不同采烤方式對(duì)烤煙上部葉脂質(zhì)褐變的影響

孫皓月，賈宏昉，謝良文，馮長(zhǎng)春，伍德洋，秦艷青，陳漢發(fā)，郭仕平*

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450000；2四川省煙草公司，四川成都 610000；3四川省煙草公司涼山州公司，四川西昌 615000）

0 引言

【研究意義】烤煙上部葉因組織結(jié)構(gòu)密而厚、生長(zhǎng)過(guò)程中優(yōu)越的田間光照通風(fēng)條件導(dǎo)致物質(zhì)積累較多，烘烤過(guò)程中常面臨定色難、易掛灰及青筋煙比例高等問(wèn)題（張譯丹等，2020）。褐變反應(yīng)是烘烤中煙葉色澤與香氣品質(zhì)形成的關(guān)鍵步驟，過(guò)度褐變易造成煙葉掛灰、黑糟，而葉色作為煙葉收購(gòu)分級(jí)中的第二分組因素，對(duì)烤煙等級(jí)的評(píng)定具有重要影響。因此，采取有效的采烤措施，提高上部葉可用性及減少褐變反應(yīng)，對(duì)保證卷煙產(chǎn)品的煙氣濃度和豐富煙香具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】利用帶莖采烤技術(shù)降低煙葉酶促褐變反應(yīng)，改善上部煙葉烤后品質(zhì)，是當(dāng)前烤煙上部葉技術(shù)創(chuàng)新的重要研究方向（仙立國(guó)等，2020；鄒凱等，2021）。近年來(lái)，通過(guò)帶莖采烤減少煙葉掛灰褐變、提高上部葉可用性越來(lái)越受到重視，多關(guān)注于酶促褐變和水分遷移等（黃浩等，2014；蔣博文等，2018；魏碩等，2019）。帶莖烘烤中莖稈的自由水向葉片內(nèi)部發(fā)生運(yùn)移，在變黃后組織內(nèi)部仍保持較高的自由水含量，在烘烤過(guò)程中能有效促進(jìn)煙葉有機(jī)物質(zhì)的降解與轉(zhuǎn)化，外觀質(zhì)量明顯提高（王曉賓等，2008）。而在果蔬方面，許多研究表明褐變的發(fā)生與脂肪酸代謝有著密切的聯(lián)系，龍眼果皮脂氧合酶（LOX）活性和膜脂不飽和脂肪酸的降解加速能引起龍眼果皮褐變加深（陳藝暉等，2011）；通過(guò)降低板栗不飽和脂肪酸含量，可減輕加工貯藏過(guò)程中的褐變反應(yīng)（楊芳等，2013）；通過(guò)調(diào)節(jié)玉米、余甘子的貯藏溫度，可減輕褐變，抑制脂肪酸積累（張福平等，2014；洪宇等，2020）；延緩雙孢蘑菇脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程，能降低其褐變指數(shù)（李靜等，2019）。上述研究結(jié)果均表明果蔬類(lèi)的脂肪酸代謝和氧化是影響褐變進(jìn)程的重要因素之一。【本研究切入點(diǎn)】煙葉烘烤過(guò)程中褐變是多因素綜合影響的結(jié)果，前人多關(guān)注于酶促褐變，對(duì)煙葉脂質(zhì)氧化褐變研究甚少，不同采烤方式下脂質(zhì)氧化對(duì)煙葉褐變的影響研究更是鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】設(shè)置4種采烤方式，從細(xì)胞生物學(xué)和分子方向?qū)Σ煌煽痉绞较轮|(zhì)氧化與烤煙上部葉的褐變關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，為提高烤煙上部葉可用性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020—2021年在廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)基地開(kāi)展，品種為云煙87。選擇在當(dāng)?shù)責(zé)熑~適熟季節(jié)，采收落黃均勻、長(zhǎng)勢(shì)一致的煙葉，帶莖采收煙葉選取葉色均勻，葉面積大小、莖稈粗細(xì)基本一致煙葉及其莖稈為試驗(yàn)材料，有效留葉數(shù)為18片（包括腳葉3片），煙株采收至上部葉6片時(shí)，自頂部向下標(biāo)記為1～6葉位。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

