姜兵兵, 王威威, 楊依婷, 李玉華, 刁 華*, 邵志宇*

(1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620; 2. 復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生殖與發(fā)育研究院,上海 200032; 3. 上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院 國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育藥具重點實驗室,上海 200032)

1,2,4-噻二唑-3,5-二酮類化合物是以噻二唑烷酮(TDZD)為核心骨架,改變2,4-位氮上連接的取代基而衍生出的一類氮硫雜環(huán)化合物。噻二唑烷酮類化合物可以作為藥物分子設(shè)計中的先導(dǎo)化合物[1]。目前,市售藥物分子中大多含有噻二唑烷酮結(jié)構(gòu)。含有噻二唑烷酮骨架的化合物具有許多生物和藥理活性,可作為糖原合酶激酶GSK-3β[2-5]、金黃色葡萄球菌(SrtA)[6]、抑制結(jié)腸炎[7]、抗菌活性[8]、抑制丙氨酸消旋酶[9]、抑制HL60細(xì)胞增殖[10]的抑制劑。其中,GSK-3β是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶,與多種重要的細(xì)胞功能有關(guān),而該酶的抑制劑可能具有抗白血病、治療Ⅱ型糖尿病和躁狂抑郁癥等疾病的活性[2-5]。

通過高通量篩選,研究人員發(fā)現(xiàn)含1,2,4-噻二唑-3,5-二酮骨架的化合物對精子的活性具有抑制作用[11]。部分具有噻二唑烷酮骨架的化合物比傳統(tǒng)的殺精劑壬苯醇醚-9效率更高,體細(xì)胞毒性更低。例如Tideglusib具有開發(fā)為新一代安全殺精避孕藥物的潛力[11],但其具體作用靶點和分子作用機(jī)制還未知。本課題組前期設(shè)計并合成出了一系列含有噻二唑烷酮骨架的化合物,研究了其對精子活性的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),含有噻二唑二酮五元環(huán)骨架的化合物對精子運動活性有一定的抑制作用,但還未能明確該類化合物與精子作用的具體位點?；谡n題組前期工作[12],為了探究噻二唑二酮類化合物抑制精子活性的具體生物靶點,并揭示其抑制精子活性的機(jī)理,本文設(shè)計了一類帶有熒光標(biāo)記的活性噻二唑二酮化合物,并研究了其與精子的相互作用模式。含熒光基團(tuán)的1,2,4-噻二唑-3,5-二酮衍生物的合成方法如下：(1)噻二唑二酮五元環(huán)骨架的構(gòu)建(Scheme 1)[13]; (2)帶有熒光基團(tuán)的化合物的合成(Scheme 2)[14-15]; (3)將熒光化合物連接到噻二唑二酮骨架上,合成目標(biāo)化合物S1～S3(Scheme 3)。

Scheme 1

Scheme 2

Scheme 3

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker 150/600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));ESI-TOF型高分辨質(zhì)譜儀;NIKON A1型快速掃描成像共聚焦顯微鏡;MC170HD型倒置顯微鏡。

Percoll液、1X磷酸鹽緩沖液、二甲基亞砜。其余所用試劑為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1) 化合物1的合成

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入氨基甲酸乙酯2.67 g(30.00 mmol),無水二氯甲烷30.00 mL，冰浴攪拌15 min。加入6.00 mL(75.00 mmol)草酰氯,并在冰浴下反應(yīng)1 h。撤去冰浴,于70 ℃下加熱回流4 h,冷卻至室溫后,減壓濃縮除去溶劑,得到白色黏稠液體化合物1,不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。

(2) 化合物2的合成(以2a為例)

