孫皓月，李文剛，俞世康，伍德洋，陳漢發(fā)，楊潔，宋朝鵬，賈宏昉，謝良文*

農(nóng)藝與調(diào)制

上部葉脂質(zhì)代謝與煙葉褐變的關(guān)系研究

孫皓月1，李文剛2，俞世康3，伍德洋4，陳漢發(fā)4，楊潔3，宋朝鵬1，賈宏昉1，謝良文2*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450000；2 四川省煙草公司，四川成都 610000；3 四川省煙草公司廣元市公司，四川廣元 628000；4 四川省煙草公司涼山州公司，四川西昌 615000

【目的】為明確烤煙上部葉脂質(zhì)代謝對煙葉褐變的影響?！痉椒ā恳栽茻?7和中川208兩個品種的上部葉為試驗材料，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、透射電鏡、掃描電鏡和熒光實時定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)從細(xì)胞生物學(xué)和分子層面對脂質(zhì)氧化與上部煙葉的褐變關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的研究?！窘Y(jié)果】（1）相比云煙87，易褐變的中川208上部葉褐變速度更快，且葉片達(dá)五成的褐變時間更短，褐變反應(yīng)更劇烈；進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組GO分析和KEGG富集分析結(jié)果顯示中川208上部葉差異基因在脂類代謝（亞麻酸和亞油酸代謝）富集較多，表明脂質(zhì)代謝與上部葉煙葉褐變密切相關(guān)。（2）對比云煙87，中川208上部葉成熟期角質(zhì)層厚度明顯增加，蠟質(zhì)層破碎薄片明顯增多，總脂肪酸含量、亞麻酸含量及脂氧合酶（LOX）酶活顯著高于云煙87，表明中川208上部葉脂類代謝較旺盛，易發(fā)生脂質(zhì)氧化。（3）qRT-PCR結(jié)果表明中川208上部葉中脂類代謝途徑關(guān)鍵基因、、、等的表達(dá)量顯著高于云煙87，其中脂質(zhì)氧化關(guān)鍵基因表達(dá)量上調(diào)2.27倍【結(jié)論】相比云煙87上部煙葉，中川208上部葉褐變反應(yīng)更劇烈，煙葉中的脂肪酸代謝更旺盛，脂類物質(zhì)更易發(fā)生氧化反應(yīng)，表明脂肪酸代謝引起的脂質(zhì)氧化是中川208上部煙葉易褐變的一個重要因素。

上部葉；脂質(zhì)代謝；褐變；轉(zhuǎn)錄組學(xué)

上部煙葉因其致密的組織結(jié)構(gòu)、豐富的物質(zhì)積累，有助于提高卷煙產(chǎn)品的煙氣濃度和豐富煙香[1]，但在實際生產(chǎn)中也常見掛灰、雜色等問題。煙葉香氣成分的形成與褐變反應(yīng)密切相關(guān)，而另一方面煙葉褐變程度的加大也制約著煙葉商品等級與可用性。近年來，對烤煙褐變問題的研究多集中于多酚氧化酶及多酚類引起的酶促褐變反應(yīng)，通過平衡施肥、改進(jìn)采烤方式、噴施生長調(diào)節(jié)劑等方法顯著減輕上部葉褐變情況[2-4]。在果蔬作物方面，有研究認(rèn)為褐變的發(fā)生與脂質(zhì)代謝有著密切的聯(lián)系，低溫脅迫下不飽和脂肪酸含量變化和脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致馬鈴薯褐變度降低[5]；去除蠟質(zhì)脂質(zhì)的果實褐斑病發(fā)病率降低[6]；延緩雙孢蘑菇的脂質(zhì)過氧化進(jìn)程可降低其褐變指數(shù)[7]，這些研究都表明果蔬類的脂質(zhì)代謝和氧化是影響改變褐變進(jìn)程的重要因素之一。云煙87煙葉作為主栽品種易考性耐烤性好，對比中川208烤后煙葉雜色比例較少[8-9]。為了明確脂質(zhì)氧化是否參與煙葉的褐變過程，本研究選擇烤煙品種云煙87和易褐變的中川208上部葉為適供材料，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為切入點，利用掃描電鏡、透射電鏡和qRT-PCR技術(shù)從細(xì)胞生物學(xué)和分子層面對脂質(zhì)代謝與上部煙葉的褐變關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，對改善上部葉烘烤技術(shù)、提高上部葉的烘烤質(zhì)量、降低煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)損失、減少煙葉資源的浪費有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021年在廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)基地開展，供試烤煙品種為云煙87和易褐變的中川208，選取上部葉16～20葉位為供試材料。

