杏鮑菇富硒蛋白的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特性及對鉛毒性的緩解作用

張雪莉，胡秋輝,,*，紀(jì) 陽，俞安淇，仲 磊，趙立艷，范育明

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.灌南縣園藝技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 連云港 222500）

硒是維持機(jī)體健康必需的微量元素，攝入適量的硒有利于保護(hù)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、甲狀腺功能、生育功能及抗氧化功能等。機(jī)體自身無法合成硒元素，只能從外界攝入，但人類日常飲食中硒含量較低，難以滿足普通人群尤其是缺硒地區(qū)人群的補(bǔ)硒需求。目前大多通過葉面噴硒、根部灌硒等方式使農(nóng)作物富集硒以提高食物中的硒含量及生物可利用性。作物中的大部分硒以硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）及硒代同型半胱氨酸等形態(tài)與蛋白質(zhì)結(jié)合，使得富硒蛋白成為硒在作物中的主要存在形式。研究發(fā)現(xiàn)，硒與蛋白結(jié)合不僅提高了蛋白質(zhì)中的硒含量，還會(huì)影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)、結(jié)構(gòu)和功能活性，如與花生普通蛋白相比，花生富硒蛋白的氨基酸含量增加，二級結(jié)構(gòu)顯著變化；與秀珍菇普通蛋白相比，秀珍菇富硒蛋白的表面疏水性增加，-折疊含量降低而無規(guī)卷曲含量增加；與糙米普通蛋白相比，富硒蛋白-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，-螺旋和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低，體外抗氧化性顯著增強(qiáng)。

鉛作為一種有害重金屬元素，通過食物及飲用水、空氣及皮膚接觸等途徑在人體內(nèi)富集，主要分布在大腦、腎臟、肝臟及骨骼等器官中。膳食鉛暴露可能會(huì)破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼造血系統(tǒng)，引起貧血、高血壓、腎臟損傷等疾病。傳統(tǒng)的治療鉛中毒的方法為螯合治療法，但螯合劑的使用存在一定副作用，例如長期服用依地酸二鈉鈣會(huì)導(dǎo)致疲勞、惡心、加重腎負(fù)擔(dān)且會(huì)引起人體鐵、鋅等微量元素的流失。已有研究表明，硒不僅能夠影響鉛的吸收，還能對鉛誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥損傷和免疫系統(tǒng)紊亂產(chǎn)生顯著拮抗作用。Wu Jian等研究表明大米富硒蛋白水解物可抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路以減輕Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Fang Yong等研究發(fā)現(xiàn)富硒大米蛋白水解物可能通過抑制Caspase蛋白家族的激活減輕Pb對PC12細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的毒性。以上研究均表明食源性硒蛋白具有潛在的緩解Pb細(xì)胞毒性的作用。

杏鮑菇是我國工廠化大規(guī)模種植的一種食用菌，富含蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)成分，其栽培不受土壤因素限制，培養(yǎng)周期短，并且杏鮑菇對微量元素有較好的吸收能力，因此相較于大米、小麥等谷物，杏鮑菇是一種理想的硒生物強(qiáng)化載體。目前對杏鮑菇富硒蛋白（selenium-enriched proteinfrom，SePEP）的營養(yǎng)、結(jié)構(gòu)特性及其鉛毒性緩解作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以SePEP為原料，分析蛋白中硒含量、形態(tài)和氨基酸，并測定蛋白的結(jié)構(gòu)以評估硒積累對杏鮑菇蛋白營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)特性的影響。此外，通過體外模擬消化SePEP和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究SePEP對Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的影響，旨在為SePEP緩解鉛毒性作用機(jī)理研究及SePEP功能食品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒杏鮑菇和普通杏鮑菇均種植于江蘇麗莎菌業(yè)股份有限公司，富硒杏鮑菇栽培過程中以富硒酵母作為硒源（培養(yǎng)基中硒含量：40 mg/kg）。將富硒杏鮑菇冷凍干燥后磨粉過80 目篩備用；小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購于復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心。

SeMet、SeCys、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸鈉、硒酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶XIV美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶 美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenas，LDH）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程生物研究所；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀、1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫科技有限公司；Mars6微波消解儀 美國CEM公司；IR200傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 SePEP和普通杏鮑菇蛋白的制備