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入芐胺3.21 g(30.00 mmol),三乙胺3.03 g(30.00 mmol),二氯甲烷30.00 mL。冰浴攪拌15 min后,緩慢加入二硫化碳7.61 g(100.00 mmol),之后迅速加入EDCI(縮合劑)5.76 g(30.00 mmol),冰浴條件下反應(yīng)30 min。撤去冰浴,于室溫反應(yīng)16 h,TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=5/95,V/V)反應(yīng)基本完全。減壓濃縮除去溶劑,加入乙酸乙酯100.00 mL進(jìn)行稀釋,加入飽和碳酸氫鈉溶液(3×20.00 mL)和飽和食鹽水(2×20.00 mL)洗滌,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=2/98,V/V),分離得到3.58 g(24.00 mmol)無色透明液體2a,產(chǎn)率80.30%; 4.01 g無色透明液體2b,產(chǎn)率80.00%。

(3) 化合物3的合成(以3a為例)

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物12.30 g(20.00 mmol),化合物2a芐基硫代異氰酸酯2.98 g(20.00 mmol),正己烷12.00 mL和二氯甲烷12.00 mL。冰浴下攪拌15 min后,加入磺酰氯2.70 g(20.00 mmol),冰浴下反應(yīng)30 min。撤去冰浴,室溫反應(yīng)16 h后移除干燥管,與空氣密切接觸30 min,TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=1/9,V/V)反應(yīng)原料基本消耗完全。減壓濃縮除去溶劑,加入乙酸乙酯100.00 mL進(jìn)行稀釋,加入飽和碳酸氫鈉溶液,調(diào)節(jié)pH值為中性,采用飽和食鹽水(2×20.00 mL)洗滌,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=1/9,V/V),乙醇重結(jié)晶純化得到化合物3a。

3a:白色粉末3.60 g,產(chǎn)率64.30%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.45(d,J=7.0 Hz, 2H), 7.37～7.30(m, 3H), 4.84(s, 2H), 4.41(q,J=7.1 Hz, 2H), 1.39(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 164.13, 148.30, 148.23, 134.36, 129.21, 128.84, 128.62, 65.50, 45.95, 14.21。

3b:白色粉末3.66g,產(chǎn)率61.40%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.44(dd,J=8.6 Hz, 5.3 Hz, 2H), 7.01(t,J=8.6 Hz, 2H), 4.80(s, 2H), 4.41(q,J=7.1 Hz, 2H), 1.39(t,J=7.1 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 164.12, 162.84(d,JC-F=247.8 Hz), 148.21(d,JC-F=16.1 Hz), 131.27(d,JC-F=8.4 Hz), 130.23(d,JC-F=3.3 Hz), 115.84, 115.70, 65.56, 45.17, 14.20;19F NMR(565 MHz, CDCl3)δ: -112.96。

(4) 化合物4的合成(以4a為例)

向50.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物3a固體粉末1.00 g(3.50 mmol),二氯甲烷10.00 mL,待完全溶解后加入乙二胺1.00 mL,室溫下反應(yīng)3 h。TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=3/7,V/V)原料基本消耗完全。冰浴條件下,加入一定量的甲酸中和乙二胺(EDA),調(diào)節(jié)pH為中性,減壓濃縮除去溶劑。加入乙酸乙酯50.00 mL稀釋,加入水(2×15.00 mL)和飽和食鹽水(2×15.00 mL)洗滌,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=1/9～2/8,V/V),純化得到化合物4a。

4a:白色固體粉末0.67 g,產(chǎn)率91.40%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.41(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.38～7.30(m, 3H), 4.83(s, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 167.92, 155.55, 134.86, 128.82, 128.67, 128.42, 45.56。

4b:白色固體粉末0.60 g,產(chǎn)率80.10%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.41(dd,J=8.5, 5.4 Hz, 2H), 7.02(t,J=8.6 Hz, 2H), 4.79(s, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 167.72, 162.72(d,JC-F=247.4 Hz), 155.36, 130.81(d,JC-F=8.3 Hz), 130.71(d,JC-F=3.3 Hz), 115.73(d,JC-F=21.6 Hz), 44.86;19F NMR(565 MHz, CDCl3)δ: -113.34。