煙葉帶莖方式設(shè)4個(gè)處理：CK，常規(guī)分次采收（正常采烤）；T1，3～4葉位一次性帶莖割收（2片煙葉帶莖烘烤）；T2，2～5葉位一次性帶莖割收（4片煙葉帶莖烘烤）；T3，1～6葉位一次性帶莖割收（6片煙葉帶莖烘烤）。莖切口距離最近葉柄1～2 cm，每處理5桿置于同一密集烤房中棚觀察窗位置進(jìn)行烘烤，在變黃關(guān)鍵期干球溫度達(dá)42 ℃、煙葉黃片青筋主脈發(fā)軟、烘烤72 h時(shí)取樣，選取每處理第3葉位的10片煙葉立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室；采用半葉法將煙葉一分為二并去除主脈，一半葉片4 ℃保存用于超微結(jié)構(gòu)觀察，另一半葉片放入液氮內(nèi)速凍后置于-80 ℃冰柜儲(chǔ)存，用于酶活性與基因測(cè)定，每處理3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 褐變程度測(cè)定 選取放置取樣窗口的每處理5片煙葉，用于烘烤過(guò)程中顏色變化的測(cè)定。參考汪代斌等（2017）的方法，采用Photoshop像素法計(jì)算煙葉變褐部分面積與總?cè)~片面積（圖1），從煙葉烘烤開(kāi)始每隔24 h進(jìn)行褐變比例統(tǒng)計(jì)，測(cè)定褐變程度，進(jìn)而計(jì)算褐變速度。褐變面積/葉片面積＜15%為輕度褐變，褐變面積/葉片面積≥15%為中度及以上褐變。

1.3.2 超微結(jié)構(gòu)分析 參考鄭小雨等（2020）的方法，在變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)選取各處理葉片第5～第7支脈之間右側(cè)相同的位置，用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm小塊，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS緩沖液配制）中固定。透射電鏡觀察角質(zhì)層：用1%鋨酸（pH 7.2～7.4，0.1 mol/L PBS緩沖液配制）固定，經(jīng)100%丙酮脫水后用Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋聚合；用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片機(jī)（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）切出超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，再用JEM-1400Plus型透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）進(jìn)行觀察并拍照，每處理觀察10個(gè)視野。用Photoshop 2020進(jìn)行標(biāo)注處理。

1.3.3 LOX活性測(cè)定 LOX活性按照酶活試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 脂肪酸含量測(cè)定 烘烤中煙葉脂肪酸等成分參考YC/T 288—2009《煙草及煙草制品 多元酸（草酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸）的測(cè)定 氣相色譜法》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 烤后煙葉分級(jí) 參考GB 2635—1992《烤煙》對(duì)烤后煙葉進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算烤后煙葉的等級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.6 基因表達(dá)量分析 在變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)選取各處理葉片，采用TRIzol法提取煙葉總RNA，通過(guò)隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Gen-Bank發(fā)布的、、、、和脂肪酸代謝相關(guān)基因，以L(fǎng)25煙草核糖體蛋白作內(nèi)參基因（GenBank：L18908.1）（表1），采用2算法（黃化剛等，2016）進(jìn)行分析，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用檢驗(yàn)比較2個(gè)樣本組，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2022制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過(guò)程中煙葉褐變比例與烤后煙葉褐變比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果

通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，烘烤過(guò)程中不同采烤處理的上部葉顏色變化趨勢(shì)基本相同（圖2-A），煙葉褐變速度排序?yàn)椋?片煙葉帶莖烘烤處理＜4片煙葉帶莖烘烤處理＜2片煙葉帶莖烘烤處理＜正常采烤處理（圖2-B）。由此可知，與正常采烤處理相比，隨著帶莖葉片數(shù)的增加，褐變反應(yīng)逐漸減輕，說(shuō)明帶莖處理在降低褐變程度上起著一定作用。

