瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ原核表達(dá)及其多克隆抗體制備

曹穎穎，李寶瑩，王 婷，梁 亮，運(yùn)晨霞，唐海波，冷 靜

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)/廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西特色實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病證模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530200）

0 引言

【研究意義】樹鼩（）是在進(jìn)化關(guān)系上除靈長類動(dòng)物外與人類最接近的物種（Novacek，1992；Waddell et al.，2001），在生理機(jī)能、生化代謝和基因組等方面均與人類相似，且已證實(shí)樹鼩能被多種人類疾病相關(guān)的病毒感染，在一些特殊人類疾病動(dòng)物模型上具有獨(dú)特優(yōu)勢（Glebe et al.，2003；Yan et al.，2012）。但作為一種新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，樹鼩的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)及專有的商品化檢測試劑匱乏，極大限制了其推廣應(yīng)用。因此，制作樹鼩源性抗體等檢測試劑對促進(jìn)樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的應(yīng)用及研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自Lindblad-Toch等（2011）利用美國Board研究所公布的不完整樹鼩基因組數(shù)據(jù)重構(gòu)29個(gè)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)樹鼩是最接近靈長類的物種以來，滇西亞種樹鼩在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及解剖學(xué)等方面已得到一定研究（Li et al.，2012；Fan et al.，2013），且證實(shí)在構(gòu)建腫瘤模型（Park et al.，2000）、乙肝病毒感染模型（Park et al.，2000）、抑郁癥模型（Fuchs，2005；王靜等，2011）等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在樹鼩專有生物制劑研究方面，干細(xì)胞生長因子、白細(xì)胞介素6、載脂蛋白AV等細(xì)胞因子及蛋白已有表達(dá)純化的研究報(bào)道（王艷等，2013；龍瓊等，2019）。干擾素（Interferon，IFN）是研究最早的一類細(xì)胞因子，具有種屬特異性（Samarajiwa et al.，2009；吳丹等，2013），其家族成員中的IFN-α、IFN-β和IFN-γ已廣泛應(yīng)用于人類病毒性疾病與癌癥治療。IFN屬于多效性細(xì)胞因子，與相應(yīng)受體結(jié)合并激發(fā)細(xì)胞信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)，通過激活多種干擾素刺激基因（Interferon-stimulated gene，ISG）的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用（Osterlund et al，2005；羅嬋等，2015）。針對樹鼩IFN的研究主要有：李明利等（2012）以樹鼩全基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過基因預(yù)測和蛋白建模等方法對樹鼩IFN家族的基本構(gòu)成進(jìn)行了系統(tǒng)分析；丁晨等（2018）通過構(gòu)建原核重組表達(dá)載體克隆表達(dá)出滇西亞種樹鼩IFN-γ，且證實(shí)復(fù)性純化后具有良好的免疫原性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】滇西亞種和瑤山亞種樹鼩是主要分布在我國云南和廣西的2個(gè)樹鼩亞種，相對于滇西亞種樹鼩，瑤山亞種樹鼩的基礎(chǔ)生物學(xué)研究匱乏，其免疫系統(tǒng)研究尚缺少商品化的樹鼩特異性抗體等生物制劑，且不同亞種樹鼩間的遺傳差異和分化程度尚無詳細(xì)數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過RT-PCR擴(kuò)增瑤山亞種樹鼩的和基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)免疫小鼠獲得多克隆抗體并鑒定其反應(yīng)性，以期為進(jìn)一步研究樹鼩病毒感染動(dòng)物模型打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

