姜永雷，肖雨，鄧小鵬，項巖所保，董華，馬二登，李軍營，陳頤*

微生物菌劑對煙草連作土壤理化性質(zhì)及土壤胞外酶酶活性的影響

姜永雷1，肖雨2，鄧小鵬1，項巖所保3，董華3，馬二登1，李軍營1，陳頤1*

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省昆明市圓通街33號 650021；2 西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650224；3 云南省香料煙有限責(zé)任公司，保山 678000

【目的】為研究微生物菌劑對不同連作年限植煙土壤的影響。【方法】以不同連作年限植煙土壤為研究對象，研究微生物菌劑對植煙土壤理化性質(zhì)、胞外酶活性以及煙草農(nóng)藝性狀的影響，旨在為緩解煙草連作障礙提供參考?！窘Y(jié)果】（1）未添加微生物菌劑的土壤隨連作年限增加，土壤養(yǎng)分含量有機(jī)碳（SOC）、全氮（TN）、有效磷（AVP）、銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮(NO3--N）呈降低趨勢，土壤pH值呈下降趨勢，介于5.0～6.4；土壤胞外酶過氧化物酶（PER）、酸性磷酸酶（ACP）、纖維二糖水解酶（CBH）活性不同程度下降；同時煙草長勢變?nèi)?，株高、根、莖、葉鮮重和相同葉位葉片干重、鮮重、葉長和葉寬均呈降低，且均在連作8年達(dá)最低。（2）添加微生物菌劑后，土壤有機(jī)碳、全氮、有效磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量呈上升趨勢，土壤pH值呈上升趨勢，介于6.0～7.1；土壤胞外酶活性得到不同程度改善?！窘Y(jié)論】3種外源微生物均能改善土壤胞外酶活性，提高碳循環(huán)和氮循環(huán)能力，增加土壤養(yǎng)分，促進(jìn)烤煙生長，緩解連作障礙。

微生物菌劑；連作；理化性質(zhì)；酶活性

云南省烤煙連作現(xiàn)象嚴(yán)重[1]，影響了土壤的物理化學(xué)性質(zhì)、土壤養(yǎng)分含量和土壤酶活性[2]，導(dǎo)致土壤微生物結(jié)構(gòu)失衡、病蟲多發(fā)[3]、煙株生長發(fā)育不良、品質(zhì)和產(chǎn)量下降[4-5]。微生物菌肥不僅能增強(qiáng)根際土壤酶活性，改善土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)[6]，還能促進(jìn)植物的光合效能，加強(qiáng)根系養(yǎng)分吸收，增加作物產(chǎn)量[7]。前人研究表明微生物菌肥能增加烤煙株高、降低病害[8]；枯草芽孢桿菌菌肥對馬鈴薯瘡痂病具有較好的防效作用[9]；叢枝菌根真菌可以提高連作土壤酶活性，改善土壤微生物結(jié)構(gòu)[10]。本研究以不同連作年限植煙土壤為研究對象，通過微生物菌劑處理，研究微生物菌劑對不同連作年限植煙土壤理化性質(zhì)、胞外酶活性以及煙草的農(nóng)藝性狀等影響，為緩解煙草連作障礙，促進(jìn)煙草種植業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和試驗材料

試驗于2020年5月至8月在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪市研和試驗基地（24°14′ N，102°30′ E，海拔1680 m）進(jìn)行。試驗地土壤理化性狀：pH 6.40，有機(jī)質(zhì)10.70 g/kg，全氮0.54 g/kg，全磷0.11 g/kg，全鉀6.43 g/kg，有效磷 9.01 mg/kg，有效鉀160.00 mg/kg，堿解氮82.00 mg/kg。

供試煙草品種為K326，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。純微菌劑主要成分為枯草芽孢桿菌、深綠木霉等，有效活菌數(shù)≥8.0億個/g，由國家增產(chǎn)菌技術(shù)研究推廣中心、中國農(nóng)大農(nóng)用生物制劑中試基地提供；恩格蘭菌劑主要成分為枯草芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌等，另含腐植酸、氨基酸、有機(jī)質(zhì)等，有效活菌數(shù)≥20.0億個/g，由湖南恩格蘭生物科技有限責(zé)任公司提供；中微所菌液為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、塔賓曲霉等，有效活菌數(shù)≥10.0億個/L，由中科院微生物研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計