參照席甜和袁彪的方法提取純化SePEP。稱取0.04 g堿提酸沉所得粗蛋白溶于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，過0.45 μm濾膜。將濾液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow凝膠層析柱。用0.1～0.7 mol/L NaCl緩沖液洗脫，收集各組分并測定硒含量。以硒含量最高的組分記為SePEP。普通杏鮑菇蛋白（protein from，PEP）的提取方法同上。

1.3.2 硒含量的測定

硒含量的測定參考GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》，并作適當(dāng)修改。精確稱取0.2 g待測樣品于消解管中，添加5 mL HNO（純度65%～68%）預(yù)消解12 h，再加入1 mL HO微波消解，冷卻后定容至50 mL，通過ICP-MS分析硒含量。ICP-MS射頻功率：1 550 W；等離子體氣流量：15.0 L/min；載氣流量：1.0 L/min；輔助氣流量：1.0 L/min；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.1 r/min；霧化室溫度：2 ℃；霧化室氣流量：0.1 L/min。

1.3.3 硒形態(tài)的測定

根據(jù)薛梅等的方法通過HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測定硒形態(tài)。稱取0.25 g蛋白質(zhì)于離心管中，加入10 mL質(zhì)量濃度8 mg/mL蛋白酶XIV溶液。將離心管置于37 ℃及150 r/min條件下振蕩12 h，于5 000 r/min下離心10 min，取上清過0.22 μm濾膜上機(jī)分析。硒形態(tài)和含量分別根據(jù)各硒標(biāo)準(zhǔn)物鑒定和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。HPLC的工作參數(shù)如下：Hamilton PRP-X100色譜柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流動(dòng)相A相為5 mmol/L pH 4.7檸檬酸溶液，流動(dòng)相B相為15 mmol/L pH 4.7檸檬酸溶液；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL。洗脫條件：0～6 min，100% A；6～10 min，50% A；10～23 min，0% A；23 min，100% A。

將亞硒酸鈉、硒酸鈉、SeMet、SeCys、MeSeCys 5 種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品混合，配制成質(zhì)量濃度梯度為0、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法得到HPLC圖（圖1）。四價(jià)硒（Se）、六價(jià)硒（Se）、SeMet、SeCys、MeSeCys的回歸方程分別為＝445.35-147.17，＝0.996 2；＝624.75-418.45，＝0.999 2；＝477.02-12.776，＝0.999 5；＝1 148.6-625.35，＝0.999 9；＝434.12-87.076，＝0.999 2。

圖1 質(zhì)量濃度100 μg/L硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of 100 μg/L mixed selenium standard

1.3.4 SePEP氨基酸的測定

參考張夢甜等的方法作適當(dāng)修改測定蛋白質(zhì)中的氨基酸。稱取0.02 g蛋白質(zhì)于水解管中，添加20 mL 6 mol/L鹽酸溶液，密封，于110 ℃烘箱中加熱水解22 h，冷卻后氮吹樣品以去除濃鹽酸。復(fù)溶于0.02 mol/L鹽酸溶液并定容至50 mL，過0.22 μm濾膜，經(jīng)全自動(dòng)氨基酸分析儀測定。

1.3.5 SePEP二級結(jié)構(gòu)相對含量的測定

蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量通過傅里葉變換紅外光譜儀測定。將富硒杏鮑菇蛋白與溴化鉀以質(zhì)量比1∶100研磨并壓片，進(jìn)行紅外光譜分析。分析參數(shù)中波數(shù)范圍設(shè)為4 000～500 cm，分辨率設(shè)為4 cm，掃描60 次。二級結(jié)構(gòu)通過Peak Fit軟件對掃描圖譜中1 700～1 600 cm酰胺I帶進(jìn)行分析。其中1 600～1 640 cm為-折疊，1 641～1 650 cm為無規(guī)卷曲，1 651～1 660 cm為-螺旋，1 661～1 690 cm為-轉(zhuǎn)角。

1.3.6 SePEP巰基與二硫鍵含量的測定

參照羅明江等的方法，通過Ellman’s試劑測定蛋白巰基與二硫鍵的含量?？値€基和游離巰基含量計(jì)算如式（1）所示，二硫鍵含量計(jì)算如式（2）所示。

式中：為溶液在412 nm波長處吸光度；為稀釋倍數(shù)；為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 SePEP表面疏水性的測定