由圖2-C可知，不同采烤處理煙葉褐變比例排序?yàn)椋?片煙葉帶莖烘烤處理＞正常采烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，其中4片和6片煙葉帶莖烘烤處理煙葉烤后褐變比例較正常采烤處理分別減少1.34%和4.22%（絕對(duì)值）。與正常采烤處理煙葉相比，2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理分別提高上等煙比例20.71%、22.02%和43.99%，其中6片煙葉帶莖烘烤處理的中上等煙比例最高，較正常采烤處理提高1.67%（絕對(duì)值）。

2.2 煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

如圖3所示，變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)，帶莖烘烤處理明顯降低煙葉角質(zhì)層厚度。正常采烤處理上部葉角質(zhì)層較厚，達(dá)0.436 μm，2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理較正常采烤處理分別減少34.09%、43.86%和46.40%，其中6片煙葉帶莖烘烤處理的角質(zhì)層最薄，顯著低于正常采烤處理（＜0.05，下同）。說(shuō)明對(duì)比正常采烤處理上部葉，帶莖處理煙葉角質(zhì)層更薄。

2.3 煙葉的脂肪酸含量分析結(jié)果

不同采烤處理對(duì)上部葉變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)脂肪酸含量的影響如圖4-A所示，烤后煙葉均檢測(cè)到7種脂肪酸，C14：1（肉豆蔻酸）含量表現(xiàn)為6片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞正常采烤處理，但C18：2（亞油酸）、C16：0（棕櫚酸）、C18：0（硬脂酸）、C20：0（花生酸）、C18：1（油酸）和C18：3（亞麻酸）含量均表現(xiàn)為正常采烤處理高于帶莖采烤處理。正常采烤處理煙葉的脂肪酸總量分別是2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理的1.12、1.15和1.17倍。其中6片煙葉帶莖烘烤處理的C16：0和C18：2含量較正常采烤處理分別降低15.73%和12.72%，差異達(dá)顯著水平；C16：0、C18：2和C18：0含量均表現(xiàn)為正常采烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，含量隨葉片數(shù)增加而下降。6片和2片煙葉帶莖烘烤處理的C18：1和C18：3含量分別為5.19和5.40 mg/g，較正常采烤處理煙葉含量分別降低20.64%和17.42%，分別達(dá)極顯著（＜0.01，下同）和顯著差異。

在烘烤變黃關(guān)鍵期，LOX活性表現(xiàn)為正常采烤處理＞2片煙葉帶莖烘烤處理＞4片煙葉帶莖烘烤處理＞6片煙葉帶莖烘烤處理，其中6片煙葉帶莖烘烤處理與正常采烤處理間存在顯著差異（圖4-B）。說(shuō)明6片煙葉帶莖烘烤處理煙葉在一定程度上飽和與不飽和脂肪酸的積累較多，脂質(zhì)降解氧化和脅迫應(yīng)答能力更強(qiáng)。

2.4 不同采烤處理煙葉脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化

以正常采烤處理煙葉的基因表達(dá)量為1，通過(guò)對(duì)4種采烤處理變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)6個(gè)脂肪酸代謝基因進(jìn)行表達(dá)分析（圖5），發(fā)現(xiàn)對(duì)比正常采烤處理煙葉，4片和6片煙葉帶莖烘烤處理各脂肪酸代謝基因表達(dá)量均下調(diào)，且趨勢(shì)相似，帶莖與不帶莖處理煙葉之間的表達(dá)差異較大，帶莖烘烤處理中6片煙葉的脂肪酸代謝影響作用最大，其表達(dá)量均遠(yuǎn)小于正常采烤處理煙葉，、、和基因相對(duì)表達(dá)量分別顯著降低56.03%、46.35%、53.79%和55.02%，和相對(duì)表達(dá)量分別極顯著降低87.28%和90.96%。

2.5 煙葉脂質(zhì)氧化指標(biāo)相關(guān)分析結(jié)果

分析變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)煙葉脂肪酸含量、角質(zhì)層厚度和LOX活性之間的相關(guān)性，結(jié)果（圖6）顯示，角質(zhì)層厚度與C16：0呈顯著正相關(guān)，與C18：0和脂肪酸總量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.977、0.991和0.997。C16：0、C18：1+C18：3與LOX活性分別呈顯著和極顯著正相關(guān)，說(shuō)明變黃期LOX活性對(duì)烤后煙葉棕櫚酸、油酸和亞麻酸含量的積累具有正向作用。