采用盆栽試驗，用30 cm×25 cm的聚乙烯塑料盆，裝不同連作年限（1 a，3 a，5 a，8 a）植煙土壤5 kg，分別按1 g/kg土壤、0.4 g/kg土壤和1 mL/kg土壤的使用標(biāo)準(zhǔn)添加純微、恩格蘭、中微所菌劑，采用澆灌法，連續(xù)處理2次，每15 d1次，每次300 mL。如表1所示，對照組T：不添加微生物菌劑；處理組A：添加純微菌劑；處理組B：添加恩格蘭菌劑；處理組C：添加中微所菌劑，共16個處理，每個處理重復(fù)5次。

表1 試驗設(shè)計

1.3 土壤采樣

每處理采集3株煙株，采用抖根法收集根際表面土壤，將3次收集的土樣混勻，放入冰盒中快速運(yùn)送到實驗室待測。實驗室內(nèi)將土壤樣品過2 mm篩后，分成兩份，一份風(fēng)干后保存，用于測定土壤的理化性質(zhì)；另一份于4℃低溫密封保存，用于測定胞外酶活性。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)指標(biāo)測定

采用雷諾 PHs?3E酸度計按照土∶水=1:5測定土壤pH值，土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀容量法測定，總氮（TN）采用半微量凱氏法測定，銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）按照鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法進(jìn)行測定，全磷（TP）和速效磷（AVP）采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定[11]。

1.4.2 土壤微生物酶活性測定

多酚氧化酶（PPO）采用鄰苯三酚比色法測定，過氧化物酶（PER）采用高錳酸鉀滴定法測定，脲酶（Urease）采用苯酚鈉比色法[12]測定，β-1, 4-葡萄糖苷酶（BG）、酸性磷酸酶（ACP）、β-1,4-N-乙?；被咸烟擒彰福∟AG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和纖維二糖水解酶（CBH）采用96微孔板熒光法測定，各土壤胞外酶的功能見表2[13]。

表2 土壤胞外酶基本信息

1.4.3 煙草農(nóng)藝性狀指標(biāo)測定

按照《YC/T 142—2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》測量株高、自上而下第4片葉葉長和葉寬，再收取所有的煙草，將根、莖和葉分開，用天平稱量根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、相同葉位單葉鮮重，再將相同葉位葉片洗凈，放入烘箱105℃殺青0.5 h，再轉(zhuǎn)65℃烘48 h至恒重，稱量其干重。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，再用SPSS 19.0中單因素方差分析、多因素方差分析、Person相關(guān)分析和Ducan's檢驗在0.05水平上比較不同數(shù)據(jù)組間差異性，用Canono做冗余分析（RDA），最后用Excel制表，Origin和Adobe illustrator制圖。

2 結(jié)果

2.1 不同微生物菌劑對不同連作年限土壤理化性質(zhì)的影響

如表3所示，未添加微生物菌劑土壤pH值、SOC、TN、AVP、NH4+-N和NO3--N含量隨著連作年限的增加均呈下降，且均在連作8 a時最低，而TP含量呈先降后增趨勢，連作3 a最低，連作8 a最高。

在連作1 a的土壤中添加微生物菌劑A、B和C處理，植煙土壤pH值、AVP和NO3--N含量呈上升，但對SOC、TN、TP和NH4+-N含量影響均不顯著。在連作3 a的植煙土壤中添加3種微生物菌劑能提高土壤pH值、SOC、TN、TP、AVP、NH4+-N和NO3--N含量。在連作5 a的植煙土壤中添加微生物菌劑A、B和C能顯著提高土壤的SOC、TN、AVP和NO3--N含量，而pH值和TP含量在3種微生物菌劑處理下均無顯著變化。在連作8 a的植煙土壤中，微生物菌劑A、B和C的施用能顯著提高土壤的pH值、TN、AVP和NO3--N含量，而SOC含量在3種微生物菌劑處理下均無顯著變化，微生物菌劑C對NH4+-N含量影響不顯著。以上結(jié)果表明，微生物菌劑對植煙土壤pH值、SOC、TN、AVP、NH4+-N和NO3--N含量影響顯著。

表3 不同微生物菌劑對不同連作年限植煙土壤理化性質(zhì)的影響

注：小寫字母表示不同微生物菌劑對煙草不同連作年限土壤處理之間存在顯著差異，<0.05，后同。

Note: Lowercase letters indicate that different microbial agents have different influences on the tobacco soil with different continuous cropping years,<0.05, the same as below.