參考Chelh等的方法，稱取適量蛋白溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.0）中，使蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取1 mL蛋白溶液并添加200 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，以添加200 μL含溴酚藍(lán)的PBS為對照。靜置30 min，于6 000 ×離心15 min，于595 nm波長下測定吸光度。溴酚藍(lán)結(jié)合量計(jì)算如式（3）所示。以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征蛋白的表面疏水性。

式中：為含溴酚藍(lán)的PBS吸光度；為樣品上清液的吸光度；為添加的溴酚藍(lán)質(zhì)量（200 μg）。

1.3.8 體外模擬消化SePEP

參考Brodkorb等的方法并作適當(dāng)修改對蛋白進(jìn)行體外模擬消化。稱取2.0 g蛋白樣品加入10 mL蒸餾水，再加入10 mL模擬唾液，搖勻，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至1.8。以1∶1（/）比例加入模擬胃液（2 000 U/mL胃蛋白酶消化液），于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩4 h，調(diào)pH值至6.8。以1∶1（/）比例加入模擬腸液（100 U/mL胰蛋白酶最終混合物），繼續(xù)于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩4 h。消化完全后取出樣品，并于沸水中煮沸5～10 min滅酶。

1.3.9 SePEP消化產(chǎn)物對Pb損傷RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

參考Wu Jian等的方法培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞。采用MTT法測定RAW264.7細(xì)胞暴露于不同濃度Pb溶液12 h后細(xì)胞存活率的變化，以篩選Pb作用濃度。將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×10個(gè)。細(xì)胞鋪滿底部80%后，棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS清洗3 次。向細(xì)胞中加入100 μL不同濃度Pb溶液（0、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L）孵育12 h，吸棄處理液。加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL MTT溶液于培養(yǎng)箱孵育4 h。吸棄MTT溶液，再向每孔加入100 μL DMSO，37 ℃下振蕩10 min，于波長570 nm下測定吸光度，細(xì)胞存活率以對照組（0 μmol/L Pb溶液）為100%計(jì)算，空白組加入0.01 mol/L PBS。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如式（4）所示。

測定不同質(zhì)量濃度（0、1、5、10、25、50、75、100 μg/mL）蛋白消化產(chǎn)物及Pb與蛋白消化產(chǎn)物共處理12 h對RAW264.7細(xì)胞活力的影響，方法如上所述。待96 孔板底部鋪滿細(xì)胞后，加入蛋白消化產(chǎn)物和Pb混合溶液，12 h后測定細(xì)胞存活率。

1.3.10 LDH釋放量及細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的測定

根據(jù)檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力及IL-6、IL-8、TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

研究中所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行，使用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)兩組之間的差異顯著性（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SePEP的硒含量及硒形態(tài)分析

經(jīng)ICP-MS測定，富硒杏鮑菇中硒含量為（90.01±7.01）mg/kg，SePEP中硒含量為（360.64±3.11）mg/kg，PEP中未檢測到硒。經(jīng)蛋白酶XIV酶解提取后，提取液中硒質(zhì)量濃度為（282.82±13.13）mg/L，經(jīng)酶解后，蛋白質(zhì)中78.42%的硒被提取至提取液中。通過HPLC-ICP-MS測定SePEP的硒形態(tài)，由圖2A可知，SePEP中主要包括SeCys、MeSeCys和SeMet。通過對3 種硒化合物含量及其中硒含量計(jì)算可得，SePEP中SeCys、MeSeCys、SeMet含量分別為（413.28±6.66）、（103.39±2.54）mg/kg和（356.87±4.75）mg/kg，3 種硒化合物中的硒含量分別為（90.24±1.46）、（41.42±1.02）mg/kg和（135.87±1.81）mg/kg（圖2B）。由以上數(shù)據(jù)計(jì)算可知，各形態(tài)硒在SePEP中的相對含量為SeCys（31.91±0.51）%、MeSeCys（14.65±0.36）%和SeMet（48.04±0.64）%（圖2C）。富硒蛋白中的硒形態(tài)大部分為有機(jī)硒，如大豆富硒蛋白主要硒形態(tài)為SeMet；茶葉富硒蛋白和魔芋富硒蛋白主要硒形態(tài)為SeMet和SeCys。其中，SeMet與SeCys的形成是由于蛋氨酸合成酶及半胱氨酸合成酶無法識(shí)別Se和S原子，Se非特異性取代了蛋白質(zhì)中的S原子。SeCys是SeCys不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化形成的代謝物。MeSeCys是由SeCys與-腺苷蛋氨酸反應(yīng)并通過硒甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化而成。根據(jù)Battin等的研究，SeMet、SeCys及MeSeCys可以與銅和鐵元素結(jié)合緩解銅、鐵濃度異常升高引起的大腸桿菌質(zhì)粒DNA氧化損傷。

