徐夢(mèng)曉，楊永鋒，段史江，譚志能，賈世偉，李小勇，張子穎，彭玉富，王佩，陳小龍*

烤煙不同成熟度上部葉中抗性淀粉與淀粉組分的變化及其與基因表達(dá)的關(guān)系

徐夢(mèng)曉1，楊永鋒2，段史江3，譚志能3，賈世偉2，李小勇3，張子穎2，彭玉富2，王佩1，陳小龍2*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 45000 2；2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南鄭州 450016；3 江西省煙草公司吉安市公司，江西吉安 343009

【目的】為研究烤煙上部葉在成熟后期及烘烤過程中淀粉組分和抗性淀粉含量的變化?！痉椒ā恳钥緹熎贩N云煙87上部葉為試驗(yàn)材料，分析不同成熟度鮮煙葉及其在烘烤過程中淀粉組分和抗性淀粉含量的變化，闡明抗性淀粉和淀粉組分的相關(guān)性，通過實(shí)時(shí)定量PCR探究不同成熟度煙葉中淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】（1）隨煙葉不斷成熟，淀粉粒數(shù)量迅速變多、體積增大，煙葉變黃時(shí)，葉綠體開始解體，淀粉粒逐漸降解。（2）不同成熟度鮮煙葉中直鏈淀粉含量與支鏈淀粉含量：欠熟>適熟>過熟，而抗性淀粉含量差異不大；在煙葉衰老過程中，支鏈淀粉迅速降解，而直鏈淀粉和抗性淀粉緩慢降解。（3）在烘烤過程中，淀粉降解主要集中在變黃期。烘烤結(jié)束后，烤煙中未降解的淀粉約50%為抗性淀粉。（4）淀粉合成基因葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶小亞基3（）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶大亞基（）、顆粒結(jié)合型淀粉合酶（）可溶性淀粉合酶2（）1,4-a-葡聚糖分支酶（）2,3淀粉分支酶2（）和異淀粉酶2（）在欠熟煙葉中的基因表達(dá)水平較高，隨煙葉衰老表達(dá)水平下調(diào)，而異淀粉酶3（）的基因表達(dá)水平在煙葉衰老過程中持續(xù)上調(diào)。【結(jié)論】烤煙不同成熟度上部葉中存在抗性淀粉，烘烤過程的變黃期是煙葉內(nèi)淀粉降解的主要時(shí)期，但大田期形成的抗性淀粉很難在烘烤過程中充分降解。因此，可以通過適當(dāng)推遲煙葉采收，降低烤煙淀粉含量，從而提高上部葉可用性。

烤煙；抗性淀粉；直鏈淀粉；支鏈淀粉；基因表達(dá)

淀粉是煙葉中碳水化合物貯藏的主要形式，在成熟鮮煙葉中含量高達(dá)40%[1-3]，經(jīng)調(diào)制和發(fā)酵可產(chǎn)生多種致香前體物[4]。較高的淀粉含量對(duì)煙葉的色香味都極為不利，影響卷煙香氣質(zhì)及吸味口感[5]，國(guó)外優(yōu)質(zhì)烤煙淀粉含量約為1%～2%，而我國(guó)烤煙調(diào)制后的淀粉含量普遍為4%～6%[6]。烘烤過程中外加淀粉類酶能有效將煙葉中淀粉轉(zhuǎn)化為水溶性糖[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉的降解主要取決于直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例，直鏈淀粉含量高的淀粉可能具備抗酶解性[10]。Englyst等提出部分不能被淀粉酶水解的淀粉即為抗性淀粉[11]。天然抗性淀粉顆粒是植物體內(nèi)自然合成的，回生抗性淀粉由直鏈淀粉老化結(jié)晶形成[12]，區(qū)別在于抗性淀粉的來源和酶解機(jī)制不同。影響抗性淀粉含量的因素包括植物來源、產(chǎn)地及種植環(huán)境、基因類型、直鏈淀粉/支鏈淀粉比例、直鏈淀粉鏈長(zhǎng)、淀粉分子聚合度、淀粉顆粒的大小以及處理方式等[13]。其他作物中關(guān)于抗性淀粉的研究表明，直鏈淀粉經(jīng)濕熱處理后會(huì)回生老化形成抗性淀粉[14-16]，且隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性淀粉回生速率加快[17]。潘飛龍等研究發(fā)現(xiàn)，ADPG焦磷酸化酶（AGPase）和GBSS是影響直鏈淀粉積累的關(guān)鍵酶，而可溶性淀粉合成酶（SSS）和淀粉分支酶（SBE）是影響支鏈淀粉積累的關(guān)鍵酶[18]。Parween等研究表明，，和異淀粉酶（）基因與抗性淀粉的形成有關(guān)[19]。目前研究大多集中于制備谷物抗性淀粉，但煙葉中抗性淀粉的研究尚未報(bào)道。