2.2 不同微生物菌劑對煙草不同連作年限土壤酶活性的影響

未添加微生物菌劑的土壤隨連作年限增加，NAG（圖1d）活性增加，而PER（圖1b）、ACP（圖1g）和CBH（圖1h）活性降低，同時Urease（圖1 a）、PPO（圖1c）和BG（圖1e）活性均在連作5 a植煙土壤中為最高，LAP（圖1f）活性在連作8 a中為最高。

連作1 a的植煙土壤中添加微生物菌劑，土壤PER和BG活性均呈上升趨勢，CBH活性為下降；同時PPO、BG、LAP和ACP活性均在施用菌劑C后達(dá)到最高。而Urease活性在3種微生物菌劑處理下均無顯著變化。在連作5 a的植煙土壤中添加3種微生物菌劑，土壤PER、PPO、BG和ACP酶活性降低，但NAG和LAP酶活性升高，同時Urease活性在菌劑B中達(dá)到最高，CBH活性在菌劑C中活性最高。在連作8 a的植煙土壤中添加微生物菌劑，土壤酶PER、BG、LAP和CBH活性均升高，NAG和ACP活性在菌劑C中達(dá)到最高，Urease活性在菌劑B中達(dá)到最高，而PPO活性在3種微生物菌劑處理下均無顯著變化。以上結(jié)果表明，微生物菌劑對PPO、BG、NAG、LAP、ACP和CBH活性影響顯著。

注：無相同小寫字母表示不同微生物菌劑對煙草不同連作年限土壤處理之間存在顯著差異，P<0.05，后同。

2.3 不同微生物菌劑對煙草不同連作年限土壤酶的生態(tài)化學(xué)計量比的影響

如圖2所示，未施用菌劑處理下，不同的連作年限之間土壤酶的生態(tài)化學(xué)計量比差異顯著。不同連作年限植煙土壤中施用微生物菌劑處理，顯著改變了土壤酶的生態(tài)化學(xué)計量比。未添加微生物菌劑土壤隨著連作年限的增加，(BG+CBH)：(NAG+LAP)（圖2a）和(BG+CBH)：ACP（圖2b）均呈下降趨勢，分別在連作8 a和連作5 a達(dá)到最低；(NAG+LAP)：ACP（圖2c）在連作8 a達(dá)到最高，連作5 a為最低。

連作1 a的植煙土壤中添加微生物菌劑，（BG+ CBH）：（NAG+LAP）在菌劑C處理下降低26.42%，菌劑A和B處理下，其值變化不顯著；（BG+CBH）：ACP在菌劑A處理中上升了19.44%，在菌劑C處理中下降了24.29%；（NAG+LAP）：ACP在菌劑A處理中上升了22.40%，菌劑B和C處理之間變化不顯著。在連作3 a的植煙土壤中，（BG+CBH）：（NAG+LAP）、（BG+CBH）：ACP和（NAG+LAP）：ACP在3種微生物菌劑的處理下均呈上升趨勢。在連作5 a的植煙土壤中，（BG+CBH）：（NAG+LAP）在3種微生物菌劑的處理下均呈下降趨勢，（BG+CBH）：ACP在菌劑A中下降，在菌劑B和C中升高，（NAG+LAP）：ACP在3種微生物菌劑的處理下均呈上升趨勢。連作8 a的植煙土壤中，（BG+CBH）：ACP和（NAG+LAP）：ACP在3種微生物菌劑的處理下均呈上升趨勢，但對（BG+CBH）：（NAG+LAP）無顯著變化。

2.4 微生物菌劑對不同連作年限煙草的農(nóng)藝性狀的影響

不同連作年限植煙土壤對烤煙株高、莖鮮重、葉鮮重、根鮮重、相同葉位葉鮮重、相同葉位葉干重、葉長、葉寬和地上部鮮重/地下部鮮重等農(nóng)藝性狀影響極顯著；微生物菌劑對除地上部鮮重/地下部鮮重外所有農(nóng)藝性狀影響極顯著；兩者的交互對葉鮮重、根鮮重、相同葉位葉干重、葉長、葉寬和地上部鮮重/地下部鮮重影響顯著，對株高、莖鮮重和相同葉位葉鮮重?zé)o顯著影響。