1.2 試驗設(shè)計

選擇地勢平坦、排水條件良好的地塊，行株距為1.20 m×0.5 m，以當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)方式，進(jìn)行施肥和中耕管理。中部葉完全采摘后，采取長勢大小一致、健康無病害的上部葉，每個品種各選取10片煙葉立即運往實驗室，采用半葉法將煙葉一分為二并去除主脈，一半葉片4℃保存用于超微結(jié)構(gòu)觀察，一半葉片放入液氮內(nèi)速凍后置于-80℃冰柜儲存用于酶活性與轉(zhuǎn)錄組測定，其余葉片用于觀察采后顏色變化，每個處理3次重復(fù)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 采后顏色變化測定

每品種選取5片用于采后顏色變化的測定，參考《YC/T 311—2009烤煙品種烘烤特性評價》[10]的方法，將采收煙葉懸掛放置于保持黑暗環(huán)境的室溫中，從煙葉采收完成時每隔24 h進(jìn)行褐變比例統(tǒng)計，測定變褐程度、變褐速度。

1.3.2 超微結(jié)構(gòu)分析測定

參考鄭小雨的方法[11]，選取葉片第5到第7支脈之間右側(cè)相同的位置，用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm的小塊，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制）中固定。透射電鏡觀察角質(zhì)層：用1%鋨酸（pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS緩沖液配制）固定，經(jīng)純丙酮脫水后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋聚合。用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片機（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）切出超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，再用JEM-1400Plus型透射電鏡（日本電子）進(jìn)行觀察并拍照，每個處理觀察10個視野。掃描電鏡觀察表皮蠟質(zhì)：置于4℃冰箱固定，隨后進(jìn)行反復(fù)脫水清洗干燥，置于日立S-3000掃描電鏡下觀察拍照，每個處理10個視野。用軟件Photoshop 2020進(jìn)行標(biāo)注處理。

1.3.3 煙草葉片RNA提取及測序

提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化成雙鏈cDNA；將純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；通過構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina平臺進(jìn)行上機測序，由上海歐易生物有限公司完成。

1.3.4 差異表達(dá)基因的注釋及分析

由Illumina測序所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控（QC），以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。通過比較不同樣本間數(shù)據(jù)，依據(jù)DESeq進(jìn)行差異基因分析，并使用nbinom Test函數(shù)計算差異比較的值和Fold Change值。以Fold Change≥2且<0.05為條件篩選DEGs。選取差異基因數(shù)目大于2的GO條目，利用超幾何分布檢驗計算差異編碼基因列表中富集值，再對值經(jīng)多重檢驗糾正后得到q值，進(jìn)而判斷差異基因在該GO中出現(xiàn)富集的情況，對其功能進(jìn)行描述，闡明差異在基因功能上的體現(xiàn)。利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異蛋白編碼基因進(jìn)行 Pathway 分析（結(jié)合 KEGG 注釋結(jié)果），并用超幾何分布檢驗的方法計算每個 Pathway 條目中差異基因富集的顯著性。

1.3.5 差異基因qRT-PCR分析

按照Invitrogen公司的Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行熒光實時定量qRT-PCR。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選出有差異的脂類代謝基因：實時定量的實驗數(shù)據(jù)以煙草組成型表達(dá)基因（GenBank: L18908.1）為內(nèi)參基因，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析。假設(shè)目的基因在脅迫處理下的表達(dá)量是對照（正常培養(yǎng)）的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt = Treat(Ct樣品-CtL25)-CK(Ct樣品-CtL25)。

表1 煙葉脂類代謝相關(guān)基因的定量PCR引物序列

Tab.1 Quantitative PCR primer sequences of tobacco leaf lipid metabolism-related genes

1.3.6 LOX活性的測定

脂氧合酶（LOX）活性按照北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的酶活試劑盒按照說明書方法進(jìn)行測定。

1.3.7 脂肪酸含量測定

脂肪酸等成分檢測方法采用下列標(biāo)準(zhǔn)：《YC/T288—2009煙草及煙草制品多元酸(草酸、蘋果酸和檸檬酸)的測定氣相色譜法》[12]。

1.3.8 統(tǒng)計分析

使用檢驗比較兩個樣本組，結(jié)果用平均值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。圖片使用Origin 2018軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后煙葉顏色變化