本研究主要圍繞煙葉中是否存在抗性淀粉，以及淀粉組分與抗性淀粉的關(guān)系兩個(gè)問題，比較分析不同成熟度上部葉鮮煙葉及其在烘烤過程中淀粉組分和抗性淀粉含量的變化，分析淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)量，為降低上部煙葉中的淀粉含量、提高上部葉可用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年在江西省吉安市永豐縣沿陂村進(jìn)行，供試烤煙品種為云煙87，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行田間管理。煙株統(tǒng)一摘除3片腳葉，留葉數(shù)20片。5月7日煙葉打頂后每隔10 d取一次樣，共6次，分別用于超微結(jié)構(gòu)觀察和淀粉含量測(cè)定。設(shè)置3個(gè)成熟度處理，根據(jù)煙葉成熟度標(biāo)準(zhǔn)[20]對(duì)上部煙葉進(jìn)行不同成熟度的采收：欠熟（打頂后20 d）為葉色7～8成黃、主脈1/2變白；適熟（打頂后30 d）為葉色黃色鮮亮、葉面8～9成變黃、主脈2/3變白、葉尖葉緣枯、葉耳微黃、茸毛部分脫落；過熟（打頂后40 d）為葉色9～10成黃、主脈和支脈全白、葉耳淡黃、茸毛大部分脫落。煙葉采收后按三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤。烘烤過程中每24 h取一次樣（包括烘烤0 h），共7次。煙葉殺青烘干后去除主脈充分研磨，過100目篩，進(jìn)行淀粉組分和抗性淀粉的測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 超微結(jié)構(gòu)觀察

選取上部葉第17葉位，在葉片右側(cè)的第7和第8支脈之間，距離主脈3～5 cm處切取1 cm×0.5 cm葉肉組織，采用2.5%戊二醛溶液進(jìn)行固定，室溫放置30 min后于4℃冰箱內(nèi)保存。采用HT7700透射電鏡觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)[21]。

1.2.2 淀粉含量測(cè)定

在欠熟、適熟、過熟三個(gè)時(shí)期各選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3棵煙株，每株選取上部葉第16～18葉位各1片。煙葉殺青烘干后去除主脈充分研磨，過100目篩，進(jìn)行淀粉組分和抗性淀粉的測(cè)定。

稱取1.0 g樣品放于濾紙包，將濾紙包移入索氏抽提器提取管中，提取器中加入石油醚，于45℃水浴中回流萃取6 h（回流速度100～150滴/min），將濾紙包取出60℃烘干。將石油醚換作丙酮，于60℃水浴中繼續(xù)加熱回流約5 h，結(jié)束后取出濾紙包烘干。將濾紙包放入80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，超聲萃取20 min，重復(fù)超聲步驟至上清無色，烘干樣品用于淀粉組分（直鏈淀粉和支鏈淀粉）和抗性淀粉的測(cè)定。

采用雙波比色法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量[22]。稱取0.1 g淀粉樣品，溶解于10 mL 0.5 mol/L KOH溶液中，定容至50 mL。取上述溶液5 mL，加入蒸餾水30 mL，調(diào)節(jié)pH至3.0，加0.5 mL碘試劑，定容至50 mL，靜置反應(yīng)15 min后比色。測(cè)定512 nm 和596 nm處的吸光值計(jì)算直鏈淀粉的含量。測(cè)定560 nm 和695 nm處的吸光值計(jì)算支鏈淀粉的含量。