圖2 SePEP中硒形態(tài)的HPLC色譜圖（A）、各形態(tài)硒含量（B）及含量比例（C）Fig. 2 HPLC chromatogram of selenium species (A) and content (B)and proportion (C) of each selenium species in SePEP

2.2 SePEP氨基酸的種類與含量

氨基酸種類與含量是評價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。SePEP及PEP的氨基酸組成與含量見表1，兩種蛋白中均檢測到17 種氨基酸，且SePEP中大部分氨基酸含量顯著高于PEP（＜0.05）。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出的理想模式，必需氨基酸（essential amino acids，EAA）/總氨基酸（total amino acids，TAA）比值為0.4左右，EAA/非必需氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）比值大于0.6，則該種蛋白質(zhì)品質(zhì)較好。因此，SePEP與PEP均具有合理的氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)，適量的硒積累可提高植物蛋白質(zhì)中氨基酸含量，提高蛋白營養(yǎng)價(jià)值，這是因?yàn)榘被崾亲魑锏x的產(chǎn)物，作物富集硒的過程中影響了硫代謝，同時(shí)影響了與硫代謝在乙酰絲氨酸水平上相互作用的氮代謝。

表1 SePEP與PEP的氨基酸組成與含量Table 1 Amino acid composition of SePEP and PEP

2.3 SePEP的結(jié)構(gòu)表征

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲4 種類型。由圖3可知，SePEP二級結(jié)構(gòu)由（25.00±1.60）%（相對含量，下同）-螺旋、（37.48±1.37）%-折疊、（23.67±1.41）%-轉(zhuǎn)角和（13.85±1.66）%無規(guī)卷曲組成；PEP二級結(jié)構(gòu)則由（20.30±0.87）%-螺旋、（35.88±0.73）%-折疊、（24.92±0.92）%-轉(zhuǎn)角及（20.38±0.84）%無規(guī)卷曲組成。相較于PEP，SePEP中-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量顯著增多（＜0.05），無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量顯著減少（＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，硒的添加會(huì)導(dǎo)致糙米蛋白中-折疊與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量增多，-轉(zhuǎn)角與-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量減少；隨外源硒濃度增加，秀珍菇富硒蛋白的-螺旋與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量先增多后減少。

圖3 SePEP與PEP的紅外光譜圖（A）與二級結(jié)構(gòu)組成（B）Fig. 3 Infrared spectra (A) and secondary structure composition (B) of SePEP and PEP

巰基與二硫鍵含量可以反映蛋白質(zhì)分子間結(jié)合的強(qiáng)弱，在維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上起重要作用。根據(jù)表2可知，SePEP總巰基及二硫鍵含量顯著高于PEP（＜0.05），游離巰基含量無顯著差異（＞0.05）。硒的生物強(qiáng)化導(dǎo)致PEP總巰基與二硫鍵含量增加，與花生富硒蛋白測定結(jié)果一致。蛋白質(zhì)分子的表面疏水性反映了三級結(jié)構(gòu)的展開程度、表面疏水基團(tuán)數(shù)量及分子間相互作用的強(qiáng)弱。以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征蛋白的表面疏水性，溴酚藍(lán)結(jié)合量越高則說明表面疏水性越高。SePEP與PEP的溴酚藍(lán)結(jié)合量分別為（80.59±4.06）μg和（20.33±3.55）μg，SePEP表面疏水性較PEP顯著增加（＜0.05）。這是由于硒與蛋白質(zhì)結(jié)合改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部環(huán)境，導(dǎo)致埋藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，引起表面疏水性增加。綜上所述，外源硒的添加顯著改變了PEP的結(jié)構(gòu)，但硒對蛋白結(jié)構(gòu)特性影響的具體機(jī)制還需深入研究。

表2 SePEP與PEP的巰基、二硫鍵含量及溴酚藍(lán)結(jié)合量Table 2 Sulfhydryl and disulfide bond contents and bromophenol blue-binding capacity of SePEP and PEP

