煙草葉斑病新病原分離鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定

楊江敏，桑維鈞*，孔 菲，李昊熙，盧燕回，顧恒鋒，首安發(fā)，甘國(guó)喜，彭麗娟，楊茂發(fā)

（1貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2中國(guó)煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司科技處，廣西南寧 530022；3廣西壯族自治區(qū)煙草公司賀州市公司，廣西賀州 542800）

0 引言

【研究意義】煙草（L.）隸屬茄科（Solanaceae）煙草屬（），是卷煙生產(chǎn)的主要原料（張希等，2021）。作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和增加煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入具有重要意義。廣西位于我國(guó)西南部，地處中、南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，熱量豐富，雨量充沛，各地年平均氣溫16.5～23.1 ℃，是我國(guó)煙草生產(chǎn)主要省區(qū)，其主產(chǎn)區(qū)為百色市、賀州市和河池市。葉斑病是煙草上最重要的病害，多數(shù)由真菌侵染引起，主要發(fā)生在煙葉成熟期，病菌主要通過(guò)傷口和自然孔口侵染葉片，煙葉組織被侵染發(fā)病后，病菌在組織上產(chǎn)生大量病原子實(shí)體，通過(guò)風(fēng)、雨或氣流傳播，引起病原菌的再次侵染，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量與烘烤質(zhì)量（張思聶等，2021），而對(duì)病原菌種類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是了解農(nóng)作物病害流行規(guī)律，并有針對(duì)性地制定有效防控措施的前提?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】廣西煙草病害的系統(tǒng)鑒定始于20世紀(jì)90年代初（黃福新，1993）。截至目前，有關(guān)廣西煙區(qū)煙草侵染性病害的研究主要集中在煙草葉斑病、煙草病毒病、煙草黑脛病和煙草青枯病等（蒙姣榮等，2012；譚海文，2012；王五權(quán)等，2015），其中的煙草葉斑類病害包括赤星病、炭疽病和蛙眼病等國(guó)內(nèi)其他煙區(qū)的常見(jiàn)病害（陳永德和覃春華，2010）。然而，受廣西煙草種植地區(qū)調(diào)整、耕作栽培制度及氣候條件變化等因素的影響，當(dāng)?shù)責(zé)煵莶『Τ尸F(xiàn)出種類復(fù)雜多樣、新病害不斷出現(xiàn)、危害損失加重、防控難度加大等趨勢(shì)（譚海文，2012）。在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定病原菌的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌特定基因進(jìn)行測(cè)序分析，可增加病害鑒定的準(zhǔn)確性（Taylor et al.，2000）。譚海文等（2012）在病害調(diào)查中首次報(bào)道由多主棒孢（）引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病，同時(shí)在關(guān)國(guó)經(jīng)等（2000）形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上首次通過(guò)rDNA-ITS對(duì)烤煙棒孢霉葉斑病的病原菌進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了補(bǔ)充研究，明確棒孢霉葉斑病在高溫多雨季節(jié)易暴發(fā)與病原菌喜溫好濕的特性有關(guān)。廖庭（2015）采用形態(tài)特征結(jié)合分子鑒定將由莖點(diǎn)霉引起的廣西煙草新葉斑病害的病原菌鑒定為，同時(shí)測(cè)定了該病原菌的生物學(xué)特性，為針對(duì)廣西煙草莖點(diǎn)霉葉斑病的防治研究提供了理論參考。真菌隸屬子囊菌門(mén)（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢菌目（Pleosporales），亞隔孢殼科（Didymellaceae）。能引起巴西大豆（）豆莢炭疽病（Crous et al.，2019）和菊科雜草野茼蒿［（Benth.）S.Moore］葉斑?。℉e et al.，2021）。2020年，Cafà等通過(guò)基因組測(cè)序獲得第1個(gè)基因組序列，為真菌比較基因組學(xué)研究提供了新的基因信息資源?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2021年3—6月廣西煙草生長(zhǎng)季節(jié)，本課題組在賀州煙區(qū)開(kāi)展病害調(diào)查過(guò)程中在煙草品種K326上發(fā)現(xiàn)一種癥狀明顯不同于赤星病和靶斑病等常見(jiàn)病害的煙草葉斑病，對(duì)于該病害病原菌的種類以及相關(guān)信息尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用組織分離法對(duì)從廣西賀州煙區(qū)采集的具明顯葉斑病癥狀的煙草葉片組織進(jìn)行病原菌分離純化、致病性測(cè)定及培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察，結(jié)合多基因序列聯(lián)合分析［ITS、28S核糖體RNA基因（LSU）、β-微管蛋白基因（）和RNA聚合酶亞基基因（）］對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并研究不同溫度、培養(yǎng)基、pH、碳氮源和光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響，以明確病原菌的分類地位和生物學(xué)特性，為病害的及時(shí)防控和后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 分別從賀州市鐘山縣（東經(jīng)111°30′，北緯24°52′）和富川瑤族自治縣（東經(jīng)111°16′，北緯24°49′）煙草品種K326上采集具明顯葉斑病癥狀的煙草葉片共70份，通過(guò)顯微鏡檢及病原菌分離培養(yǎng)，得到純化菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA，青島海博生物技術(shù)有限公司）；玉米汁瓊脂培養(yǎng)基（CMA，北京索萊寶科技有限公司）；察氏培養(yǎng)基（CDA，北京索萊寶科技有限公司）；燕麥培養(yǎng)基（OA，北京索萊寶科技有限公司）；番茄汁瓊脂培養(yǎng)基（TomA，自配）；煙葉汁瓊脂培養(yǎng)基（TobA，自配）；南瓜汁瓊脂培養(yǎng)基（PA，自配）；水瓊脂培養(yǎng)基（WA，自配）。自配培養(yǎng)基配方參照方中達(dá)（1998）的方法等量配比，所有培養(yǎng)基使用高壓蒸汽滅菌鍋（致微儀器有限公司）經(jīng)121 ℃滅菌30 min，倒至9 cm的一次性培養(yǎng)皿中備用。