采用酶消化法（抗性淀粉檢測(cè)試劑盒，Megazyme）測(cè)定抗性淀粉的含量[23]。取1.0 g烘干樣品加入15 mL離心管中，加入胰腺a-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶（AMG），非抗性淀粉被水解為D-葡萄糖，沉淀即為抗性淀粉。加入等體積的乙醇終止反應(yīng)，收集抗性淀粉，用2 mol/L KOH溶解抗性淀粉，磁力攪拌溶解后調(diào)至溶液pH至7.0，加入AMG水解抗性淀粉為D-葡萄糖（G），最后用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測(cè)定抗性淀粉含量。抗性淀粉含量=G×(10.3/0.1)×0.9×100%。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析

在欠熟、適熟、過熟3個(gè)時(shí)期各選擇3株煙的第17葉位，撕取第7和第8支脈之間的葉片組織，用于淀粉合成基因的表達(dá)量分析。采用Trizol法提取煙葉總RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行cDNA合成。使用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)在Genbank發(fā)布（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的普通煙草淀粉合成相關(guān)基因、、、、、、、、、、、和的序列，在基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物（表1）。按照LightCycler?480 SYBR Green I Master試劑盒（羅氏）的操作說明配制反應(yīng)體系，在熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。以作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt公式計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[24]，基因表達(dá)量最低的處理（過熟煙葉，）設(shè)定為對(duì)照，其他處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)量為對(duì)照的N倍。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物

Tab.1 Primer sequence in qRT-PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟期上部煙葉中葉綠體形態(tài)變化

利用透射電鏡觀察打頂后上部煙葉中葉綠體的形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)（圖1），隨葉片不斷成熟，淀粉粒數(shù)目迅速增加、體積增大，煙葉成熟后期淀粉粒開始降解。成熟前期（打頂當(dāng)天及打頂10 d），煙葉快速生長(zhǎng)，葉綠體緊貼細(xì)胞壁，類囊體結(jié)構(gòu)清晰、片層較多，整齊有序排列在葉綠體內(nèi)，葉綠體被膜上分布著一些質(zhì)體小球，淀粉粒被緊密包裹在葉綠體內(nèi)，數(shù)量少且體積小，還有新的淀粉粒正在形成；成熟中期（打頂20～30 d），煙葉基本定長(zhǎng)，葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)清晰程度下降；類囊體開始腫脹，淀粉粒數(shù)目和體積增至最大，淀粉粒多數(shù)發(fā)育充盈，基本包裹在葉綠體內(nèi)；成熟后期（打頂40～50 d），葉綠體膜破裂，淀粉粒開始降解，大量淀粉粒游離到細(xì)胞中部。

圖1 成熟期上部煙葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較（×2500）

2.2 成熟度對(duì)上部煙葉中淀粉組分和抗性淀粉含量的影響

不同成熟度上部葉淀粉組分和抗性淀粉的含量測(cè)定結(jié)果表明（圖2），直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉在欠熟期煙葉的含量分別為12.60%、25.40%和7.20%，在適熟煙葉中分別為11.80%、19.70%和6.60%，在過熟煙葉中分別為10.20%、14.30%和6.10%?？梢婋S著煙葉衰老，煙葉中的淀粉逐步降解；欠熟煙葉的支鏈淀粉含量較高，適熟煙葉次之，過熟煙葉最低；欠熟和適熟煙葉中的直鏈淀粉和抗性淀粉含量無顯著差異，過熟煙葉中的直鏈淀粉和抗性淀粉含量顯著低于欠熟煙葉，而與適熟煙葉無顯著差異。比較不同成熟度上部葉的淀粉組分和抗性淀粉含量發(fā)現(xiàn)，煙葉中支鏈淀粉的含量較高，直鏈淀粉含量較低，欠熟煙葉直支比為0.50，適熟煙葉直支比為0.60，過熟煙葉直支比為0.71。以上結(jié)果表明，隨著煙葉衰老，支鏈淀粉迅速降解，而直鏈淀粉降解緩慢；成熟期煙葉中存在大量抗性淀粉；與支鏈淀粉相比，直鏈淀粉和抗性淀粉隨著煙葉衰老均呈現(xiàn)緩慢降解趨勢(shì)；3種成熟度上部鮮煙葉中的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量大小排序?yàn)椋哼^熟＜適熟＜欠熟。

注：圖中不同小寫字母代表處理間差異達(dá)0.05 顯著水平(<0.05)，后同。

Note: Different lowercase letters in the figure mean significant difference among treatments at 0.05 level (<0.05), the same as below.