由圖1A可知，中川208上部葉在65 h時開始褐變，148 h時達(dá)五成褐變，168 h時達(dá)到八成褐變，云煙87上部葉73 h啟動褐變，在152 h褐變至五成，在168 h達(dá)到八成褐，說明中川208上部葉的褐變速度快于云煙87上部葉。由圖1B可知，中川208上部葉的褐變啟動時間顯著早于云煙87上部葉，褐變至五成、八成時間均極顯著早于云煙87，說明中川208上部葉褐變反應(yīng)劇烈程度較高。

注: *和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著，下同。

2.2 煙葉轉(zhuǎn)錄組差異基因分析

煙葉轉(zhuǎn)錄組基因顯著性差異表達(dá)情況結(jié)果如圖2A所示，中川208對比云煙87上部葉共有2453個差異表達(dá)基因（DEGs），包括1005個上調(diào)基因和1448個下調(diào)基因。差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果表明（圖2B），差異表達(dá)基因主要富集在17個生物過程、9個細(xì)胞組成、7個分子功能方面，其中生物過程主要富集在防御反應(yīng)，甘油、鞘脂類代謝，極長鏈脂肪酸、脂肪酶生物合成過程等；細(xì)胞組成主要富集在等離子體膜、核、核小體等；分子功能主要富集在酚氧化酶活性、甘油三酯脂肪酶活性、催化活性等。KEGG富集結(jié)果分析表明（圖2C），差異表達(dá)基因被注釋到202個通路中。其中主要富集通路（<0.05）參與碳氮代謝中的氨基酸（苯丙氨酸代謝和精氨酸、脯氨酸代謝）和糖代謝（氨基糖和核苷酸糖代謝），而次生代謝主要是酚類代謝（苯丙酮類代謝和黃酮類生物合成）和脂類代謝（亞麻酸和亞油酸代謝）等。

2.3 煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

由圖3所示，中川208上部葉角質(zhì)層較厚，達(dá)7.138 μm，是云煙87上部葉的1.6倍。煙葉成熟期蠟質(zhì)層呈破碎菱形晶體狀，中川208上部葉蠟質(zhì)層晶體破碎薄片較多且面積較大，主要集中分布于氣孔附近，直徑3 μm以上的蠟質(zhì)顆粒達(dá)35個，高于云煙87上部葉2.3倍。說明對比云煙87上部葉，中川208煙葉角質(zhì)層更厚，蠟質(zhì)晶體含量更多，脂肪族化合物具有旺盛的生理代謝活性。

注：C:角質(zhì)層；W:細(xì)胞壁；PM:質(zhì)膜。

2.4 烤后煙葉的脂肪酸含量分析

烤后煙葉中7種脂肪酸的檢測結(jié)果如圖4A所示，肉豆蔻酸(C14:1)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20:0)、亞油酸(C18:2)、油酸和亞麻酸(C18:1、C18:3)含量均呈現(xiàn)出相同的趨勢，中川208上部葉總脂肪酸含量顯著高于云煙87上部葉，達(dá)到了1.13倍。其中，中川208上部葉亞油酸含量為3.03 mg/g，是云煙87上部葉的1.2倍，達(dá)到極顯著差異，中川208上部葉肉豆蔻酸、油酸與亞麻酸分別顯著增加了0.06 mg/g和0.16 mg/g。

由圖4B可知，中川208上部鮮煙葉LOX酶活性顯著高于云煙87上部葉，酶活增加了62.68%，說明中川208上部葉在一定程度上飽和與不飽和脂肪酸的積累較多，脂質(zhì)降解氧化能力更強。

圖4 烤后煙葉脂肪酸含量分析（A）與鮮煙LOX酶活性（B）

2.5 煙葉中脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)

煙葉脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵基因的檢測結(jié)果如圖5所示，與云煙87上部葉相比，中川208上部煙葉中、、、、等基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組脂類代謝差異基因測定結(jié)果相一致，尤其是和基因，分別上調(diào)7.83和2.27倍，達(dá)到極顯著差異。