3 討論

本研究以不同采烤處理的云煙87上部葉為試材，烘烤中煙葉隨時(shí)間變化和帶莖處理葉片數(shù)量增加而褐變速度減緩，煙葉褐變程度減輕，且4片和6片煙葉帶莖處理的上等煙比例提高，煙葉烤后褐變比例分別減少1.34%和4.22%（絕對(duì)值），與黃浩等（2014）的研究結(jié)果一致，即6片煙葉帶莖烘烤處理效果最佳。煙葉角質(zhì)層主要由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成，角質(zhì)是一種由甘油、羥基脂肪酸及環(huán)氧脂肪酸組成的聚酯聚合物。大量研究表明植物脂肪酸代謝（脂質(zhì)氧化）與角質(zhì)層形成密切相關(guān)，角質(zhì)層可作為研究脂肪酸代謝的一個(gè)參考指標(biāo)（張婧等，2015；陳偉等，2016；楊綠竹等，2020）。表皮角質(zhì)能有效調(diào)控表皮細(xì)胞的滲透性，阻止葉片中水分的非氣孔性散失（徐呈祥等，2021），脂質(zhì)含量和角質(zhì)厚度均發(fā)揮著重要作用。電鏡檢測(cè)結(jié)果表明，在烘烤變黃關(guān)鍵期，正常采烤處理煙葉的角質(zhì)層較厚，帶莖處理煙葉角質(zhì)層厚度隨葉片數(shù)增加而逐漸減少，說(shuō)明帶莖處理對(duì)烘烤中煙葉角質(zhì)蠟質(zhì)具有重要影響。隨著烘烤溫度的逐漸升高，角質(zhì)層對(duì)外界環(huán)境因子的響應(yīng)較敏感，通過(guò)改變角質(zhì)層厚度構(gòu)建有效防御機(jī)制，可減少脅迫因子的作用，延緩煙葉內(nèi)部的水分散失，與張譯丹等（2020）研究烘烤過(guò)程中表皮微觀形態(tài)特征的結(jié)果相一致。

植物角質(zhì)蠟質(zhì)的起始合成在表皮細(xì)胞的質(zhì)體中進(jìn)行，主要由長(zhǎng)鏈脂肪酸組成（Li et al.，2013）。進(jìn)一步對(duì)比4種采烤處理變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)煙葉7種脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)大多呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)，即隨著帶莖處理葉片數(shù)的增加，脂肪酸含量下降，其中棕櫚酸、亞油酸、油酸和亞麻酸含量存在較大差異。說(shuō)明不同采烤處理中脂肪酸總量主要受棕櫚酸、亞油酸、油酸和亞麻酸含量的影響，但不同脂肪酸在烘烤后沉積存在特異性，且可能與脂肪酸各自不同的生理功能有關(guān)。LOX是參與煙葉生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶（羅子敬等，2017），其通過(guò)誘導(dǎo)不飽和脂肪酸中亞麻酸和亞油酸的氧化從而影響葉片的脂質(zhì)氧化進(jìn)程（李君蘭等，2022），帶莖處理煙葉中LOX活性明顯降低。相關(guān)分析結(jié)果表明，角質(zhì)層厚度與脂肪酸總量、LOX活性與油酸和亞麻酸均呈極顯著正相關(guān)，提示油酸、亞麻酸和LOX可能是煙葉脂肪酸代謝的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，帶莖處理在烘烤過(guò)程的濕熱條件下，能減弱LOX活性，煙葉細(xì)胞器和質(zhì)膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或解體的速度減慢，氧化衰老速度緩慢，減少了不飽和脂肪酸油酸、亞麻酸、亞油酸及飽和脂肪酸硬脂酸相對(duì)含量的積累，從而減輕煙葉褐變程度，其中6片煙葉帶莖采烤處理的效果最佳。