圖2 不同成熟度上部煙葉淀粉含量的變化

Fig.2 Change of starch content in upper leaves at different mature stages

2.3 烘烤過程中不同成熟度上部煙葉的淀粉降解

烘烤過程中不同成熟度上部煙葉中的淀粉組分和抗性淀粉含量變化結(jié)果表明（表2），在烘烤過程中，欠熟、適熟和過熟煙葉中的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量均呈下降趨勢(shì)。變黃期，尤其是變黃前期和中期是淀粉降解的重要時(shí)期，其中變黃中期，適熟煙葉的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉的降解量就達(dá)到了56.44%、43.35%和42.27%，欠熟煙葉的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉的降解量達(dá)到53.78%、43.57%和23.61%，過熟煙葉的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉的降解量為47.88%、34.90%和16.07%。變黃期結(jié)束時(shí)，適熟煙葉的降解量最多，直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉的降解量分別為76.78%、69.80%和55.84%。在定色期，支鏈淀粉有少量降解，而直鏈淀粉和抗性淀粉的含量基本無變化。在干筋期，各淀粉組分和抗性淀粉含量均無變化。烘烤結(jié)束后，適熟煙葉中的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量分別為1.88%、3.75%和2.43%，欠熟煙葉中的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量分別為2.38%、5.54%和3.48%，過熟煙葉中的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量分別為2.22%、5.14%和3.15%?？梢?，3種成熟度上部烤后煙葉的直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量大小排序?yàn)椋哼m熟＜過熟＜欠熟。

表2 上部煙葉烘烤過程中淀粉組分和抗性淀粉的含量變化

Tab.2 Changes of starch component and resistant starch contents in upper leaves during flue-curing process

2.4 不同成熟度上部煙葉中淀粉合成基因的表達(dá)

不同成熟度上部煙葉中淀粉合成基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明（圖3），大部分淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)水平在煙葉衰老過程中整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而的表達(dá)趨勢(shì)相反，呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。這些淀粉合成基因的表達(dá)可分為5種模式：（1）和的表達(dá)水平整體較低，在不同成熟度煙葉中的表達(dá)水平無顯著差異，在適熟煙葉中的表達(dá)水平顯著高于過熟煙葉，而與欠熟煙葉無顯著差異；（2）、、、、和的表達(dá)水平在煙葉衰老過程逐步下調(diào)，且在不同成熟度煙葉中的表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著差異，表現(xiàn)為欠熟>適熟>過熟；（3）和的表達(dá)水平整體較高，在不同成熟度煙葉中的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著差異，在適熟煙葉中的表達(dá)水平顯著高于過熟煙葉，而與欠熟煙葉無顯著差異；（4）和在適熟煙葉中的表達(dá)量下調(diào)，在適熟煙葉中的表達(dá)水平顯著低于欠熟煙葉，而與過熟煙葉無顯著差異；（5）的基因表達(dá)水平在煙葉衰老過程呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢(shì)，且在不同成熟度煙葉中的表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著差異。整體來看，、、和在欠熟煙葉中的基因表達(dá)水平較高，隨著煙葉衰老表達(dá)量下調(diào)。

異淀粉酶屬于淀粉去分支酶，可以在淀粉合成過程中進(jìn)行支鏈淀粉分支的修飾，也可以在淀粉降解過程催化支鏈淀粉分支的酶解。異淀粉酶編碼基因的基因表達(dá)模式結(jié)果顯示，該基因可能在支鏈淀粉降解過程中起重要作用。