瑤山亞種樹鼩購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)人工馴化養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中心，麻醉后靜脈采血用于外周血淋巴細(xì)胞分離；昆明小鼠［SCXK（湘）2019-0004］購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查通過（DW20201206-123），嚴(yán)格遵循3R原則。原核載體pET28a（+）由廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉鵬副教授惠贈(zèng)，pcDNA3.1（+）由廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自沃卡威（北京）生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000及限制性內(nèi)切酶H I和I購自賽默飛世爾科技公司；分子克隆相關(guān)試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自美國Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 瑤山樹鼩和基因克隆及真核/原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank已公布的滇西亞種樹鼩和基因序列設(shè)計(jì)引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用TRIzol法提取樹鼩外周血淋巴細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以引物IFN-β-1（5'-ATGTTCTACAGAAGC ATCCT-3'）和IFN-β-2（5'-TCAGTCTCGGAGGTAG TCTA-3'）、IFN-γ-1（5'-ACCAGGGCTACCGATTTG A-3'）和IFN-γ-2（5'-TTATCTGGAAGCTCTCCGAC C-3'）擴(kuò)增包含ORF的瑤山亞種樹鼩和基因片段，然后克隆至pMD18-T載體上，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)測序驗(yàn)證后再以亞克隆引物pcDNA3.1-IFN-β-U（5'-CGGATCCGCCACCATGT TCTACAGAAGCATCC-3'，劃線部分為H I酶切位點(diǎn)）和pcDNA3.1-IFN-β-L（5'-CCTCGAGTCAGT CTCGGAGGTAGTCTAT-3'，劃線部分為I酶切位點(diǎn)）、pcDNA3.1-IFN-γ-U（5'-CGGATCCGCCACC ATGAAGTATACAAGTTATA-3'，劃線部分為H I酶切位點(diǎn)）和pcDNA3.1-IFN-γ-L（5'-CCTCGAGTT ATCTGGAAGCTCTCCGAC-3'，劃線部分為I酶切位點(diǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的條帶，采用限制性內(nèi)切酶H I和I在37 ℃下酶切目的條帶和質(zhì)粒pcDNA3.1（+），酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-（圖1-A）和pcDNA3.1-（圖1-B）；經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，將得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）進(jìn)行真核表達(dá)。原核表達(dá)載體（圖1-C和圖1-D）的構(gòu)建同真核表達(dá)載體。在基因測序完成后利用DNAStar對IFN-β和IFN-γ氨基酸序列進(jìn)行比對，在不影響蛋白主要免疫活性及免疫原性的前提下剔除掉疏水氨基酸序列，最終設(shè)計(jì)引物如下，pET28a-IFN-β1（5'-CGGATCC ATGGACTGCCTCAAGGACCGTAT-3'，劃線部分為H I酶切位點(diǎn)）和pET28a-IFN-β2（5'-CCTCGAG ACAGCTGCTGTACTCCTTGG-3'，劃線部分為I酶切位點(diǎn)）、pET28a-IFN-γ1（5'-CGGATCCATGCCA TTTATGAAAGAAGTACA-3'，劃線部分為H I酶切位點(diǎn)）和pET28a-IFN-γ2（5'-CCTCGAGTCTGGA AGCTCTCCGACCTC-3'，劃線部分為I酶切位點(diǎn)），構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-和pET28a-轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)（唐海波等，2014；趙祥秀等，2020）。

1.2.2 重組蛋白表達(dá)純化及鑒定 挑取轉(zhuǎn)化了原核表達(dá)載體pET28a-和pET28a-的菌株單克隆，接種至含100 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床（220 r/min）培養(yǎng)至OD約0.6，取出1 mL留樣保存，其余加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌體，取出1 mL留樣保存，剩余菌體進(jìn)行超聲波破碎，破碎后4 ℃下12000 r/min離心15 min分離上清液和沉淀，同樣取適量上清液和沉淀留樣保存。將上述每步留取的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的表達(dá)效果及表達(dá)形式。鑒定后的融合蛋白采用含1、2、3和4 mol/L尿素的洗滌液進(jìn)行洗滌，SDS-PAGE電泳摸索最佳包涵體洗滌條件，洗滌獲得的包涵體以梯度遞降尿素濃度透析的方法復(fù)性，-80 ℃保存?zhèn)溆茫舷让鞯龋?010）。Western blotting檢測鑒定融合蛋白：純化復(fù)性后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以鼠抗His標(biāo)簽抗體為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。

1.2.3 抗體制備及反應(yīng)性檢測 將弗氏佐劑與純化復(fù)性后的融合蛋白（IFN-β和IFN-γ）乳化后免疫昆明小鼠（100 μg/只），免疫周期為第1、7、28、35和45 d，免疫方式為背部皮下多點(diǎn)注射。首次免疫用弗氏完全佐劑與融合蛋白乳化，第2、3、4和5次免疫則用弗氏不完全佐劑與融合蛋白乳化。第5次免疫后1周經(jīng)眼球采血并分離血清，通過Western blotting和IFA檢測制備獲得多克隆抗體的反應(yīng)性。Western blotting檢測以不同稀釋度的抗IFN-β和IFN-γ多克隆抗體為一抗，未免疫小鼠血清為陰性對照，堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體為二抗，BCIP/NBT顯色觀察。間接免疫熒光（IFA）檢測采用轉(zhuǎn)染24 h后的單層BHK-21細(xì)胞，按1∶100分別稀釋制備的抗IFN-β、IFN-γ多克隆抗體及未免疫小鼠陰性血清為一抗，以1∶300稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ基因克隆結(jié)果

