張雪莉,胡秋輝,,*,紀(jì) 陽,俞安淇,仲 磊,趙立艷,范育明
(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.灌南縣園藝技術(shù)指導(dǎo)站,江蘇 連云港 222500)
硒是維持機(jī)體健康必需的微量元素,攝入適量的硒有利于保護(hù)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、甲狀腺功能、生育功能及抗氧化功能等。機(jī)體自身無法合成硒元素,只能從外界攝入,但人類日常飲食中硒含量較低,難以滿足普通人群尤其是缺硒地區(qū)人群的補(bǔ)硒需求。目前大多通過葉面噴硒、根部灌硒等方式使農(nóng)作物富集硒以提高食物中的硒含量及生物可利用性。作物中的大部分硒以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys)及硒代同型半胱氨酸等形態(tài)與蛋白質(zhì)結(jié)合,使得富硒蛋白成為硒在作物中的主要存在形式。研究發(fā)現(xiàn),硒與蛋白結(jié)合不僅提高了蛋白質(zhì)中的硒含量,還會(huì)影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)、結(jié)構(gòu)和功能活性,如與花生普通蛋白相比,花生富硒蛋白的氨基酸含量增加,二級結(jié)構(gòu)顯著變化;與秀珍菇普通蛋白相比,秀珍菇富硒蛋白的表面疏水性增加,-折疊含量降低而無規(guī)卷曲含量增加;與糙米普通蛋白相比,富硒蛋白-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加,-螺旋和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低,體外抗氧化性顯著增強(qiáng)。
鉛作為一種有害重金屬元素,通過食物及飲用水、空氣及皮膚接觸等途徑在人體內(nèi)富集,主要分布在大腦、腎臟、肝臟及骨骼等器官中。膳食鉛暴露可能會(huì)破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼造血系統(tǒng),引起貧血、高血壓、腎臟損傷等疾病。傳統(tǒng)的治療鉛中毒的方法為螯合治療法,但螯合劑的使用存在一定副作用,例如長期服用依地酸二鈉鈣會(huì)導(dǎo)致疲勞、惡心、加重腎負(fù)擔(dān)且會(huì)引起人體鐵、鋅等微量元素的流失。已有研究表明,硒不僅能夠影響鉛的吸收,還能對鉛誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥損傷和免疫系統(tǒng)紊亂產(chǎn)生顯著拮抗作用。Wu Jian等研究表明大米富硒蛋白水解物可抑制核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路以減輕Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Fang Yong等研究發(fā)現(xiàn)富硒大米蛋白水解物可能通過抑制Caspase蛋白家族的激活減輕Pb對PC12細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的毒性。以上研究均表明食源性硒蛋白具有潛在的緩解Pb細(xì)胞毒性的作用。
杏鮑菇是我國工廠化大規(guī)模種植的一種食用菌,富含蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)成分,其栽培不受土壤因素限制,培養(yǎng)周期短,并且杏鮑菇對微量元素有較好的吸收能力,因此相較于大米、小麥等谷物,杏鮑菇是一種理想的硒生物強(qiáng)化載體。目前對杏鮑菇富硒蛋白(selenium-enriched proteinfrom,SePEP)的營養(yǎng)、結(jié)構(gòu)特性及其鉛毒性緩解作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以SePEP為原料,分析蛋白中硒含量、形態(tài)和氨基酸,并測定蛋白的結(jié)構(gòu)以評估硒積累對杏鮑菇蛋白營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)特性的影響。此外,通過體外模擬消化SePEP和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究SePEP對Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的影響,旨在為SePEP緩解鉛毒性作用機(jī)理研究及SePEP功能食品開發(fā)提供理論參考。
富硒杏鮑菇和普通杏鮑菇均種植于江蘇麗莎菌業(yè)股份有限公司,富硒杏鮑菇栽培過程中以富硒酵母作為硒源(培養(yǎng)基中硒含量:40 mg/kg)。將富硒杏鮑菇冷凍干燥后磨粉過80 目篩備用;小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購于復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心。
SeMet、SeCys、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、亞硒酸鈉、硒酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶XIV美國Sigma公司;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶 美國Gibco公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenas,LDH)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 南京建成生物工程生物研究所;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT) 北京索萊寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)儀、1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 美國安捷倫科技有限公司;Mars6微波消解儀 美國CEM公司;IR200傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國賽默飛公司。
