紫蘇籽多糖分離純化及抗腫瘤活性

劉子坤，尹 賀，楊安皓，安綺沄，李沖偉,3,*，金 濤,*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱美蘇生物科技開發(fā)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150080）

紫蘇（(L.) Britt）為一年生草本植物，在中國(guó)、印度、日本和韓國(guó)等地盛產(chǎn)。在中國(guó)，紫蘇和紫蘇籽均被國(guó)家衛(wèi)生部列入“藥食同源”名單中。紫蘇籽中含有黃酮、多酚、多肽和迷迭香酸等多種活性成分、以及豐富的不飽和脂肪酸，主要成分-亞麻酸進(jìn)入人體后可生成二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等，具有降血脂、預(yù)防血栓形成、保護(hù)心腦血管和提高免疫力的功能。Kwak等發(fā)現(xiàn)紫蘇葉乙醇提取物對(duì)HCT116大腸癌細(xì)胞和H1299肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均起到抑制作用，Park等發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇外流能力，并降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Thomas等研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉提取物能夠降低高脂飲食導(dǎo)致的高血脂水平，對(duì)控制嚙齒類動(dòng)物肥胖具有一定的功效。目前，大多數(shù)研究集中在紫蘇油和紫蘇葉上，對(duì)紫蘇粕的功效研究卻鮮有報(bào)道。紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的多糖、多肽和黃酮類物質(zhì)。目前，這些紫蘇粕大部分沒有得到很好的利用，直接作為畜禽飼料，或直接丟棄，不僅造成了資源的浪費(fèi)，而且污染了周圍的環(huán)境。

多糖在多種方面均具有重要生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)非特異性免疫等。在多糖抗腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，多糖可對(duì)肝癌、肺癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞起到抑制作用。因此，多糖的抗腫瘤作用被越來越多的研究者關(guān)注。本研究以紫蘇籽多糖（seed polysaccharide，PFSP）為對(duì)象，并通過構(gòu)建H荷瘤小鼠模型探究PFSP對(duì)小鼠血清細(xì)胞免疫因子和相關(guān)酶質(zhì)量濃度，及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)合腫瘤組織顯微病理切片觀察，闡釋PFSP的抗腫瘤功效，以期為紫蘇籽高值化利用提供理論參考，為開發(fā)植物源高效抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6～8 周齡SPF級(jí)昆明種健康小鼠購(gòu)自哈爾濱市雙城區(qū)弘昌養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2007-0001。

紫蘇籽由哈爾濱美蘇生物科技開發(fā)有限公司提供；肝癌瘤株H購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。

纖維素DEAE-52 福州飛凈生物科技有限公司；Sephadex G-100、G-200葡聚糖凝膠 常州天地人和生物科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、醛縮酶（aldolase，ALD）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）藥劑（（CTX）∶（人參莖葉總皂苷）＝1∶1） 吉林通化茂祥制藥有限公司；三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、乙腈、三乙醇胺等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1100冷凍干燥機(jī) 日本EYELA東京理化器械株式會(huì)社；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Ulti Mate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Dionex公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜分析儀美國(guó)Perkin Elmer公司；SpectraMax Paradingm多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；LWD 200-37 T倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 PFSP提取

取紫蘇籽榨油后的紫蘇粕廢料粉碎化，過60 目篩，加入石油醚（1∶20，/）脫脂6 h，殘留物用蒸餾水（1∶20，/）在85 ℃提取2 h，此過程重復(fù)3 次，收集所有濾液。蒸發(fā)濃縮后加入3 倍體積無水乙醇，并在4 ℃下靜置12 h，5 000 r/min離心15 min。沉淀物復(fù)溶后加入Sevag試劑（（正丁醇）∶（氯仿）＝1∶3）進(jìn)行脫蛋白處理，反復(fù)多次，直至無明顯殘留。將溶液在自來水、蒸餾水和去離子水內(nèi)分別透析1 d，冷凍干燥得到粗多糖PFSP。

1.3.2 PFSP的分離及純化

將PFSP復(fù)溶后緩慢滴加到經(jīng)處理的DEAE-52纖維素層析柱（58 cm×4 cm）上，依次用0、0.2、0.4、0.6 mol/L和0.8 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為5 mL/min，5 mL收集一管。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并根據(jù)峰值合并各組分。

將PFSP分離得到的各亞組分別裝載到葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱上，用蒸餾水以5 mL/min流速洗脫，收集洗脫液，每管5 mL，根據(jù)峰值合并各組分，冷凍干燥于4 ℃保存。