(5) 化合物5的合成

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入1,8-萘二甲酸酐1.98 g(10.00 mmol), 4-氨基-1-丁醇1.78 g(20.00 mmol),無水乙醇40.00 mL,于90 ℃下加熱回流6 h。TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=3/7,V/V)反應(yīng)完全后,停止加熱,冷卻至室溫。將溶液倒入大量冰水中,有白色固體析出,抽濾,烘干,得到2.41 g(8.96 mmol)白色固體5,粗產(chǎn)率89.60%,不經(jīng)純化處理直接用于下一步反應(yīng)。

(6) 化合物6的合成

向50.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物50.54 g(2.00 mmol),四溴化碳1.06 g(3.20 mmol),二氯甲烷15.00 mL,冰浴下攪拌15 min。隨后加入三苯基膦0.84 g(3.20 mmol),反應(yīng)30 min后撤去冰浴,室溫反應(yīng)16 h,TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=2/8,V/V)反應(yīng)原料消耗完全。減壓濃縮除去溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱(100～200目)層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=15/85,V/V),純化得到白色固體粉末化合物60.53g,產(chǎn)率80.30%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.53(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.16(d,J=7.7 Hz, 2H), 7.70(t,J=7.5 Hz, 2H), 4.18(t,J=7.2 Hz, 2H), 3.45(t,J=6.7 Hz, 2H), 2.00～1.93(m, 2H), 1.91～1.85(m, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 164.09, 133.94, 131.50, 131.21, 128.04, 126.91, 122.49, 39.33, 33.21, 30.26, 26.89。

(7) 化合物7的合成

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入4-溴-1,8-萘酐2.77 g(10.00 mmol), 4-氨基-1-丁醇1.33 g(15.00 mmol),無水乙醇30.00 mL,并于90 ℃下加熱回流6 h。TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=3/7,V/V)反應(yīng)完全。靜置冷卻至室溫,將溶液倒入大量冰水中,有固體析出,抽濾,烘干,得到2.68 g(7.70 mmol)淡黃色固體7,粗產(chǎn)率77.00%,不經(jīng)純化處理直接用于下一步反應(yīng)。

(8) 化合物8的合成

向100.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物72.68 g(7.7 mmol),嗎啉2.01 g(23.10 mmol),乙二醇單甲醚30.00 mL,于125 ℃下加熱回流6 h。TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=4/6,V/V)反應(yīng)完全。靜置冷卻至室溫,將溶液倒入大量冰水中,有固體析出,抽濾,烘干,得到黃色固體。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=3/7～5/5,V/V),純化得到黃色固體粉末化合物81.82g,產(chǎn)率66.80%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.56(d,J=7.1 Hz, 1H), 8.51(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.40(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.69(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.21(d,J=8.0 Hz, 1H), 4.20(t,J=7.8 Hz, 2H), 4.01(t,J=7.0 Hz, 4H), 3.72(t,J=6.4 Hz, 2H), 3.26(t,J=3.8 Hz, 4H), 1.87～1.78(m, 2H), 1.73～1.65(m, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 164.48, 164.03, 155.67, 132.60, 131.23, 130.12, 129.86, 126.11, 125.86, 123.24, 117.07, 114.97, 66.97, 62.48, 53.44, 39.78, 29.91, 24.52。

(9) 化合物9的合成

向50.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物80.71 g(2.00 mmol),乙酸乙酯20.00 mL,冰浴下攪拌15 min。加入三溴化磷0.50 mL(5.50 mmol),冰浴下反應(yīng)30 min。撤去冰浴,于90 ℃下加熱回流2 h,TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=3/7,V/V)反應(yīng)原料消耗完全,靜置冷卻至室溫。加入適量的甲醇中和多余的三溴化磷,直至不再冒煙為止。加入30.00 mL乙酸乙酯進(jìn)行稀釋,再加入飽和碳酸氫鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為中性,用飽和食鹽水(2×10.00 mL)洗滌,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=2/8～3/7,V/V),純化得到黃色固體粉末化合物90.53 g,產(chǎn)率63.90%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.57(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.52(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.42(d,J=9.1 Hz, 1H), 7.70(t, 8.2 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.0 Hz, 1H), 4.20(t,J=7.2 Hz, 2H), 4.02(t,J=6.9Hz, 4H), 3.46(t,J=6.7 Hz, 2H), 3.26(t,J=6.5 Hz, 4H), 2.00～1.94(m, 2H), 1.92～1.86(m, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 164.40, 163.93, 155.68, 132.60, 131.24, 130.14, 129.87, 126.12, 125.86, 123.20, 117.02, 114.97, 66.97, 53.45, 39.21, 33.24, 30.27, 26.92。