2.4 Pb2+及SePEP消化產(chǎn)物對RAW264.7巨噬細(xì)胞作用濃度的篩選分析

不同濃度Pb溶液對RAW264.7細(xì)胞活力影響（作用時(shí)間12 h）如圖4A所示，當(dāng)Pb濃度在0～100 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，與對照組（0 μmol/L Pb溶液）相比，細(xì)胞存活率未顯著變化（＜0.05），說明在此濃度范圍內(nèi)Pb溶液對RAW264.7細(xì)胞無顯著毒性。隨Pb濃度繼續(xù)升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性。當(dāng)Pb濃度為800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為（53.48±6.49）%，與對照組相比顯著下降了46.52%（＜0.05），表明該濃度下的Pb具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

圖4 不同濃度Pb2＋（A）及蛋白消化產(chǎn)物（B）對RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 4 Effects of Pb2+ concentration (A) and protein digestion products (B) on the viability of RAW264.7 cells

將不同質(zhì)量濃度SePEP及PEP消化產(chǎn)物溶液作用于RAW264.7細(xì)胞12 h，細(xì)胞存活率結(jié)果見圖4B。PEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率無顯著差異（＜0.05），說明該濃度范圍內(nèi)PEP消化產(chǎn)物對RAW264.7細(xì)胞未產(chǎn)生毒性。質(zhì)量濃度0～75 μg/mL范圍內(nèi)的SePEP消化產(chǎn)物對RAW264.7細(xì)胞未表現(xiàn)出毒性作用。當(dāng)SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力降低至（86.37±6.79）%，與對照組（0 μg/mL蛋白消化產(chǎn)物）相比有顯著差異（＜0.05），這是因?yàn)槲臓I養(yǎng)必需劑量與毒性劑量之間的范圍非常窄，攝入適量的硒于機(jī)體有益，硒攝入過量則會(huì)造成硒中毒，引起呼吸困難、腹痛、腹瀉，甚至死亡，100 μg/mL的SePEP消化產(chǎn)物作用時(shí)可能對細(xì)胞產(chǎn)生了低毒性作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5、25、75 μg/mL作為蛋白消化產(chǎn)物作用質(zhì)量濃度。

2.5 SePEP消化產(chǎn)物對Pb2+細(xì)胞毒性的影響

當(dāng)Pb濃度為800 μmol/L，不添加蛋白消化產(chǎn)物時(shí)，RAW264.7細(xì)胞存活率接近50%，可作為衡量Pb溶液對細(xì)胞毒性的指標(biāo)。以質(zhì)量濃度為5、25、75 μg/mL的SePEP或PEP消化產(chǎn)物與800 μmol/L Pb溶液共處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞存活率變化如圖5A所示。與Pb處理組相比，不同質(zhì)量濃度的PEP消化產(chǎn)物對Pb細(xì)胞毒性無顯著影響（＜0.05），表明PEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性無緩解作用。SePEP消化產(chǎn)物與Pb共處理組中，細(xì)胞存活率與消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，呈劑量依賴性。在SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為（76.95±6.95）%，與Pb處理組相比細(xì)胞存活率顯著提高（＜0.05）。Zhu Yiqing等以2.0 mmol/L Pb溶液作用于Caco-2細(xì)胞，細(xì)胞活力降至對照組的51.30%，添加水稻富硒蛋白水解物后，細(xì)胞存活率升高了約19.43%（＜0.05），說明富硒蛋白水解物對Pb細(xì)胞毒性有改善作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 不同質(zhì)量濃度蛋白消化產(chǎn)物對800 μmol/L Pb2＋損傷RAW264.7細(xì)胞活力（A）及LDH釋放量（B）的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and LDH release (B) of 800 μmol/L Pb2+-injured RAW264.7 cells

LDH是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激死亡或結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的LDH就會(huì)釋放出來，培養(yǎng)液中LDH釋放量可反映細(xì)胞存活率。Pb處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量為（1 364.79±81.43）U/L。添加不同質(zhì)量濃度SePEP消化產(chǎn)物后，LDH釋放量隨SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加而減少，當(dāng)SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí)，LDH釋放量最低，為（580.73±48.11）U/L，與Pb處理組相比，細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量顯著降低了57.45%（＜0.05），PEP消化產(chǎn)物的添加對細(xì)胞LDH釋放水平無顯著影響（＞0.05）。結(jié)果表明，與PEP消化產(chǎn)物相比，SePEP消化產(chǎn)物對Pb細(xì)胞毒性具有顯著緩解作用（＜0.05）。