1.3.1 SePEP和普通杏鮑菇蛋白的制備
參照席甜和袁彪的方法提取純化SePEP。稱取0.04 g堿提酸沉所得粗蛋白溶于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中,蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,過0.45 μm濾膜。將濾液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow凝膠層析柱。用0.1~0.7 mol/L NaCl緩沖液洗脫,收集各組分并測定硒含量。以硒含量最高的組分記為SePEP。普通杏鮑菇蛋白(protein from,PEP)的提取方法同上。
1.3.2 硒含量的測定
硒含量的測定參考GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》,并作適當(dāng)修改。精確稱取0.2 g待測樣品于消解管中,添加5 mL HNO(純度65%~68%)預(yù)消解12 h,再加入1 mL HO微波消解,冷卻后定容至50 mL,通過ICP-MS分析硒含量。ICP-MS射頻功率:1 550 W;等離子體氣流量:15.0 L/min;載氣流量:1.0 L/min;輔助氣流量:1.0 L/min;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速:0.1 r/min;霧化室溫度:2 ℃;霧化室氣流量:0.1 L/min。
1.3.3 硒形態(tài)的測定
根據(jù)薛梅等的方法通過HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測定硒形態(tài)。稱取0.25 g蛋白質(zhì)于離心管中,加入10 mL質(zhì)量濃度8 mg/mL蛋白酶XIV溶液。將離心管置于37 ℃及150 r/min條件下振蕩12 h,于5 000 r/min下離心10 min,取上清過0.22 μm濾膜上機(jī)分析。硒形態(tài)和含量分別根據(jù)各硒標(biāo)準(zhǔn)物鑒定和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。HPLC的工作參數(shù)如下:Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動(dòng)相A相為5 mmol/L pH 4.7檸檬酸溶液,流動(dòng)相B相為15 mmol/L pH 4.7檸檬酸溶液;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量50 μL。洗脫條件:0~6 min,100% A;6~10 min,50% A;10~23 min,0% A;23 min,100% A。
將亞硒酸鈉、硒酸鈉、SeMet、SeCys、MeSeCys 5 種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品混合,配制成質(zhì)量濃度梯度為0、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,按上述方法得到HPLC圖(圖1)。四價(jià)硒(Se)、六價(jià)硒(Se)、SeMet、SeCys、MeSeCys的回歸方程分別為=445.35-147.17,=0.996 2;=624.75-418.45,=0.999 2;=477.02-12.776,=0.999 5;=1 148.6-625.35,=0.999 9;=434.12-87.076,=0.999 2。
圖1 質(zhì)量濃度100 μg/L硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of 100 μg/L mixed selenium standard
1.3.4 SePEP氨基酸的測定
參考張夢甜等的方法作適當(dāng)修改測定蛋白質(zhì)中的氨基酸。稱取0.02 g蛋白質(zhì)于水解管中,添加20 mL 6 mol/L鹽酸溶液,密封,于110 ℃烘箱中加熱水解22 h,冷卻后氮吹樣品以去除濃鹽酸。復(fù)溶于0.02 mol/L鹽酸溶液并定容至50 mL,過0.22 μm濾膜,經(jīng)全自動(dòng)氨基酸分析儀測定。
1.3.5 SePEP二級結(jié)構(gòu)相對含量的測定
蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量通過傅里葉變換紅外光譜儀測定。將富硒杏鮑菇蛋白與溴化鉀以質(zhì)量比1∶100研磨并壓片,進(jìn)行紅外光譜分析。分析參數(shù)中波數(shù)范圍設(shè)為4 000~500 cm,分辨率設(shè)為4 cm,掃描60 次。二級結(jié)構(gòu)通過Peak Fit軟件對掃描圖譜中1 700~1 600 cm酰胺I帶進(jìn)行分析。其中1 600~1 640 cm為-折疊,1 641~1 650 cm為無規(guī)卷曲,1 651~1 660 cm為-螺旋,1 661~1 690 cm為-轉(zhuǎn)角。
1.3.6 SePEP巰基與二硫鍵含量的測定
參照羅明江等的方法,通過Ellman’s試劑測定蛋白巰基與二硫鍵的含量??値€基和游離巰基含量計(jì)算如式(1)所示,二硫鍵含量計(jì)算如式(2)所示。
式中:為溶液在412 nm波長處吸光度;為稀釋倍數(shù);為樣品質(zhì)量濃度/(mg/mL)。
1.3.7 SePEP表面疏水性的測定