(10) 目標(biāo)化合物S的合成(以S1為例)

向50.00 mL反應(yīng)瓶中加入化合物60.33 g(1 mmol),化合物4a0.21 g(1.00 mmol),無水乙腈10.00 mL。室溫攪拌15 min后,加入碳酸鉀0.28 g(2.00 mmol),室溫反應(yīng)24 h。TLC監(jiān)測(乙酸乙酯/石油醚=3/7,V/V)反應(yīng)原料基本消耗完全,停止反應(yīng),減壓濃縮除去溶劑。加入乙酸乙酯50.00 mL稀釋,水(2×10.00 mL)和飽和食鹽水(2×10.00 mL)洗滌,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。殘余物經(jīng)硅膠(100～200目)柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚=1/9～2/8,V/V),乙醇重結(jié)晶,純化得到目標(biāo)化合物S1。

S1:白色固體粉末0.21 g,產(chǎn)率45.60%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.59(d,J=7.2 Hz, 2H, 23, 29-H), 8.22(d,J=8.1 Hz, 2H, 25, 27-H), 7.76(t,J=7.7 Hz, 2H, 24, 28-H), 7.42(d,J=7.1 Hz, 2H, 8, 12-H), 7.34～7.27(m, 3H, 9, 10, 11-H), 4.80(s, 2H, 6-H), 4.22(t,J=7.0 Hz, 2H, 16-H), 3.71(t,J=7.0 Hz, 2H, 13-H), 1.84～1.78(m, 2H, 15-H), 1.78～1.73(m, 2H, 14-H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 165.98(C5), 164.23(C18,22), 152.95(C3), 135.24(C25,27), 134.08(C23,29), 131.61(C7), 131.36(C24,28), 128.87(C9,11), 128.70(C26), 128.21(C8,12), 128.18(C10), 126.99(C19,21), 122.54(C20), 45.97(C13), 44.64(C6), 39.42(C16), 26.20(C15), 25.03(C14); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C25H21N3O4NaS 482.1147{[M+Na]+} found 482.1145。

S2:白色固體粉末0.18 g,產(chǎn)率37.50%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.58(d,J=7.3 Hz, 2H, 23, 29-H), 8.22(d,J=8.2 Hz, 2H, 25, 27-H), 7.76(t,J=7.7 Hz, 2H, 24, 28-H), 7.41(dd,J=8.4 Hz, 5.4 Hz, 2H, 8, 12-H), 6.98(t,J=8.6 Hz, 2H, 9, 11-H), 4.76(s, 2H, 6-H), 4.21(t,J=7.0 Hz, 2H, 16-H), 3.70(t,J=6.9 Hz, 2H, 13-H), 1.83～1.78(m, 2H, 15-H), 1.78～1.72(m, 2H, 14-H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 165.93(C5), 164.21(C18,22), 162.62(C10)(d,JC-F=246.9 Hz), 152.83(C3), 134.08(C25,27), 131.60(C23,29), 131.33(C24,28), 131.11(C7)(d,JC-F=3.2 Hz), 130.88(C8,12)(d,JC-F=8.3 Hz), 128.15(C26), 126.98(C19,21), 122.50(C20), 115.59(C9,11)(d,JC-F=21.5 Hz), 45.21(C13), 44.64(C6), 39.41(C16), 26.20(C15), 25.02(C14);19F NMR(565 MHz, CDCl3)δ: -113.65; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C25H20FO4NaS 500.1050{[M+Na]+} found 500.1050。