如表4所示，未添加微生物菌劑的情況下，煙草的農(nóng)藝性狀指標(biāo)隨連作年限增加均呈下降趨勢，且均在連作8 a達(dá)最低。在連作1 a、3 a、5 a、8 a的土壤中分別添加微生物菌劑A、B和C，烤煙株高、莖鮮重、葉鮮重、根鮮重、相同葉位葉鮮重、相同葉位葉干重、葉長均為上升，但葉寬在1 a無顯著變化，其余連作年份均為上升，地下部/地上部鮮重比在1 a為增加，其余連作年限為降低。

表4 微生物菌劑對不同連作年限煙草農(nóng)藝性狀的影響

2.5 不同連作年限土壤酶活性的冗余分析

如圖3所示，分別對連作年限為1 a、3 a、5 a和8 a進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），連作5 a的植煙土壤中（圖3C），RDA1和RDA2軸共解釋了根際土壤胞外酶活性和根際土壤理化性質(zhì)變量之間關(guān)系的33.70%和12.91%的變異，而22.00%（條件效應(yīng)）的根際土壤胞外酶活性的變異能夠被pH解釋（=2.8，=0.038）；連作8 a植煙土壤中（圖3D），前兩軸RDA1和RDA2共解釋了根際土壤胞外酶活性和根際土壤理化性質(zhì)變量之間關(guān)系的33.72%和22.44%的變異，而24.40%（條件效應(yīng)）的根際土壤胞外酶活性的變異能夠被TP解釋（=3.2，= 0.01），20.30%（條件效應(yīng)）的根際土壤胞外酶活性的變異能夠被SAP解釋（=3.3，=0.002）。

3 討論

土壤微生物在土壤碳、氮循環(huán)中扮演重要角色[14]，在協(xié)調(diào)植物養(yǎng)分供應(yīng)與利用方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。但隨連作年限增加，土壤pH值、有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均呈下降趨勢，且烤煙株高、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、相同葉位葉鮮重、相同葉位葉干重、葉長和葉寬等農(nóng)藝性狀也極顯著降低，說明連作導(dǎo)致土壤酸化、碳氮等營養(yǎng)元素降低、影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，最終影響煙株生長[16]。陳曉燕等[17]研究表明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的聚谷氨酸復(fù)合微生物菌劑能促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解成腐殖質(zhì)，改善土壤酶活性，顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤肥力；王鵬等[18]研究也表明枯草芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌能改善云煙87的農(nóng)藝性狀，促進(jìn)根系生長。本研究表明，3種微生物菌劑均能提高連作土壤pH值、有機(jī)碳、全氮、有效磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，促進(jìn)煙草生長，其中恩格蘭菌劑和中微所菌劑能顯著提高連作1 a植煙土壤有效磷和硝態(tài)氮含量；在3 a植煙土壤中，純微菌劑對總氮、總磷和硝態(tài)氮含量影響最大，恩格蘭菌劑對銨態(tài)氮含量影響最顯著，中微所菌劑對pH值、有機(jī)碳和有效磷含量影響最大；連作5 a時，B微生物菌劑顯著增加了土壤硝態(tài)氮含量；連作8 a時，3種微生物菌劑對pH值和全磷含量影響表現(xiàn)最為顯著。