參考Chelh等的方法,稱取適量蛋白溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)(pH 7.0)中,使蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取1 mL蛋白溶液并添加200 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液,以添加200 μL含溴酚藍(lán)的PBS為對照。靜置30 min,于6 000 ×離心15 min,于595 nm波長下測定吸光度。溴酚藍(lán)結(jié)合量計(jì)算如式(3)所示。以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征蛋白的表面疏水性。
式中:為含溴酚藍(lán)的PBS吸光度;為樣品上清液的吸光度;為添加的溴酚藍(lán)質(zhì)量(200 μg)。
1.3.8 體外模擬消化SePEP
參考Brodkorb等的方法并作適當(dāng)修改對蛋白進(jìn)行體外模擬消化。稱取2.0 g蛋白樣品加入10 mL蒸餾水,再加入10 mL模擬唾液,搖勻,用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至1.8。以1∶1(/)比例加入模擬胃液(2 000 U/mL胃蛋白酶消化液),于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩4 h,調(diào)pH值至6.8。以1∶1(/)比例加入模擬腸液(100 U/mL胰蛋白酶最終混合物),繼續(xù)于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩4 h。消化完全后取出樣品,并于沸水中煮沸5~10 min滅酶。
1.3.9 SePEP消化產(chǎn)物對Pb損傷RAW264.7細(xì)胞存活率的影響
參考Wu Jian等的方法培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞。采用MTT法測定RAW264.7細(xì)胞暴露于不同濃度Pb溶液12 h后細(xì)胞存活率的變化,以篩選Pb作用濃度。將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96 孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)量為2×10個(gè)。細(xì)胞鋪滿底部80%后,棄去培養(yǎng)液,用0.01 mol/L PBS清洗3 次。向細(xì)胞中加入100 μL不同濃度Pb溶液(0、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L)孵育12 h,吸棄處理液。加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL MTT溶液于培養(yǎng)箱孵育4 h。吸棄MTT溶液,再向每孔加入100 μL DMSO,37 ℃下振蕩10 min,于波長570 nm下測定吸光度,細(xì)胞存活率以對照組(0 μmol/L Pb溶液)為100%計(jì)算,空白組加入0.01 mol/L PBS。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如式(4)所示。
測定不同質(zhì)量濃度(0、1、5、10、25、50、75、100 μg/mL)蛋白消化產(chǎn)物及Pb與蛋白消化產(chǎn)物共處理12 h對RAW264.7細(xì)胞活力的影響,方法如上所述。待96 孔板底部鋪滿細(xì)胞后,加入蛋白消化產(chǎn)物和Pb混合溶液,12 h后測定細(xì)胞存活率。
1.3.10 LDH釋放量及細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的測定
根據(jù)檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力及IL-6、IL-8、TNF-α的質(zhì)量濃度。
研究中所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行,使用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)兩組之間的差異顯著性(<0.05)。
經(jīng)ICP-MS測定,富硒杏鮑菇中硒含量為(90.01±7.01)mg/kg,SePEP中硒含量為(360.64±3.11)mg/kg,PEP中未檢測到硒。經(jīng)蛋白酶XIV酶解提取后,提取液中硒質(zhì)量濃度為(282.82±13.13)mg/L,經(jīng)酶解后,蛋白質(zhì)中78.42%的硒被提取至提取液中。通過HPLC-ICP-MS測定SePEP的硒形態(tài),由圖2A可知,SePEP中主要包括SeCys、MeSeCys和SeMet。通過對3 種硒化合物含量及其中硒含量計(jì)算可得,SePEP中SeCys、MeSeCys、SeMet含量分別為(413.28±6.66)、(103.39±2.54)mg/kg和(356.87±4.75)mg/kg,3 種硒化合物中的硒含量分別為(90.24±1.46)、(41.42±1.02)mg/kg和(135.87±1.81)mg/kg(圖2B)。由以上數(shù)據(jù)計(jì)算可知,各形態(tài)硒在SePEP中的相對含量為SeCys(31.91±0.51)%、MeSeCys(14.65±0.36)%和SeMet(48.04±0.64)%(圖2C)。富硒蛋白中的硒形態(tài)大部分為有機(jī)硒,如大豆富硒蛋白主要硒形態(tài)為SeMet;茶葉富硒蛋白和魔芋富硒蛋白主要硒形態(tài)為SeMet和SeCys。其中,SeMet與SeCys的形成是由于蛋氨酸合成酶及半胱氨酸合成酶無法識(shí)別Se和S原子,Se非特異性取代了蛋白質(zhì)中的S原子。SeCys是SeCys不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化形成的代謝物。MeSeCys是由SeCys與-腺苷蛋氨酸反應(yīng)并通過硒甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化而成。根據(jù)Battin等的研究,SeMet、SeCys及MeSeCys可以與銅和鐵元素結(jié)合緩解銅、鐵濃度異常升高引起的大腸桿菌質(zhì)粒DNA氧化損傷。