1.3.3 多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用Sephadex G-200柱層析進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，將不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL溶液，0.1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，記錄洗脫體積（）。并用藍(lán)色葡聚糖相同條件上樣測(cè)得外水體積（）。以已知標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lg）為縱坐標(biāo)，/為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將待測(cè)多糖溶液以相同條件上樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算該多糖相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成分析

稱取2.0 mg干燥樣品分別置于安瓿管中，加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸，110 ℃條件下水解3 h，水解后冷卻至26 ℃，將樣品移至圓底燒瓶并加入色譜級(jí)甲醇，減壓濃縮至干，加入超純水溶解并定容至1.5 mL；取200 μL上述溶液于反應(yīng)管，加入100 μL 0.6 mol/L氨水溶液，100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液，混勻、封口，70 ℃下衍生100 min。反應(yīng)后冷卻至26 ℃，加入200 μL 0.3 mol/L乙酸溶液，氨水中和，搖勻后加入等體積三氯甲烷，萃取分層，收集水相部分，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

檢測(cè)條件：色譜柱Agilent eclipse plus C柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；梯度洗脫：流動(dòng)相A為純乙腈，流動(dòng)相B為NaHPO緩沖液（0.45 g NaHPO+900 mL去離子水+1.0 mL三乙胺+100 mL乙腈），0～4 min 94% B、4～50 min 88% B；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫35 ℃。

混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生方法同上，衍生后利用HPLC儀檢測(cè)。各組分單糖組成定量采用與混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中各單糖的峰面積之比的方法表示。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

取樣品與干燥KBr粉末混合、研磨、壓片，在4 000～400 cm范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.6 免疫器官指數(shù)及抑瘤率測(cè)定

H腫瘤細(xì)胞懸液制備：取H腫瘤細(xì)胞，3 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水沖洗腫瘤細(xì)胞3 次，稀釋5 倍，取40 μL細(xì)胞懸液加入10 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%臺(tái)酚藍(lán)染液，控制細(xì)胞濃度為3.0×10個(gè)/mL。

動(dòng)物飼養(yǎng)及荷瘤小鼠模型構(gòu)建：小鼠雌雄分籠，正常適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d（溫度保持（22±2）℃，相對(duì)濕度保持（50±10）%，噪音小于60 dB，模擬白天和晚上的時(shí)間各為12 h，自由進(jìn)食和飲水）。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將小鼠雌雄各半并隨機(jī)分為每10 只一組，共6 組。除正常組外，其余各組小鼠一次性頸后皮下注射0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行造模，7 d后觀察小鼠頸后是否有明顯腫塊，并剔除造模失敗的小鼠。1 d后對(duì)造模成功的小鼠進(jìn)行灌胃處理，正常組和模型組：灌胃0.3 mL純凈水；陽(yáng)性對(duì)照組：灌胃0.3 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL CTX藥劑；PFSP-1組：灌胃0.3 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-1溶液；PFSP-2組：灌胃0.3 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；PFSP-3組：灌胃0.3 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-3溶液。

各實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)灌胃10 d，末次給藥1 d后斷頸處死并稱體質(zhì)量，摘除脾臟和胸腺用濾紙吸干血液，同時(shí)將實(shí)體瘤剝離，稱質(zhì)量，根據(jù)公式（1）～（3）分別計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率。

1.3.7 血清細(xì)胞因子及腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

將PFSP-2設(shè)定低、中、高劑量組，進(jìn)一步探究PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子和腫瘤細(xì)胞蛋白的影響。低劑量組：灌胃0.1 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；中劑量組：灌胃0.3 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；高劑量組：灌胃0.5 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法測(cè)定小鼠血清中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。各實(shí)驗(yàn)組小鼠眼廓采血，3 000 r/min離心20 min取血清。按照試劑盒方法測(cè)定IL-2、TNF-α、IL-10、LDH及ALD的質(zhì)量濃度。

按照試劑盒說明書收集腫瘤細(xì)胞，抽提細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。將蛋白放置在聚丙稀酰胺凝膠電泳膜上，并依次孵育一抗、二抗，經(jīng)顯影及定影后置于成像分析系統(tǒng)。掃描蛋白條帶灰度，分析及比較各樣本的目的蛋白及參照蛋白條帶灰度，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 腫瘤細(xì)胞形態(tài)觀察

將腫瘤組織固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中滲透12 h，脫水后石蠟包埋，切片后利用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)（400×）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，進(jìn)行Fisher最小顯著性差異檢驗(yàn)和檢驗(yàn)。＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFSP分離純化組成