圖3 不同成熟度上部煙葉中淀粉合成基因的表達(dá)模式

3 討論

準(zhǔn)確把握煙葉的成熟度是提高煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，而淀粉含量和煙葉成熟度密切相關(guān)，淀粉含量下降標(biāo)志著煙葉開始成熟[25-27]。大量研究表明，隨著煙葉發(fā)育，淀粉含量逐漸增加，煙葉生理成熟時(shí)淀粉含量最高，隨后淀粉含量逐漸降低[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)云煙87上部煙葉在打頂后淀粉粒數(shù)目增多，體積增大，淀粉開始迅速累積，工藝欠熟時(shí)期，總淀粉含量高達(dá)38.00%，隨著煙葉成熟期的推進(jìn)，淀粉粒逐漸降解，總淀粉含量逐漸降低至適熟時(shí)31.50%，過熟時(shí)24.50%?？梢?，推遲煙葉成熟采收時(shí)期可以降低煙葉的淀粉含量。楊勝男等研究表明，施用復(fù)合有機(jī)肥有利于淀粉粒的累積，直鏈淀粉含量減少，淀粉組分相應(yīng)改變[2]。通過一些栽培技術(shù)手段或許可以降低直鏈淀粉的含量，從而降低淀粉含量，但仍需要進(jìn)一步研究。

烘烤過程中外加一定量的糖化酶和a-淀粉酶等淀粉類酶能有效地將煙葉中的淀粉轉(zhuǎn)化為水溶性糖[7-9]。黑豆[31]、蕎麥[13]、稻米[14]、香蕉[16]以及蠶豆[17]等作物中關(guān)于抗性淀粉形成原因的研究表明，直鏈淀粉經(jīng)過濕熱、化學(xué)改性等處理后會(huì)回生老化，形成難以被淀粉酶水解的抗性淀粉。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烘烤過程中直鏈淀粉和支鏈淀粉大量降解，抗性淀粉降解緩慢，變化不明顯；烘烤結(jié)束后，適熟煙葉的淀粉組分和抗性淀粉降解量均較多，說明適熟采收極為重要。此外在烘烤過程中防止出現(xiàn)高低溫度反復(fù)，減少直鏈淀粉老化，可能也會(huì)影響抗性淀粉的含量。

在植物淀粉合成途徑中，AGPase的作用是把來自光合作用的葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和ATP轉(zhuǎn)變成ADP葡萄糖和ADP，ADP葡萄糖在淀粉合成酶的作用下合成直鏈淀粉或支鏈淀粉。在移栽85～95 d表達(dá)量較高，之后逐漸下調(diào)。打頂至適熟，GBSSΙ調(diào)控?zé)熑~直鏈淀粉合成，SS、SBE調(diào)控?zé)熑~支鏈淀粉合成，SBE調(diào)控?zé)熑~直鏈淀粉/支鏈淀粉；進(jìn)入過熟階段，淀粉酶對(duì)煙葉淀粉代謝起主要調(diào)控作用[18]。與前人研究結(jié)果相同，本研究也發(fā)現(xiàn)淀粉合成酶AGPase、GBSS、SS和SBE的基因表達(dá)水平在煙葉衰老過程中基本呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。GBSS作為直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶，可以敲除煙草中的基因或降低基因的表達(dá)水平，進(jìn)而降低煙葉中的直鏈淀粉和抗性淀粉含量，最終實(shí)現(xiàn)淀粉在成熟和烘烤過程中充分降解的目的。支鏈淀粉的合成非常復(fù)雜，需要在SBE和ISA等的協(xié)同作用對(duì)支鏈分支進(jìn)行修飾[32-33]。值得注意的是，異淀粉酶ISA可以催化α-l, 6葡萄糖苷鍵的水解，因此其同時(shí)也參與支鏈淀粉的合成和降解過程。在擬南芥和馬鈴薯中編碼ISA有3個(gè)編碼基因，功能研究表明和主要催化支鏈淀粉的合成，而的主要功能是催化淀粉分解[34-36]。與此研究結(jié)果相似，在煙葉衰老過程中和的基因表達(dá)水平逐漸降低，而的基因表達(dá)水平呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)。通過基因表達(dá)分析結(jié)果可知，可以利用衰老啟動(dòng)子，通過生物技術(shù)手段降低高表達(dá)水平淀粉合成基因、、、、和在成熟煙葉中的表達(dá)，或提高的基因表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)降低成熟煙葉中淀粉含量的目的。本研究?jī)H分析了淀粉合成酶相關(guān)基因，還需進(jìn)一步研究淀粉酶（ɑ-淀粉酶和?-淀粉酶）在不同成熟度上部煙葉中的基因表達(dá)水平以及淀粉代謝關(guān)鍵酶與淀粉組分和抗性淀粉含量的關(guān)系。