圖2 SePEP中硒形態(tài)的HPLC色譜圖(A)、各形態(tài)硒含量(B)及含量比例(C)Fig. 2 HPLC chromatogram of selenium species (A) and content (B)and proportion (C) of each selenium species in SePEP
氨基酸種類與含量是評價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。SePEP及PEP的氨基酸組成與含量見表1,兩種蛋白中均檢測到17 種氨基酸,且SePEP中大部分氨基酸含量顯著高于PEP(<0.05)。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization,F(xiàn)AO)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)提出的理想模式,必需氨基酸(essential amino acids,EAA)/總氨基酸(total amino acids,TAA)比值為0.4左右,EAA/非必需氨基酸(non-essential amino acids,NEAA)比值大于0.6,則該種蛋白質(zhì)品質(zhì)較好。因此,SePEP與PEP均具有合理的氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn),適量的硒積累可提高植物蛋白質(zhì)中氨基酸含量,提高蛋白營養(yǎng)價(jià)值,這是因?yàn)榘被崾亲魑锏x的產(chǎn)物,作物富集硒的過程中影響了硫代謝,同時(shí)影響了與硫代謝在乙酰絲氨酸水平上相互作用的氮代謝。
表1 SePEP與PEP的氨基酸組成與含量Table 1 Amino acid composition of SePEP and PEP
蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲4 種類型。由圖3可知,SePEP二級結(jié)構(gòu)由(25.00±1.60)%(相對含量,下同)-螺旋、(37.48±1.37)%-折疊、(23.67±1.41)%-轉(zhuǎn)角和(13.85±1.66)%無規(guī)卷曲組成;PEP二級結(jié)構(gòu)則由(20.30±0.87)%-螺旋、(35.88±0.73)%-折疊、(24.92±0.92)%-轉(zhuǎn)角及(20.38±0.84)%無規(guī)卷曲組成。相較于PEP,SePEP中-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量顯著增多(<0.05),無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量顯著減少(<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),硒的添加會(huì)導(dǎo)致糙米蛋白中-折疊與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量增多,-轉(zhuǎn)角與-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量減少;隨外源硒濃度增加,秀珍菇富硒蛋白的-螺旋與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量先增多后減少。
圖3 SePEP與PEP的紅外光譜圖(A)與二級結(jié)構(gòu)組成(B)Fig. 3 Infrared spectra (A) and secondary structure composition (B) of SePEP and PEP
巰基與二硫鍵含量可以反映蛋白質(zhì)分子間結(jié)合的強(qiáng)弱,在維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上起重要作用。根據(jù)表2可知,SePEP總巰基及二硫鍵含量顯著高于PEP(<0.05),游離巰基含量無顯著差異(>0.05)。硒的生物強(qiáng)化導(dǎo)致PEP總巰基與二硫鍵含量增加,與花生富硒蛋白測定結(jié)果一致。蛋白質(zhì)分子的表面疏水性反映了三級結(jié)構(gòu)的展開程度、表面疏水基團(tuán)數(shù)量及分子間相互作用的強(qiáng)弱。以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征蛋白的表面疏水性,溴酚藍(lán)結(jié)合量越高則說明表面疏水性越高。SePEP與PEP的溴酚藍(lán)結(jié)合量分別為(80.59±4.06)μg和(20.33±3.55)μg,SePEP表面疏水性較PEP顯著增加(<0.05)。這是由于硒與蛋白質(zhì)結(jié)合改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部環(huán)境,導(dǎo)致埋藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,引起表面疏水性增加。綜上所述,外源硒的添加顯著改變了PEP的結(jié)構(gòu),但硒對蛋白結(jié)構(gòu)特性影響的具體機(jī)制還需深入研究。
表2 SePEP與PEP的巰基、二硫鍵含量及溴酚藍(lán)結(jié)合量Table 2 Sulfhydryl and disulfide bond contents and bromophenol blue-binding capacity of SePEP and PEP
