中累積溶出率分析

難溶性的藥物或生物活性成分的累積溶出率低，是導致其在體內(nèi)的吸收能力低、生物利用率差的一個重要原因。因此，累積溶出率可以在一定程度上預測難溶性化合物體內(nèi)的吸收速度和程度。不同制備方法得到的GLD/2-SBE--CD固體包合物的累積溶出率無顯著差異，圖7中曲線是經(jīng)噴霧干燥法制備并測定所得，其余略。由圖7可知，在pH 1.2的模擬胃液和pH 6.9的模擬腸液中，GLD及GLD/2-SBE--CD物理混合物在1 h的累積溶出率均小于10%；與之相比，GLD/2-SBE--CD包合物在模擬胃液和腸液中的累積溶出率均極顯著提高，1 h的累積溶出率分別達到87%和83%。結果表明GLD/2-SBE--CD固體包合物能有效提高GLD的溶出，這是由于GLD與CD間的氫鍵相互作用以及GLD在包合物中的結晶度減少引起。這預示包合物具有提高GLD吸收的潛在能力。

圖7 經(jīng)噴霧干燥法制備的GLD/2-SBE-β-CD固體包合物在模擬胃液（a）、腸液（b）中的累積溶出率Fig. 7 Cumulative dissolution rates of GLD/2-SBE-β-CD solid inclusion complex prepared by spray drying method in simulated gastric juice (a) and intestinal juice (b)

2.5 GLD/2-SBE-β-CD固體包合物對HepG-2細胞增殖的抑制作用

GLD具有抑制人乳腺癌細胞系（MCF-7、MDAMB-231和T-44D）、胚胎腎細胞HEK-293、血癌細胞K562、宮頸癌Hela、肝癌HepG-2、肝癌WRL-68、口腔癌SCC-9和肺癌細胞A546等多種癌細胞增殖的作用。本實驗比較了GLD/HO組、GLD/DMSO組、2-SBE--CD組和經(jīng)冷凍干燥法制得的GLD/2-SBE--CD組對HepG-2細胞增殖的抑制作用，結果如圖8所示。GLD/DMSO組對HepG-2細胞增殖表現(xiàn)出很強的抑制作用，其IC為37.68 μmol/L。GLD/HO組對HepG-2細胞增殖的抑制作用較弱，其IC為162.29 μmol/L。2-SBE--CD組對HepG-2細胞增殖的抑制率均小于2%，表明2-SBE--CD幾乎是無毒的。GLD/2-SBE--CD組對HepG-2細胞增殖抑制作用的IC值為74.69 μmol/L，顯著優(yōu)于GLD/HO組。

GLD在水中的溶解度低，導致GLD/HO處理對HepG-2細胞增殖的抑制作用低。DMSO起到增加GLD溶解性的作用，可以提供更多的游離GLD分子與HepG-2細胞接觸，因此GLD/DMSO處理提高了對HepG-2細胞增殖的抑制作用。但因溶劑中含有DMSO，所以不能完全反映出游離GLD在水體系中的細胞抑制效果。GLD/2-SBE--CD固體包合物對HepG-2細胞增殖活性的抑制作用顯著優(yōu)于GLD/HO處理，可能的原因有：GLD/2-SBE--CD固體包合物的水溶性好，使更多溶解的GLD分子作用于細胞；GLD/2-SBE-CD固體包合物使GLD通過細胞膜的運輸增加，從而提高了對細胞增殖的抑制活性。

圖8 GLD/H2O組、GLD/DMSO組、2-SBE-β-CD組和經(jīng)冷凍干燥法制得的GLD/2-SBE-β-CD組對HepG-2細胞增殖的抑制Fig. 8 Inhibitory effects of GLD/ H2O, GLD/DMSO, 2-SBE-β-CD and GLD/2-SBE-β-CD prepared by freeze-drying method on the proliferation of HepG-2 cells

3 結 論

除-CD外，-CD、-CD、6-HP--CD、2,6-M--CD和2-SBE--CD均可以不同程度地提高GLD的溶解度，與GLD包合的相溶解度曲線均為A型，表明與GLD形成物質(zhì)的量比1∶1的包合物。其中2-SBE--CD包合GLD的能力優(yōu)于其他CD及其衍生物；不同制備方法制備的GLD/2-SBE--CD固體包合物的包合率和載藥量均無顯著差異，但包合物的飽和溶解度有一定差異。適當提高GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比，包合率雖有一定程度下降，但可顯著提高載藥量。GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比為1.5∶1時，冷凍干燥法制備的GLD/2-SBE--CD固體包合物的包合率和載藥量分別為86.09%和22.39%。GLD與2-SBE--CD物質(zhì)的量比為1∶1時，冷凍干燥法、噴霧干燥法和捏合法制得的包合物的飽和溶解度均大于83 mg/mL。不同制備方法得到的GLD/2-SBE--CD包合物形貌差異明顯，GLD在GLD/2-SBE--CD包合物中均以無定形非晶體結構存在。GLD/2-SBE--CD包合物能有效提高GLD在模擬胃、腸液中的溶出；制備方法對GLD/2-SBE--CD包合物的溶出特性無顯著影響；同時，GLD/2-SBE--CD包合物還有效保證GLD的抗腫瘤增殖活性。因此，GLD/2-SBE--CD包合物是GLD的一種有前途的給藥形式，值得深入開展藥代動力學以及跨膜轉運機制的相關研究，從而更好地擴大GLD的應用潛力。