土壤酶活性能反映土壤肥力的高低，同時反映土壤有機(jī)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化情況[19]。長期連作土壤酶活性變化是連作障礙產(chǎn)生的主要原因之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨連作年限增加，PER、ACP和CBH活性降低，PPO和NAG活性增加，BG活性在連作8 a達(dá)到最低，說明連作會影響土壤中養(yǎng)分的循環(huán)和轉(zhuǎn)化，引發(fā)連作障礙，這與前人對大蒜[21]、蔬菜[22]的結(jié)論一致。李偉等[23]認(rèn)為枯草芽孢桿菌能顯著提升蘋果園土壤磷酸酶、脲酶、蛋白酶、蔗糖酶活性；劉紅杰等[24]研究表明微生物復(fù)合肥、摩西球囊霉、幼套球囊霉可提高烤煙連作土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性；李國等[25]研究表明枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能提升土壤酶活和速效養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而緩解棉花連作障礙。本研究中，3種微生物菌劑均能促進(jìn)土壤中的碳氮循環(huán)，增加土壤中的碳氮含量，促進(jìn)煙株生長，緩解連作障礙。其中，純微菌劑和恩格蘭菌劑能提高連作1 a植煙土壤的PER和BG活性，中微所菌劑能提高NAG和LAP的活性；連作3 a時，恩格蘭菌劑顯著地提高PER和BG活性，同時還能改善NAG、LAP和CBH活性；連作8 a時，3種微生物菌劑均能改善PER和BG活性，同時也對LAP和CBH活性影響表現(xiàn)顯著。

4 結(jié)論

（1）隨連作年限增加，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、總氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量降低；株高、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、相同葉位葉鮮重、相同葉位葉干重、葉長和葉寬降低；PER、ACP和CBH活性降低， PPO和NAG活性增加，BG活性在連作8 a最低。

（2）連作土壤中添加外源有益微生物，能提高土壤有機(jī)碳、全氮、有效磷、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，改善土壤pH值和胞外酶活性，促進(jìn)土壤中碳氮循環(huán)，增加土壤中碳氮含量，促進(jìn)煙草生長，緩解連作障礙。

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Effects of microbial agents on physicochemical and extracellular enzyme activities of tobacco continuous cropping soil

JIANG Yonglei1, XIAO Yu2, DENG Xiaopeng1, XIANG Yansuobao3, DONG Hua3, MA Erdeng1, LI Junying1, CHEN Yi1*

1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, China;2 College of Landscape Architecture and Horticulture, Southwest Forestry University,Kunming 650224, China;3 Yunnan Aromatic Tobacco Co., Ltd, Baoshan 678000, China

The effects of microbial agents on tobacco soil in different continuous cropping years were studied.The effects of microbial agents on physical and chemical properties, extracellular enzyme activities and agronomic characters of tobacco soil with different years of continuous cropping were studied.(1) Without microbial agents, the contents of SOC, TN, AVP, NH+ 4-N and NO- 3-N decreased with the increase of continuous cropping years, and soil pH value decreased from 5.0 to 6.4. The activities of soil extracellular enzyme peroxidase (PER), acid phosphatase (ACP) and fibrinose hydrolase (CBH) decreased in different degrees. At the same time, the plant height, fresh weight of root, stem and leaf organs, dry weight, fresh weight of leaves, leaf length and leaf width all decreased, and reached the lowest levels after continuous cropping for 8 years. (2) After microbial agent treatment, the contents of soil organic carbon, total nitrogen, available phosphorus, nitrate nitrogen and ammonium nitrogen showed an increasing trend, and the soil pH value was in the range of 6.0 to 7.1; The extracellular enzyme activities of soil were improved in different degrees.All the three microbial agents could improve extracellular enzyme activity, carbon and nitrogen cycling ability, increase nutrient content in soil, promote tobacco growth, and alleviate continuous cropping obstacle.

microbial agent; continuous cropping. physicochemical properties; enzyme activity

Corresponding author. Email：229781579@qq.com

云南省科學(xué)技術(shù)廳基礎(chǔ)研究專項（202001AU070006）；云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司重點項目（2021YL03）；中國煙草總公司云南省公司科技計劃重點項目（2019530000241011）

姜永雷（1988—），博士，主要從事煙草調(diào)制技術(shù)研究，Tel：0871-65100297，Email：jiangyatas@163.com

陳頤（1987—），博士，主要從事煙草調(diào)制技術(shù)研究，Tel：0871-65100247，Email：229781579@qq.com

2021-11-24；

2022-04-01

姜永雷，肖雨，鄧小鵬，等. 微生物菌劑對煙草連作土壤理化性質(zhì)及土壤胞外酶酶活性的影響[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（4）. JIANG Yonglei, XIAO Yu, DENG Xiaopeng, et al. Effects of microbial agents on physicochemical and extracellular enzyme activities of tobacco continuous cropping soil[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.239