紫蘇粕中粗多糖的得率為8.38%。粗多糖為淺棕色且呈海綿多孔狀，室溫下微溶于水。PFSP分離純化結(jié)果如圖1所示，利用DEAE-52纖維素柱對(duì)PFSP進(jìn)行分離，粗多糖主要由3 種多糖組分構(gòu)成，分別通過蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫得到，說明組分1為中性多糖、組分2和3為酸性多糖。利用Sephadex G-100層析柱對(duì)3 種粗多糖組分進(jìn)行純化，每個(gè)粗多糖組分均為單一且較寬的洗脫峰。各多糖組分冷凍干燥后稱質(zhì)量，分別占粗多糖的23.22%、28.15%和20.32%。

圖1 PFSP的分離和純化Fig. 1 Isolation and purification of Perilla frutescens seed polysaccharide

2.2 PFSP各組分相對(duì)分子質(zhì)量

PFSP各組分經(jīng)Sephadex G-200層析柱和苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，通過葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程＝-1.763 2+7.171 3（＝0.982 9），得到PFSP-1相對(duì)分子質(zhì)量約為1.06×10，PFSP-2相對(duì)分子質(zhì)量約為5.96×10，PFSP-3相對(duì)分子質(zhì)量約為3.72×10。

2.3 PFSP各組分單糖組成

利用HPLC得到混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖（圖2），并通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖對(duì)比分析，可得到各多糖組分的單糖組成（圖3）。由圖3可知，PFSP-1由甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量之比為0.01∶0.06∶0.11∶0.81；PFSP-2由甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量比為0.28∶0.28∶0.41；PFSP-3由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質(zhì)的量之比為0.013∶0.024∶0.040∶0.080∶0.120∶0.700。由此可知，3 種多糖組分是由不同單糖及不同物質(zhì)的量之比組成的雜多糖。

圖2 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig. 2 High performance liquid chromatogram of mixed monosaccharide standard

圖3 PFSP-1（A）、PFSP-2（B）和PFSP-3（C）HPLC圖Fig. 3 High performance liquid chromatograms of PFSP-1 (A), PFSP-2 (B)and PFSP-3 (C)

2.4 PFSP各組分傅里葉變換紅外光譜分析

PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3紅外光譜如圖4所示，各組分均具有多糖特征吸收峰，且PFSP-2特征吸收峰強(qiáng)度明顯高于其他組分。在3 440 cm和2 925 cm處的吸收峰均為糖類化合物的特征吸收峰，分別是由于—OH拉伸振動(dòng)和—CH或—CH中C—H的拉伸和彎曲振動(dòng)引起，表明多糖中存在分子內(nèi)和分子間氫鍵；在1 640 cm處的強(qiáng)吸收峰是C＝O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；在1 420 cm處的強(qiáng)吸收峰為變形的C—H鍵振動(dòng)峰；在1 050 cm處的特征吸收峰，證明PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3均含有吡喃糖環(huán)，為吡喃環(huán)型多糖。除以上均出現(xiàn)的吸收峰外，PFSP-2在1 250 cm和1 075 cm處存在吸收峰，說明在PFSP-2中含有C—O糖苷鍵，且分子中含有硫酸根。

圖4 PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of PFSP-1,PFSP-2 and PFSP-3

2.5 PFSP對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)及抑瘤率的影響

免疫功能的下降與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可反映機(jī)體免疫機(jī)能的強(qiáng)弱。如圖5A、B所示，與正常組相比，模型組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（＜0.05），說明腫瘤細(xì)胞使小鼠的脾臟和胸腺生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，進(jìn)而造成脾臟和胸腺的質(zhì)量降低。PFSP-1、PFSP-2組和PFSP-3組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（＜0.05），與正常組無顯著差異（＞0.05），表明PFSP能減少腫瘤細(xì)胞對(duì)小鼠脾臟和胸腺的損傷，使免疫器官質(zhì)量增加，這與Liu Yanhong等的研究結(jié)果一致。3 個(gè)PFSP處理組間脾指數(shù)與胸腺指數(shù)也存在差異，但均呈現(xiàn)PFSP-2＞PFSP-1＞PFSP-3，說明PFSP-2對(duì)免疫器官的保護(hù)作用優(yōu)于其他多糖組分。

如圖5C所示，PFSP-2抑瘤率為30.14%，顯著高于其他兩組分（＜0.05），這與脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化趨勢(shì)一致。在相同劑量濃度下，香菇多糖抑瘤率為23.31%，根據(jù)中草藥抗腫瘤有效性的標(biāo)準(zhǔn)（抑瘤率＞30%），說明PFSP-2具有較好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

圖5 PFSP對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)及抑瘤率的影響Fig. 5 Effect of PFSP on immune organ indexes and tumor inhibition in mice