不同濃度Pb溶液對RAW264.7細(xì)胞活力影響(作用時(shí)間12 h)如圖4A所示,當(dāng)Pb濃度在0~100 μmol/L范圍內(nèi)時(shí),與對照組(0 μmol/L Pb溶液)相比,細(xì)胞存活率未顯著變化(<0.05),說明在此濃度范圍內(nèi)Pb溶液對RAW264.7細(xì)胞無顯著毒性。隨Pb濃度繼續(xù)升高,細(xì)胞存活率逐漸降低,呈劑量依賴性。當(dāng)Pb濃度為800 μmol/L時(shí),細(xì)胞存活率僅為(53.48±6.49)%,與對照組相比顯著下降了46.52%(<0.05),表明該濃度下的Pb具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
圖4 不同濃度Pb2+(A)及蛋白消化產(chǎn)物(B)對RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 4 Effects of Pb2+ concentration (A) and protein digestion products (B) on the viability of RAW264.7 cells
將不同質(zhì)量濃度SePEP及PEP消化產(chǎn)物溶液作用于RAW264.7細(xì)胞12 h,細(xì)胞存活率結(jié)果見圖4B。PEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0~100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率無顯著差異(<0.05),說明該濃度范圍內(nèi)PEP消化產(chǎn)物對RAW264.7細(xì)胞未產(chǎn)生毒性。質(zhì)量濃度0~75 μg/mL范圍內(nèi)的SePEP消化產(chǎn)物對RAW264.7細(xì)胞未表現(xiàn)出毒性作用。當(dāng)SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí),細(xì)胞活力降低至(86.37±6.79)%,與對照組(0 μg/mL蛋白消化產(chǎn)物)相比有顯著差異(<0.05),這是因?yàn)槲臓I養(yǎng)必需劑量與毒性劑量之間的范圍非常窄,攝入適量的硒于機(jī)體有益,硒攝入過量則會(huì)造成硒中毒,引起呼吸困難、腹痛、腹瀉,甚至死亡,100 μg/mL的SePEP消化產(chǎn)物作用時(shí)可能對細(xì)胞產(chǎn)生了低毒性作用。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5、25、75 μg/mL作為蛋白消化產(chǎn)物作用質(zhì)量濃度。
當(dāng)Pb濃度為800 μmol/L,不添加蛋白消化產(chǎn)物時(shí),RAW264.7細(xì)胞存活率接近50%,可作為衡量Pb溶液對細(xì)胞毒性的指標(biāo)。以質(zhì)量濃度為5、25、75 μg/mL的SePEP或PEP消化產(chǎn)物與800 μmol/L Pb溶液共處理細(xì)胞12 h,細(xì)胞存活率變化如圖5A所示。與Pb處理組相比,不同質(zhì)量濃度的PEP消化產(chǎn)物對Pb細(xì)胞毒性無顯著影響(<0.05),表明PEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性無緩解作用。SePEP消化產(chǎn)物與Pb共處理組中,細(xì)胞存活率與消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度呈正相關(guān),呈劑量依賴性。在SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率為(76.95±6.95)%,與Pb處理組相比細(xì)胞存活率顯著提高(<0.05)。Zhu Yiqing等以2.0 mmol/L Pb溶液作用于Caco-2細(xì)胞,細(xì)胞活力降至對照組的51.30%,添加水稻富硒蛋白水解物后,細(xì)胞存活率升高了約19.43%(<0.05),說明富硒蛋白水解物對Pb細(xì)胞毒性有改善作用,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
圖5 不同質(zhì)量濃度蛋白消化產(chǎn)物對800 μmol/L Pb2+損傷RAW264.7細(xì)胞活力(A)及LDH釋放量(B)的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and LDH release (B) of 800 μmol/L Pb2+-injured RAW264.7 cells
LDH是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì),當(dāng)細(xì)胞受到刺激死亡或結(jié)構(gòu)被破壞時(shí),細(xì)胞內(nèi)的LDH就會(huì)釋放出來,培養(yǎng)液中LDH釋放量可反映細(xì)胞存活率。Pb處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量為(1 364.79±81.43)U/L。添加不同質(zhì)量濃度SePEP消化產(chǎn)物后,LDH釋放量隨SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加而減少,當(dāng)SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí),LDH釋放量最低,為(580.73±48.11)U/L,與Pb處理組相比,細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量顯著降低了57.45%(<0.05),PEP消化產(chǎn)物的添加對細(xì)胞LDH釋放水平無顯著影響(>0.05)。結(jié)果表明,與PEP消化產(chǎn)物相比,SePEP消化產(chǎn)物對Pb細(xì)胞毒性具有顯著緩解作用(<0.05)。