煙葉烘烤過(guò)程中發(fā)生的一系列脂肪酸氧化生理生化變化，是復(fù)雜的內(nèi)在分子機(jī)制調(diào)控結(jié)果。在本研究中，煙葉在高溫高濕環(huán)境下脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)情況與其采烤處理密切相關(guān)。選取的6個(gè)基因中，對(duì)比正常采烤處理煙葉，4片與6片煙葉帶莖烘烤處理表達(dá)量均下調(diào)，且趨勢(shì)相似。醛脫氫酶（ALDHs）是一個(gè)超家族蛋白，其依賴(lài)于NAD（P），能氧化許多內(nèi)源依賴(lài)性酶、脂肪族和芳香族醛，生成羧酸（劉美蘭等，2017），基因在帶莖處理變黃期42 ℃烘烤72 h時(shí)顯著下調(diào)。脂氧合酶基因家族（LOXs）參與調(diào)控LOX活性和功能，在調(diào)控脂質(zhì)氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用（胡位榮等，2005），2片、4片和6片煙葉帶莖烘烤處理中基因的相對(duì)表達(dá)量分別降低12.17%、22.59%和56.03%，與LOX活性降低結(jié)果一致。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LTPs）被證明可能有助于角質(zhì)單體通過(guò)細(xì)胞壁向角質(zhì)層的轉(zhuǎn)運(yùn)（李曉佩等，2020），對(duì)比正常采烤處理煙葉，隨著帶莖烘烤處理煙葉葉片數(shù)量的增加，基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，與帶莖處理煙葉烘烤過(guò)程中表皮蠟質(zhì)積累量減少結(jié)果一致，表明該基因在蠟質(zhì)層形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用；MYB轉(zhuǎn)錄因子參與蠟質(zhì)的生物合成與轉(zhuǎn)錄，對(duì)蠟質(zhì)合成途徑中信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控起著十分重要的作用（張敏等，2017），蠟質(zhì)突變體基因（）類(lèi)基因催化反應(yīng)是超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸的最后一步（Zheng et al.，2005），類(lèi)基因通過(guò)等基因的上調(diào)來(lái)激活蠟質(zhì)合成（Dubos et al.，2010）。、和上游調(diào)控因子表達(dá)量在不同采烤處理中變化趨勢(shì)相似，且具有顯著差異，暗示和家族基因在脂肪酸代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

目前煙葉調(diào)制過(guò)程中變黃末期與定色階段的褐變研究，多集中于酚類(lèi)底物在多酚氧化酶作用下迅速轉(zhuǎn)化為大量醌，最終引起褐變的酶促褐變反應(yīng)。在果蔬儲(chǔ)存和加工中脂質(zhì)氧化引起褐變等相關(guān)研究也逐漸成為熱點(diǎn)，除了酚類(lèi)物質(zhì)，糖苷類(lèi)和脂質(zhì)類(lèi)也可能是褐變的底物，但在煙葉烘烤中的影響鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，特別是對(duì)煙葉脂質(zhì)氧化研究甚少。綜上，本研究初步從細(xì)胞生物學(xué)、物質(zhì)代謝和分子層面系統(tǒng)分析不同采烤處理在上部葉脂質(zhì)氧化與煙葉褐變中的差異，可為證明脂質(zhì)氧化參與煙葉褐變提供理論依據(jù)。雖然本研究初步證實(shí)了帶莖采烤處理對(duì)相關(guān)脂肪酸代謝基因有抑制表達(dá)作用，通過(guò)減緩脂質(zhì)氧化影響煙葉的褐變，且效果顯著，但相關(guān)機(jī)制十分復(fù)雜，在分子水平上的證據(jù)仍不充分，后期將通過(guò)目的基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)脂肪酸代謝關(guān)鍵基因在調(diào)控?zé)熑~褐變過(guò)程中的功能和作用機(jī)理做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

脂肪酸代謝是影響煙葉褐變的重要原因之一。6片煙葉帶莖采烤處理在烘烤高溫高濕環(huán)境中能通過(guò)降低煙葉LOX脂質(zhì)氧化活性、減少煙葉脂肪酸積累及抑制相關(guān)脂質(zhì)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控減緩煙葉褐變速度。