PFSP-2組免疫器官指數(shù)及抑瘤率均高于其他多糖組分，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討PFSP-2對(duì)H荷瘤小鼠免疫細(xì)胞因子和腫瘤細(xì)胞的影響。

2.6 PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

細(xì)胞因子來源廣泛，主要由造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等途徑產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，在不影響其他正常細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的情況下，可殺傷腫瘤細(xì)胞。

2.6.1 PFSP-2對(duì)IL-2質(zhì)量濃度的影響

如圖6所示，隨著PFSP-2劑量的增加，IL-2質(zhì)量濃度逐漸上升，具有正向調(diào)節(jié)作用。模型組IL-2質(zhì)量濃度顯著低于正常組（＜0.05），說明模型組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，證明荷瘤小鼠建模成功。PFSP-2高劑量組IL-2質(zhì)量濃度達(dá)到133.75 pg/mL，顯著高于模型組（＜0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組（質(zhì)量濃度141.53 pg/mL）和正常組（質(zhì)量濃度159.27 pg/mL）差異不顯著（＞0.05），說明高劑量PFSP-2增強(qiáng)了免疫因子的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)是由于IL-2調(diào)節(jié)了T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，使機(jī)體免疫系統(tǒng)的保護(hù)能力增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到了抑制效果。

圖6 不同劑量PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum IL-2 concentration in tumor bearing mice

2.6.2 PFSP-2對(duì)TNF-α質(zhì)量濃度的影響

如圖7所示，隨著PFSP-2劑量的增加，TNF-α質(zhì)量濃度逐漸上升。PFSP-2低劑量、中劑量和高劑量組TNF-α質(zhì)量濃度均顯著高于模型組（質(zhì)量濃度103.77 pg/mL）（＜0.05），分別提高了53.59%、93.47%和130.74%，但顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組和正常組（＜0.05）。PFSP-2可能是通過促使TNF-α表達(dá)量升高，使腫瘤細(xì)胞的相關(guān)蛋白變性失活，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制而無法存活。TNF-α質(zhì)量濃度變化同IL-2呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，是由于TNF-α可促使巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性增強(qiáng)，進(jìn)一步使IL分泌量增加，兩者協(xié)同促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖7 不同劑量PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum TNF-α concentration in tumor bearing mice

2.6.3 PFSP-2對(duì)IL-10質(zhì)量濃度的影響

如圖8所示，隨著PFSP-2劑量的增加，IL-10質(zhì)量濃度逐漸降低，具有反向調(diào)節(jié)作用。PFSP-2低劑量、中劑量和高劑量組IL-10質(zhì)量濃度顯著低于模型組（＜0.05），且PFSP-2高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組無顯著差異（＞0.05），說明高劑量PFSP-2可大幅降低IL-10水平，與CTX治療效果相當(dāng)。各實(shí)驗(yàn)組IL-10質(zhì)量濃度顯著高于正常組（＜0.05），說明各實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，血清IL-10質(zhì)量濃度升高，陽(yáng)性對(duì)照組和高劑量組IL-10質(zhì)量濃度上升較慢，說明腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少。由此可知，當(dāng)免疫系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)，IL-10質(zhì)量濃度升高，以減輕外來異物對(duì)機(jī)體造成的損傷。IL-10可使巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力受到抑制，抑制TNF-α的產(chǎn)生，IL-10質(zhì)量濃度與本研究TNF-α變化趨勢(shì)相反，這與Zhang Shaopeng等的研究結(jié)論一致。

圖8 不同劑量PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清中IL-10質(zhì)量濃度的影響Fig. 8 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum IL-10 concentration in tumor bearing mice

2.7 PFSP-2對(duì)LDH、ALD質(zhì)量濃度的影響

如圖9所示，隨著PFSP-2劑量的增加，LDH和ALD的質(zhì)量濃度逐漸降低，具有反向調(diào)節(jié)作用。與模型組相比，PFSP-2各劑量組LDH及ALD質(zhì)量濃度均顯著降低（＜0.05），LDH質(zhì)量濃度分別降低了21.96%、31.57%和41.91%，ALD質(zhì)量濃度分別降低了17.84%、29.39%和43.96%。小鼠經(jīng)接種腫瘤細(xì)胞懸液造模成功后，模型組LDH、ALD質(zhì)量濃度顯著升高，陽(yáng)性對(duì)照組LDH、ALD質(zhì)量濃度顯著低于模型組（＜0.05），說明CTX可降低腫瘤細(xì)胞的損傷作用，各劑量PFSP-2也具有降低LDH、ALD質(zhì)量濃度的作用，但與陽(yáng)性對(duì)照組相比，效果差異顯著（＜0.05）。