2.6 SePEP消化產(chǎn)物對Pb2+誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞因子分泌水平的影響

由圖6A可知，5、25、75 μg/mL SePEP或PEP消化產(chǎn)物與100 μmol/L Pb溶液共處理對RAW264.7細(xì)胞存活率均無顯著影響（＜0.05）。因此，上述條件下細(xì)胞存活率一致，細(xì)胞因子分泌水平僅受細(xì)胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)影響，故所選Pb濃度可用于無細(xì)胞毒性條件下細(xì)胞因子分泌水平差異的分析。與0 μmol/L Pb溶液處理組相比，Pb處理使細(xì)胞培養(yǎng)液中3 種促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），分別為（79.79±10.80）、（108.58±6.54）、（76.08±5.62）ng/L，說明細(xì)胞已產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與Pb處理組相比，添加PEP消化產(chǎn)物共處理對3 種促炎因子的分泌量整體上無顯著影響（＞0.05）；而SePEP消化產(chǎn)物的添加促使IL-6、IL-8及TNF-α質(zhì)量濃度整體上顯著下降（＜0.05），且呈劑量依賴性，其中IL-8質(zhì)量濃度在SePEP消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為75 μg/nL時(shí)顯著降低至（65.87±6.54）ng/L（＜0.05）。RAW264.7細(xì)胞受外物刺激分泌大量炎癥因子，包括IL-6、IL-8與TNF-α等，被廣泛應(yīng)用于建立細(xì)胞炎癥模型。IL-6與TNF-α和IL-1家族相似，具有促炎特性，在介導(dǎo)炎癥中起重要作用，釋放水平過高可致細(xì)胞死亡。IL-8是一種多細(xì)胞來源的趨化因子，可通過聚集中性粒細(xì)胞增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，間接創(chuàng)造利于腫瘤生長的微環(huán)境。抑制促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的釋放可以抑制炎癥相關(guān)信號通路如NF-κB、MAPK通路的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)及炎癥過程中的組織損傷。已有研究表明Se可顯著抑制Pb暴露引起的細(xì)胞炎癥，如向Pb暴露的RAW264.7細(xì)胞中添加大米富硒蛋白水解物可顯著抑制促炎因子IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α及髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的釋放（＜0.05）；單獨(dú)以醋酸鉛飼喂雞會(huì)顯著提高雞血淋巴細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α因子mRNA表達(dá)水平，亞硒酸鈉和醋酸鉛聯(lián)合飼喂時(shí)促炎因子表達(dá)水平受到顯著抑制。本實(shí)驗(yàn)中SePEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎因子釋放有顯著抑制作用，PEP消化產(chǎn)物對Pb誘導(dǎo)的促炎因子釋放無明顯影響。結(jié)果表明，與PEP消化產(chǎn)物相比，SePEP消化產(chǎn)物對Pb引起的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)有顯著緩解作用（＜0.05）。

圖6 不同質(zhì)量濃度蛋白消化產(chǎn)物對100 μmol/L Pb2＋損傷RAW264.7細(xì)胞存活率（A）及細(xì)胞因子IL-6（B）、IL-8（C）、TNF-α（D）質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and IL-6 (B), IL-8 (C) and TNF-α (D)release of 100 μmol/L Pb2+-damaged RAW264.7 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SePEP硒含量為（360.64±3.11）mg/kg，其硒形態(tài)主要包括SeMet（（48.04±0.64）%（相對含量，下同））、SeCys（（31.91±0.51）%）及MeSeCys（（14.65±0.36）%）。硒生物強(qiáng)化顯著改變了蛋白的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特性，與PEP相比，SePEP氨基酸含量顯著增加，-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量增多，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量減少，總巰基與二硫鍵的含量增加，蛋白表面疏水性提高。此外，SePEP體外模擬消化產(chǎn)物可顯著降低Pb對RAW264.7細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率可由（53.48±6.49）%升高至（76.95±6.95）%。SePEP消化產(chǎn)物對Pb暴露RAW264.7細(xì)胞的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的釋放具有顯著抑制作用，緩解了Pb誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。綜上，SePEP可作為膳食硒補(bǔ)充劑滿足人群補(bǔ)硒需求，并且可作為一種改善鉛毒性的新型膳食硒源。