圖5 脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因

3 討論

云煙87與中川208的煙葉褐變差異基因富集在15個通路中，其中酚類代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、糖代謝等通路可能是造成兩品種褐變差異的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)煙葉褐變下脂肪酸代謝途徑相關(guān)差異基因的表達(dá)變化與影響蝴蝶蘭、茄子、蘋果等褐變的調(diào)控基因表達(dá)結(jié)果相類似[13-15]。也與茶樹新梢組培褐變后研究發(fā)現(xiàn)通過滲透調(diào)節(jié)次生代謝物質(zhì)、激素調(diào)節(jié)和角質(zhì)蠟質(zhì)保護(hù)來抵御脅迫逆境[16]的結(jié)果相吻合。

酚類、黃酮類是植物果蔬酶促褐變的重要底物，當(dāng)細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞時，酚類物質(zhì)、類黃酮的氧化迅速轉(zhuǎn)變成大量醌，最終導(dǎo)致褐變[17-18]，這是目前經(jīng)典的褐變機制。除了酚類物質(zhì)，糖苷類、脂質(zhì)類也可能是褐變的底物，但是相關(guān)研究較少。脂質(zhì)代謝途徑的關(guān)鍵酶被發(fā)現(xiàn)參與果蔬褐變，如ATP參與脂質(zhì)的合成與脂肪酸的去飽和作用，影響膜的生理功能和理化性能[19-21]，導(dǎo)致膜脂過氧化作用加劇，細(xì)胞間分割作用打破導(dǎo)致酶和底物結(jié)合，最終產(chǎn)生褐變[22-23]。本研究以不同品種煙葉為研究材料，結(jié)果顯示與云煙87相比，更易發(fā)生褐變的中川208上部葉中脂類代謝差異顯著，表明脂質(zhì)代謝在中川208上部煙葉褐變過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這與前人在其它果蔬上的研究相一致。

煙葉角質(zhì)層主要由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成。角質(zhì)是一種由甘油、羥基脂肪酸及環(huán)氧脂肪酸組成的聚酯聚合物。蠟質(zhì)沉積在表皮細(xì)胞最外層形成蠟質(zhì)晶體，主要由脂肪族化合物（烷烴、脂肪酸、初級醇、醛）組成[24]，大量研究表明植物脂肪酸代謝（脂質(zhì)氧化）與蠟質(zhì)層形成密切相關(guān)，蠟質(zhì)層可以作為研究脂肪酸代謝的一個參考指標(biāo)[25-26]。目前關(guān)于煙葉蠟質(zhì)形成的生理生化和分子機制研究還未見詳細(xì)報道。本研究發(fā)現(xiàn)中川208上部葉角質(zhì)蠟質(zhì)層明顯增厚，同時在煙葉表面發(fā)現(xiàn)大量已經(jīng)坍塌破碎的蠟質(zhì)晶體，煙葉中脂肪酸含量顯著提高。LOX是參與煙葉生長過程中脂質(zhì)代謝途徑的關(guān)鍵酶[27]，LOX通過誘導(dǎo)不飽和脂肪酸中亞麻酸和亞油酸的氧化從而影響葉片的脂質(zhì)氧化進(jìn)程，中川208易褐變鮮煙葉中LOX活性顯著增加，不飽和脂肪酸氧化更劇烈，增加了不飽和脂肪酸油酸、亞麻酸、亞油酸以及飽和脂肪酸肉豆蔻酸、硬脂酸和花生酸相對含量的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)中川208上部葉脂質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵基因、、、基因表達(dá)量顯著提高。細(xì)胞色素P450中鏈羥化酶（CYP）家族成員，與角質(zhì)生物合成中羥基化密切相關(guān)[28]。ALDHs是一個超家族蛋白，它依賴于NAD（P），能氧化許多內(nèi)源依賴性酶、脂肪族和芳香族醛，生成羧 酸[29]。其中脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LTPs）被證明很可能有助于角質(zhì)單體通過細(xì)胞壁向角質(zhì)層的轉(zhuǎn)運[30]，中川208上部葉基因表達(dá)量與云煙87相比，增加了7.83倍，表明該基因在蠟質(zhì)層形成過程中起關(guān)鍵作用，這中川208上部葉表皮蠟質(zhì)積累量大相一致；脂氧合酶基因家族（LOXs）參與調(diào)控脂氧合酶的活性和功能，在調(diào)控脂質(zhì)氧化過程中發(fā)揮重要作用[31]，中川208上部葉基因的表達(dá)量增加了2.27倍，與LOX酶活增加結(jié)果相一致。類基因參與蠟質(zhì)的生物合成與轉(zhuǎn)錄，對蠟質(zhì)合成途徑中信號傳導(dǎo)與調(diào)控起十分重要的作用[32]，等上游調(diào)控因子表達(dá)量在兩個品種中也具有顯著差異，暗示MYB家族基因在兩個品種的脂肪酸代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上，本研究初步從轉(zhuǎn)錄組、細(xì)胞生物學(xué)、物質(zhì)代謝和分子層面系統(tǒng)深入分析了云煙87和中川208在上部葉脂質(zhì)氧化與煙葉褐變中的差異，為證明脂質(zhì)氧化參與煙葉褐變提供了理論依據(jù)。雖然本研究初步證實了脂質(zhì)氧化影響煙葉的褐變，但是在分子水平上的證據(jù)仍不充分，后期將通過目的基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步明確脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因在調(diào)控?zé)熑~褐變過程中的功能。