S3:黃綠色油狀液滴0.16g,產(chǎn)率29.60%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.58(d,J=6.5 Hz, 1H, 27-H), 8.52(d,J=8.0 Hz, 1H, 29-H), 8.43(d,J=8.9 Hz, 1H, 23-H), 7.71(t,J=8.0 Hz, 1H, 28-H), 7.42(d,J=7.2 Hz, 2H, 8,12-H), 7.33～7.27(m, 3H, 9, 10, 11-H), 7.23(d,J=8.1 Hz, 1H, 24-H), 4.80(s, 2H, 6-H), 4.20(t,J=7.0 Hz, 2H, 16-H), 4.02(t,J=6.8 Hz, 4H, 32, 34-H), 3.70(t,J=7.1 Hz, 2H, 13-H), 3.27(t,J=7.2 Hz, 4H, 31, 35-H), 1.82～1.77(m, 2H, 15-H), 1.76～1.72(m, 2H, 14-H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 166.01(C5), 164.44(C25), 163.98(C18), 155.77(C22), 152.93(C3), 135.24(C23), 132.68(C29), 131.31(C7), 130.22(C27), 129.90(C28), 128.85(C9,11), 128.70(C26), 128.20(C8,12), 126.14(C10), 125.88(C19), 123.17(C20), 116.96(C21), 115.00(C24), 66.97(C32,34), 53.45(C31,35), 45.96(C13), 44.66(C6), 39.26(C16), 26.18(C15), 25.05(C14); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C29H28N4O5NaS 567.1662{[M+Na]+} found 567.1672。

1.3 目標(biāo)化合物S1, S2, S3對精子的熒光標(biāo)記測試

(1) 新鮮精液標(biāo)本的采集

本實驗所用樣本來自男性志愿者,年齡20～35歲,禁欲3～7 d,手淫法獲取精液。精液樣本要求：液化時間≤30 min,精液量≥2.00 mL, pH=7.2～8.0,白細(xì)胞﹤1×106mL-1,精子密度≥15×106mL-1,精子的運動活力滿足前向運動率(Progressive)>32%,精漿和血清抗精子抗體陰性。本研究所有精液樣本均取得捐獻(xiàn)者知情同意且所有標(biāo)本在實驗結(jié)束后均進(jìn)行高溫煮沸消殺。

(2) 高活力精子的獲取

采用Percoll離心法收集高活力精子,1×PBS與Percoll原液1 ∶1混合后得到50%(V/V)的Percoll工作液。將Percoll工作液加入15.00 mL離心管中,在Percoll工作液上方加入等體積充分混勻的精液,于25 ℃條件下以500.00 g離心15 min,棄去精子沉淀團(tuán)上大部分上清液,1×PBS重懸精子沉淀團(tuán),以300.00 g離心5 min洗滌精子,重復(fù)洗滌兩次,用BWW培養(yǎng)基重懸精子團(tuán)沉淀,并稀釋調(diào)整精子濃度為10～20×106mL-1,備用。

(3) 目標(biāo)化合物快速殺精制動活性的測定

取化合物S1,S2,S3用BWW進(jìn)行倍比稀釋,最高濃度為100 μM。將稀釋后的化合物加入96孔板,每孔50 μL。取Percoll離心重懸后的高活力精子,用BWW稀釋調(diào)整精子濃度為10～20×106mL-1,吸取50 μL精子懸液與96孔板中化合物混合的同時按下秒表計時20 s。以溶劑DMSO為陰性對照,Tideglusib為陽性對照,顯微鏡下觀察該濃度下20 s內(nèi)該化合物能否制動全部精子,由此測出全部精子喪失運動能力所需藥物的最小有效濃度(MEC)。此實驗至少重復(fù)3次，得MEC平均值。

(4) 目標(biāo)化合物對精子的熒光標(biāo)記測試

取Percoll離心重懸后的高活力精子,用BWW稀釋調(diào)整精子濃度為10～20×106mL-1,并平均分為7組,分別命名為Tideglusib組、S1-5 μM組、S1-10 μM組、S2-5 μM組、S2-10 μM組、S3-5 μM組、S3-10 μM組。向各組中加入相應(yīng)的化合物并調(diào)整至相應(yīng)的濃度,反應(yīng)20 s, 500 g離心5 min棄上清,1×PBS洗滌2次后重懸,涂片,室溫下避光晾干,熒光封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察,此實驗全程避光處理。