以瑤山亞種樹鼩外周血淋巴細(xì)胞為材料提取總RNA，Oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，分別擴(kuò)增獲得564 bp的基因片段（圖2-A）及501 bp的基因片段（圖2-B），與預(yù)期的目的基因片段長度相符。將和基因克隆至pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取少量轉(zhuǎn)化菌株涂布于LA培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得對應(yīng)的目的條帶（圖2-C和圖2-D），表明和基因已成功克隆至pMD18-T載體上。對陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank已公布滇西亞種樹鼩基因（XM-006140329）、基因（KC905628）的核苷酸序列相似性分別為99.6%和100.0%?；诤突虻暮塑账嵝蛄邢嗨菩詷?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3和圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與嚙齒類大鼠、小鼠的IFN相比，樹鼩的IFN-β和IFN-γ更接近人類IFN。

2.2 瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ真核/原核表達(dá)載體

以添加有酶切位點(diǎn)的亞克隆引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒pMD18-T-和pMD18-T-，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物再次與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽性克隆測序分析正確后分別酶切pcDNA3.1（+）和亞克隆陽性質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，膠回收帶有酶切位點(diǎn)的、基因片段及酶切后的線性pcDNA3.1（+）空載體，用T4 DNA連接酶將目的基因片段連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）上，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果（圖5）顯示均為陽性質(zhì)粒。經(jīng)測序分析，瑤山亞種樹鼩和基因在真核表達(dá)載體中讀碼正確，說明真核表達(dá)載體pcDNA3.1-和pcDNA3.1-構(gòu)建成功。原核表達(dá)載體構(gòu)建方式同真核表達(dá)載體，分別命名為pET-28a-和pET-28a-。

2.3 融合蛋白IFN-β和IFN-γ表達(dá)純化及鑒定結(jié)果

以原核表達(dá)載體pET-28a-和pET-28a-轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以30 ℃下0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h獲得的融合蛋白表達(dá)量最高（圖6-A和圖6-B）。為驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)方式，經(jīng)超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在細(xì)胞沉淀中檢測到融合蛋白IFN-β和IFN-γ，說明融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)（圖6-C和圖6-D）。以含不同濃度尿素的洗滌液洗滌包涵體進(jìn)行初步純化，結(jié)果（圖7）顯示，包涵體經(jīng)含1、3和4 mol/L尿素的洗滌液洗滌后，仍有較多雜蛋白存在于目的蛋白中；而經(jīng)含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌后可獲得純度相對較高的融合蛋白，故確定2 mol/L尿素為最佳包涵體洗滌濃度。由于誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的pET-28a（+）系統(tǒng)上帶有多聚組氨酸（6×His）標(biāo)簽，因此可利用攜帶His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果表明，純化的融合蛋白與預(yù)測的目的蛋白基本一致（圖8），說明瑤山亞種樹鼩和基因在原核表達(dá)載體中正確表達(dá)。

2.4 多克隆抗體Western blotting檢測結(jié)果

以復(fù)性后的融合蛋白IFN-β和IFN-γ與佐劑乳化后分別免疫昆明小鼠，第5次免疫后1周采集血液分離血清，所得血清即為多克隆抗體。Western blotting檢測結(jié)果（圖9）顯示，制備獲得的IFN-β多克隆抗體在稀釋度為1∶8000時(shí)仍能與0.1 μg的融合蛋白IFN-β結(jié)合，IFN-γ多克隆抗體在稀釋度為1∶8000時(shí)仍能與1.0 μg的融合蛋白IFN-γ結(jié)合，均具有良好的反應(yīng)性。

2.5 多克隆抗體IFA檢測結(jié)果

通過IFA進(jìn)一步驗(yàn)證制備獲得的多克隆抗體與IFN-β和IFN-γ的結(jié)合能力，結(jié)果（圖10）顯示，經(jīng)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-和pcDNA3.1-轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞分別與制備獲得的IFN-β和IFN-γ多克隆抗體共孵育后，均能觀察到特異的綠色熒光，而與陰性血清共孵育的轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞未觀察到綠色熒光。