4 結(jié)論

與云煙87相比，易褐變的中川208上部葉脂質(zhì)代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)，脂肪酸代謝旺盛，角質(zhì)層（包含蠟質(zhì)層）增厚，煙葉表面蠟質(zhì)積累量大。中川208上部葉較多的脂肪酸底物和較高的LOX酶活性是其煙葉發(fā)生脂質(zhì)氧化產(chǎn)生褐變的一個重要因素。

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Study on the relationship between lipid metabolism and browning of upper tobacco leaves

SUN Haoyue1, LI Wengang2, YU Shikang3, WU Deyang4, CHEN Hanfa4, YANG Jie3, SONG Zhaopeng1, JIA Hongfang1, XIE Liangwen2*

1 College of Tobacco, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China;2 Sichuan Tobacco Company, Chengdu 610000, China;3 Guangyuan Tobacco Company of Sichuan Province, Guangyuan 628000, Sichuan, China;4 Liangshan Tobacco Company of Sichuan Province, Xichang 615000, China

[Background and Objective]This study aims to clarify the effects of lipid metabolism in upper leaves of flue-cured tobacco on leaf browning.In this study, the relationship between lipid oxidation and Browning of the upper leaves of Yunyan 87 and Zhongchuan 208 were systematically studied by means of transcriptomics, transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and real-time quantitative PCR(RT-PCR) in cell biology and molecular level.(1) Compared with Yunyan 87 tobacco leaves, Zhongchuan 208 tobacco leaves were browning faster, and the time for leaves to become 50% brown was shorter, and the browning reaction was more intense; Further transcriptomic GO analysis and KEGG enrichment analysis showed that the differential genes in the upper leaves of Zhongchuan 208 were enriched in lipid metabolism (linolenic acid and linoleic acid metabolism), suggesting that lipid metabolism was closely related to the browning of the upper leaves. (2)The cuticle was significantly thickened, the broken wax layer and thin slices were obviously increased in Zhongchuan 208 tobacco leaves. The total fatty acid content, linolenic acid content, and lipoxygenase (LOX) enzyme activity were significantly higher than those of the control, indicating that the lipid metabolism of easy-browning tobacco leaves is relatively vigorous and lipid oxidation is prone to occur. (3) The lipid metabolism genes,,,were screened out from the obtained differentially expressed genes, the expression of which were up-regulated in Zhongchuan 208 tobacco leaves according to qRT-PCR analysis. Among them, the expression ofa key gene of lipid oxidation, was up-regulated by 2.27 times.Compared with the upper leaves of Yunyan 87, the browning reaction of the upper leaves of Zhongchuan 208 is more intense, and the fatty acid metabolism in the tobacco leaves is more vigorous and the lipids are more susceptible to oxidation reactions. The results indicate that lipid oxidation caused by fatty acid metabolism is an important factor for the browning of Zhongchuan 208 tobacco leaves.

upper tobacco leaves; lipid metabolism; browning; transcriptomics

四川省煙草公司科技重點項目“提升上部葉烘烤質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（NO：SCYC202116）

孫皓月（1998—），碩士研究生，主要研究方向：煙草調(diào)制與加工，Email：sally_sun.zz@foxmail.com

謝良文（1979—），高級農(nóng)藝師，主要從事技術(shù)管理與煙葉生產(chǎn)技術(shù)方面研究，Email：652814038@qq.

20021-12-15；

2022-04-07

Corresponding author. Email：652814038@qq.com

孫皓月，李文剛，俞世康，等. 上部葉脂質(zhì)代謝與煙葉褐變的關(guān)系研究[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（4）. SUN Haoyue, LI Wengang, YU Shikang, et al. Study on the relationship between lipid metabolism and browning of upper tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.T0232