(5) 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad prism9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,MEC濃度結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用Unpaired t test, P﹤0.05定為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的MEC測定

測得目標(biāo)化合物與其先導(dǎo)化合物Tideglusib在20 s內(nèi)快速制動100%精子所需的最小化合物濃度(MEC值)見表1。目標(biāo)化合物與先導(dǎo)化合物Tideglusib相比,除S2外,無顯著性差異。測試結(jié)果表明,熒光標(biāo)記的衍生化合物與其先導(dǎo)化合物Tideglusib相同,仍具有很強的精子制動活性,可用于標(biāo)示和定位研究Tideglusib與細(xì)胞作用的模式及其生物學(xué)靶標(biāo)。

表1 目標(biāo)化合物與Tideglusib在20 s內(nèi)使人精子100%制動的最小濃度MEC值的比較/μMTable 1 Comparison of the minimum concentration MEC value of target compound and tideglusib for 100% immobilization of human sperm within 20 s/μM

2.2 目標(biāo)化合物對人精子的熒光標(biāo)記作用

為了驗證目標(biāo)化合物對人精子的標(biāo)記作用,分別設(shè)置了5 μM、 10 μM兩個不同濃度梯度的化合物對收集的高活力精子進(jìn)行熒光染色。目標(biāo)化合物對精子的典型染色結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示,與沒有熒光的Tideglusib相比,化合物S1,S2對精子具有明顯的藍(lán)色熒光標(biāo)記作用,而化合物S3對精子有黃綠色熒光標(biāo)記作用。S1,S2對精子的熒光染色部位主要集中在精子尾部頸段和中段位置及精子頭部頂體后區(qū)位置。S3對精子的熒光染色部位主要集中在精子尾部頸段和中段(middle piece)位置。這些標(biāo)記部位與電鏡觀察到的Tideglusib對精子的尾部頸段和中段位置以及精子頭部質(zhì)膜的損傷部位基本一致[11],表明熒光標(biāo)記的衍生化合物,保持了先導(dǎo)化合物Tideglusib的活性,后續(xù)可用于Tideglusib與細(xì)胞作用的模式及其生物學(xué)靶標(biāo)和活性機(jī)制的研究。

圖1 目標(biāo)化合物S1、 S2、 S3及先導(dǎo)化合物Tideglusib對人精子的熒光染色Figure 1 Fluorescent staining of human sperm by target compounds S1, S2, S3 and lead compound Tideglusib

3 結(jié)論

本文合成了3個帶有熒光基團(tuán)的1,2,4-噻二唑-3,5-二酮化合物S1,S2,S3。目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)通過1H NMR、13C NMR、 HR-MS表征驗證;測定了目標(biāo)化合物對精子運動活性的抑制作用及其熒光標(biāo)記在精子上的分布模式。結(jié)果表明：目標(biāo)化合物S1,S2,S3保持了以先導(dǎo)化合物Tideglusib為代表的噻二唑二酮類化合物快速殺精制動活性;目標(biāo)化合物對精子熒光染色主要集中在精子尾部頸段和中段位置及精子頭部后區(qū),與電鏡觀察到的Tideglusib導(dǎo)致精子尾部中段和精子頭部質(zhì)膜損傷的位置基本一致,進(jìn)一步證明了噻二唑二酮類化合物可能是通過損傷精子尾部頸段和中段及精子頭部來抑制精子運動。目標(biāo)化合物對體細(xì)胞的染色很弱,這也與Tideglusib的精子選擇性活性(低體細(xì)胞毒性)相一致?？傊?目標(biāo)化合物在引入熒光標(biāo)記的同時,成功保存了先導(dǎo)化合物的生物學(xué)活性,為探究噻二唑二酮類化合物與靶細(xì)胞的作用模式,以及明確其活性的生物學(xué)靶標(biāo)及分子機(jī)制提供了新的工具和思路,為開發(fā)研究新的醫(yī)藥中間體提供了方向。