圖9 不同濃度PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠血清中LDH（A）和ALD（B）質(zhì)量濃度的影響Fig. 9 Effect of PFSP-2 at different concentrations on LDH (A) and ALD (B) concentrations in tumor bearing mice

2.8 PFSP-2對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

由圖10A、B可知，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組及PFSP-2低、中、高劑量組Bax相對(duì)表達(dá)量依次為0.03、0.45、0.04、0.08和0.23，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量依次為1.26、0.26、0.71、0.55和0.36。與模型組相比，PFSP-2中劑量組和高劑量組Bax相對(duì)表達(dá)量顯著提高（＜0.05），而PFSP-2低劑量、中劑量組和高劑量組Bcl-2相對(duì)表達(dá)量顯著降低（＜0.05），由此說明，PFSP-2可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，即PFSP-2可增大腫瘤細(xì)胞中Bax/Bcl-2比例，比例的增大表示對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用增大。蛋白免疫印跡分析結(jié)果表明（圖10C），PFSP-2各劑量組腫瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白條帶灰度逐漸變淺，說明Bcl-2表達(dá)量逐漸減少，而Bax相對(duì)表達(dá)量變化與Bcl-2相反。

圖10 不同濃度PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞蛋白Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 10 Effect of PFSP-2 at different concentrations on the relative expression levels of Bax and Bcl-2 in tumor cells

2.9 PFSP-2對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)的影響

各組小鼠腫瘤組織細(xì)胞切片結(jié)果如圖11所示，經(jīng)HE染色后腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)色和粉紅色。模型組腫瘤細(xì)胞形態(tài)比較整齊、結(jié)構(gòu)清晰，腫瘤細(xì)胞異型性強(qiáng)，多見分裂相；陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮變小和染色加深等類似凋亡的特征，可見多處發(fā)生細(xì)胞壞死現(xiàn)象；隨著PFSP-2劑量增加，腫瘤細(xì)胞逐漸疏松并膨大，直至破裂死亡，細(xì)胞質(zhì)溶出，并伴有空泡產(chǎn)生。同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)，PFSP-2組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象與陽(yáng)性對(duì)照組不同，這可能是由于兩種不同作用機(jī)制所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。綜上，可推測(cè)PFSP-2可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生破裂死亡。

圖11 H22荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)（400×）Fig. 11 Histomorphological results of tumor tissues in H22 tumorbearing mice (400 ×)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從紫蘇粕中提取粗多糖，經(jīng)DEAE-52纖維素和葡聚糖G-100柱層析分離純化后得到3 個(gè)組分，分別為中性多糖PFSP-1、酸性多糖PFSP-2和PFSP-3，這3 種多糖組分相對(duì)分子質(zhì)量分別約為1.06×10、5.96×10、3.72×10。單糖組成分析得出，3 種多糖為多種不同單糖構(gòu)成的雜多糖。傅里葉變換紅外光譜表明，3 種多糖均具有多糖的特征性吸收峰，且推斷出3 種多糖可能均屬于吡喃環(huán)型多糖。免疫器官指數(shù)及抑瘤率結(jié)果表明，3 種多糖均可使模型小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)提高，PFSP-2提升幅度明顯，且抑瘤率顯著高于PFSP-1和PFSP-3。各劑量PFSP-2均可使荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），IL-10質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），且變化趨勢(shì)均呈劑量依賴性，說明PFSP-2能提高IL-2對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激，起到預(yù)防和控制癌細(xì)胞增殖的作用；PFSP-2能促使T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致TNF-α質(zhì)量濃度升高；PFSP-2可通過抑制IL-10質(zhì)量濃度升高，減輕單核巨噬細(xì)胞的特異性免疫功能受損。荷瘤小鼠血清LDH、ALD質(zhì)量濃度隨PFSP-2劑量的升高而降低，說明PFSP-2可減輕腫瘤細(xì)胞的損傷，進(jìn)而減少正常細(xì)胞破裂的發(fā)生。PFSP-2可下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)且上調(diào)Bax蛋白表達(dá)。腫瘤組織切片細(xì)胞形態(tài)表明，PFSP-2使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生膨大破裂導(dǎo)致凋亡，與CTX相比顯示出不同的抑瘤機(jī)制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PFSP-2具有較好的抑瘤效果，推測(cè)可能是由于PFSP-2可更好地激活或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，并通過免疫機(jī)制致使腫瘤細(xì)胞凋亡。PFSP有望開發(fā)為新型抗腫瘤藥物佐劑。