3 討論

IFN作為機(jī)體抵御病毒感染的第一道防線，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抑制細(xì)胞增殖等多重作用（Kotenko et al.，2003；Brand et al.，2005；Osterlund et al.，2005；Ank et al，2006；李聰聰?shù)龋?021）。樹鼩是一種外形與松鼠類似而遺傳上最接近靈長類的動(dòng)物，在病毒感染模型方面相對于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有著不可替代的作用。本研究通過RT-PCR擴(kuò)增獲得瑤山亞種樹鼩的和基因片段（包含整個(gè)ORF），遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)瑤山亞種樹鼩的（I型）和（II型）基因與人類、食蟹猴的基因處于更接近的分支上，進(jìn)一步驗(yàn)證其進(jìn)化上的優(yōu)勢。此外，樹鼩能被多種與人類疾病有關(guān)的病毒感染（Xu et al.，2007；Li et al.，2008）。與靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，樹鼩具有形體小、繁殖快及成本低等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)研究中的價(jià)值已受到越來越多的關(guān)注。迄今為止，科學(xué)家們對樹鼩的解剖學(xué)、生殖生理學(xué)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)及動(dòng)物模型等已進(jìn)行大量研究（Eichmann and Holst，1999；Fuchs and Flügge，2002；Pradidarcheep et al.，2003；Norton et al.，2010）。在病毒學(xué)研究方面，樹鼩已成為研究肝炎病毒、輪狀病毒等病毒感染及致病機(jī)制的理想動(dòng)物模型（Collins et al.，2007；Norton and Siegwart，2013）。近年來，針對滇西亞種樹鼩的基礎(chǔ)生物學(xué)研究較深入，但樹鼩作為病毒感染動(dòng)物模型其免疫系統(tǒng)、免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞因子的研究相對匱乏，且市面上缺乏樹鼩特異性抗體等生物制劑，致使流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)等研究難以開展，嚴(yán)重限制了樹鼩作為病毒感染動(dòng)物模型在相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ蛋白，且證實(shí)獲得的融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。原核表達(dá)載體pET-28a（+）攜帶有His標(biāo)簽，為后期的蛋白純化及檢測提供了方便。瑤山亞種樹鼩和基因長度分別為564和501 bp，通過預(yù)測瑤山樹鼩IFN-β和IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：IFN-γ蛋白N端富含疏水性氨基酸，IFN-β蛋白N端和C端均富含疏水性氨基酸，可能與IFN的分泌功能有關(guān)。在不影響蛋白主要免疫活性及免疫原性的前提下，本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)截去N端疏水性氨基酸，通過原核表達(dá)載體成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白IFN-γ，但未表達(dá)出融合蛋白IFN-β。為此，在重新設(shè)計(jì)引物時(shí)同時(shí)去除N端和C端疏水性氨基酸，最終成功通過原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白IFN-β，且免疫原性及活性完好。由于富含疏水性氨基酸肽段在原核載體中不易表達(dá)，因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)在保留免疫活性及免疫原性的基礎(chǔ)上應(yīng)盡可能去除富含疏水性氨基酸肽段的表達(dá)。

在融合蛋白純化方面，本研究嘗試在變性條件下采用Ni-NTA進(jìn)行純化，但發(fā)現(xiàn)融合蛋白IFN-β和IFN-γ均未能被吸附在樹脂上，大部分融合蛋白隨穿透液流出，可能是融合蛋白以包涵體形式表達(dá)時(shí)其構(gòu)象將6×His標(biāo)簽包裹在內(nèi)部，而His標(biāo)簽在8 mol/L尿素變性條件下仍暴露不夠充分（趙慧等，2009）。孟先明等（2010）曾報(bào)道，在Ni-NTA純化不理想時(shí)可嘗試通過采用含有不同濃度尿素的洗滌液充分洗滌包涵體以獲得較高純度的目的蛋白。為此，本研究將0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h的重組菌株在液氮反復(fù)凍融3次后以超聲波裂解菌體，由于大部分菌體自身蛋白為可溶性蛋白，通過離心可去除絕大部分可溶性蛋白，實(shí)現(xiàn)包涵體與可溶性蛋白分離，收集獲得的包涵體中雜蛋白含量較少。包涵體洗滌液中含有TritonX-100，可將吸附在包涵體表面的一些不溶雜蛋白除去，再以含不同尿素濃度的洗滌液進(jìn)行洗滌，結(jié)果顯示，經(jīng)含l、3和4 mol/L尿素的洗滌液洗滌后SDS-PAGE電泳的雜帶還是相對較多，而以含2 mol/L尿素的洗滌液洗滌后可獲得純度相對較高的融合蛋白，且損失較少，故確定包涵體洗滌液中的尿素最佳濃度為2 mol/L。融合蛋白IFN-β和IFN-γ經(jīng)乳化后免疫小鼠，成功制備獲得多克隆抗體，Western blotting和IFA檢測結(jié)果均顯示，制備獲得的2個(gè)多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性，可為構(gòu)建樹鼩抗感染模型及開展抗病毒作用機(jī)制研究等提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

通過原核表達(dá)系統(tǒng)可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得瑤山亞種樹鼩IFN-β和IFN-γ，復(fù)性后的融合蛋白具有良好的反應(yīng)性和免疫原性，免疫小鼠制備獲得的多克隆抗體反應(yīng)性良好且抗體效價(jià)高，可作為檢測工具用于研究瑤山亞種樹鼩病毒感染模型。