4 結(jié)論

成熟鮮煙葉中存在抗性淀粉。在煙葉衰老過程中，支鏈淀粉迅速降解，而直鏈淀粉和抗性淀粉緩慢降解。烘烤過程中，不同成熟度煙葉的直鏈淀粉和支鏈淀粉均被大量降解，抗性淀粉緩慢降解。烘烤結(jié)束后，適熟煙葉的淀粉組分和抗性淀粉含量較低。適熟采收是降低上部葉淀粉組分和抗性淀粉含量、提高上部葉可用性的有效措施。

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Changes of resistant starch contents and starch components in upper leaves of flue-cured tobacco at different maturity stages and their relationship with gene expression

XU Mengxiao1, YANG Yongfeng2, DUAN Shijiang3, TAN Zhineng3, JIA Shiwei2,LI Xiaoyong3, ZHANG Ziying2, PENG Yufu2, WANG Pei1, CHEN Xiaolong2*

1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2 China Tobacco Henan Industrial Co., Ltd., Zhengzhou 450016, China;3 Jiangxi Province Ji’an Branch Company, China National Tobacco Corporation, Ji’an 343009, China

This paper aims to study the changes of starch components and resistant starch content in upper leaves of flue-cured tobacco at different maturity, in order to provide reference for improving the maturity, reducing the starch content and improving the availability of upper leaves in flue-cured tobacco.By taking the upper leaves of Yunyan 87 as research material, the changes of starch components and resistant starch contents in tobacco leaves at different maturity as well as the correlation between resistant starch and starch components were analyzed. The expression patterns of starch biosynthesis related genes were analyzed by real-time quantitative PCR.(1) Microscopic analysis revealed that the number and volume of starch granules increased gradually and reached maximum values at the mature stage. When tobacco leaves turned yellow, chloroplasts began to disintegrateand starch grains gradually degraded. (2) Starch content analysis showed that the resistant starch existed in mature tobacco leaves. The contents of resistant starch, amylose and amylopectin in leaves at different maturity stages were significantly different, which were the highest in un-riping leaves, followed by well-ripening leaves, and least in over-ripening leaves. During the aging process of tobacco leaves, amylopectin was rapidly degraded, while amylose and resistant starch were slowly degraded. (3) During the curing process, starch degradation mainly occurred in the yellowing stage. After flue-curing, about 50% of un-degraded starch in tobacco was resistant starch. (4) The gene expression levels of glucose-1-phosphate adenylyltransferase small subunit (), glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit (), granule-bound starch synthase (S), probable starch synthase (), 1,4-alpha-glucan-branching enzyme-like (), 2-3 starch branching enzyme 2 ()and isoamylase 2 () were higher in immature tobacco leaves, and decreased gradually with the aging of tobacco leaves, while the gene expression level ofisoamylase 3 () increased continuously during the aging process.Resistant starch exists in the upper leaves of flue-cured tobacco. Starch in leaves can be degradated mainly at the yellowing stage, whereas resistant starch formed during leaf development is difficult to be degraded fully during roasting. It may be an effective way to reduce the starch content of flue-cured tobacco and improve the availability of upper leaves through preventing the amylase synthesis in tobacco leaves.

flue-cured tobacco; resistant starch; amylose; amylopectin; gene expression

Corresponding author. Email：cxlong119@163.com

江西省煙草公司吉安市公司資助項(xiàng)目“吉安煙區(qū)優(yōu)質(zhì)上部煙葉原料開發(fā)與應(yīng)用”（JA2021-001）

徐夢(mèng)曉（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)闊煵萆锛夹g(shù)，Tel：18838210127，Email：1755959873@qq.com

陳小龍（1982—），主要從事煙葉生產(chǎn)和質(zhì)量檢測(cè)研究，Tel：13803833842，Email：cxlong119@163.com

2021-11-03；

2022-05-24

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