由圖6A可知,5、25、75 μg/mL SePEP或PEP消化產(chǎn)物與100 μmol/L Pb溶液共處理對RAW264.7細(xì)胞存活率均無顯著影響(<0.05)。因此,上述條件下細(xì)胞存活率一致,細(xì)胞因子分泌水平僅受細(xì)胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)影響,故所選Pb濃度可用于無細(xì)胞毒性條件下細(xì)胞因子分泌水平差異的分析。與0 μmol/L Pb溶液處理組相比,Pb處理使細(xì)胞培養(yǎng)液中3 種促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高(<0.05),分別為(79.79±10.80)、(108.58±6.54)、(76.08±5.62)ng/L,說明細(xì)胞已產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與Pb處理組相比,添加PEP消化產(chǎn)物共處理對3 種促炎因子的分泌量整體上無顯著影響(>0.05);而SePEP消化產(chǎn)物的添加促使IL-6、IL-8及TNF-α質(zhì)量濃度整體上顯著下降(<0.05),且呈劑量依賴性,其中IL-8質(zhì)量濃度在SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/nL時(shí)顯著降低至(65.87±6.54)ng/L(<0.05)。RAW264.7細(xì)胞受外物刺激分泌大量炎癥因子,包括IL-6、IL-8與TNF-α等,被廣泛應(yīng)用于建立細(xì)胞炎癥模型。IL-6與TNF-α和IL-1家族相似,具有促炎特性,在介導(dǎo)炎癥中起重要作用,釋放水平過高可致細(xì)胞死亡。IL-8是一種多細(xì)胞來源的趨化因子,可通過聚集中性粒細(xì)胞增強(qiáng)炎癥反應(yīng),間接創(chuàng)造利于腫瘤生長的微環(huán)境。抑制促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的釋放可以抑制炎癥相關(guān)信號通路如NF-κB、MAPK通路的激活,從而減輕炎癥反應(yīng)及炎癥過程中的組織損傷。已有研究表明Se可顯著抑制Pb暴露引起的細(xì)胞炎癥,如向Pb暴露的RAW264.7細(xì)胞中添加大米富硒蛋白水解物可顯著抑制促炎因子IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α及髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的釋放(<0.05);單獨(dú)以醋酸鉛飼喂雞會(huì)顯著提高雞血淋巴細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α因子mRNA表達(dá)水平,亞硒酸鈉和醋酸鉛聯(lián)合飼喂時(shí)促炎因子表達(dá)水平受到顯著抑制。本實(shí)驗(yàn)中SePEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎因子釋放有顯著抑制作用,PEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的促炎因子釋放無明顯影響。結(jié)果表明,與PEP消化產(chǎn)物相比,SePEP消化產(chǎn)物對Pb引起的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)有顯著緩解作用(<0.05)。
圖6 不同質(zhì)量濃度蛋白消化產(chǎn)物對100 μmol/L Pb2+損傷RAW264.7細(xì)胞存活率(A)及細(xì)胞因子IL-6(B)、IL-8(C)、TNF-α(D)質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and IL-6 (B), IL-8 (C) and TNF-α (D)release of 100 μmol/L Pb2+-damaged RAW264.7 cells
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SePEP硒含量為(360.64±3.11)mg/kg,其硒形態(tài)主要包括SeMet((48.04±0.64)%(相對含量,下同))、SeCys((31.91±0.51)%)及MeSeCys((14.65±0.36)%)。硒生物強(qiáng)化顯著改變了蛋白的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特性,與PEP相比,SePEP氨基酸含量顯著增加,-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量增多,無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量減少,總巰基與二硫鍵的含量增加,蛋白表面疏水性提高。此外,SePEP體外模擬消化產(chǎn)物可顯著降低Pb對RAW264.7細(xì)胞毒性,細(xì)胞存活率可由(53.48±6.49)%升高至(76.95±6.95)%。SePEP消化產(chǎn)物對Pb暴露RAW264.7細(xì)胞的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的釋放具有顯著抑制作用,緩解了Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。綜上,SePEP可作為膳食硒補(bǔ)充劑滿足人群補(bǔ)硒需求,并且可作為一種改善鉛毒性的新型膳食硒源。