1.1.3 接種材料 生長(zhǎng)至5～6葉期的盆栽K326品種健康煙株。

1.2 病原菌的分離

依據(jù)方中達(dá)（1998）的組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。操作步驟：用經(jīng)火焰殺菌冷卻后的手術(shù)刀從葉片病健交界處切取大小約5 mm的病組織，經(jīng)70%酒精消毒處理10 s，再由0.1%升汞溶液浸泡3～5 min，用無(wú)菌水沖洗3次后放在無(wú)菌濾紙上吸干水分，將組織接于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取組織周圍的白色菌絲進(jìn)行純化。

1.3 病原菌致病性測(cè)定

將純化得到的病原菌菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d。在超凈工作臺(tái)上，用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器打取菌碟，將菌碟左右對(duì)稱無(wú)傷接種于煙株第4～6片葉上，以接種空白PDA碟為對(duì)照，每盆接3片葉。將接種葉片用自封袋套袋，盆壁貼標(biāo)簽，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，保持濕度75%以上，5 d后觀察葉片發(fā)病情況，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌分離，通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證病原菌。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照郭強(qiáng)等（2019）的方法，將菌株分別接種于PDA和OA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d后，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、菌絲疏密程度等，挑取菌絲體制作玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將分離菌株接種于帶有滅菌半透膜的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5 d后，收集新鮮菌絲，參照真菌DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］的步驟進(jìn)行病原真菌DNA提取。使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3'）（江艷等，2018）；TUB2Fd（5'-GTBCACCTYCA RACCGGYCARTG-3'）/TUB4Rd（5'-CCRGAYTGR CCRAARACRAAGTTGTC-3'）（Wondenberg et al.，2009）；RPB2-5F2（5'-GGGGWGAYCAGAAGAAGG C-3'）/fRPB2-7cR（5'-CCCATRGCTTGYTTRCCC AT-3'）（Sung et al.，2007）；LROR（5'-GTACCCGCT GAACTTAAGC-3'）/LR7（5'-TACTACCACCAAGAT CT-3'）（Hou et al.，2020）對(duì)菌株的rDNA-ITS序列及、、LSU基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照Chen等（2015）、江艷等（2018）的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

從GenBank中收集已知的其他相關(guān)病原菌的序列信息，通過(guò)MAFFT v.7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）進(jìn)行序列比對(duì)，使用TrimAl v.1.3進(jìn)行序列剪切，以MEGA 7.0將剪切后的序列按照ITS、LSU、、的順序進(jìn)行拼接，應(yīng)用IQ-TREE v.1.6.12將拼接后的序列采用最大似然法（Bootstrap值為1000次）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 使用直徑5 mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)3 d的菌落邊緣打取菌碟，將菌碟的菌絲面朝下接種于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)（劉利佳等，2021）。每處理3次重復(fù)，7 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，下同。

1.5.2 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將5 mm的菌碟菌絲面朝下接種于8種不同培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)（何世芳等，2021）。

1.5.3 不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代培養(yǎng)基中的蔗糖；同理，以等量的蛋白胨、硝酸銨、牛肉浸粉、氯化銨、尿素、甘氨酸和丙氨酸替代培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制備不同碳、氮源培養(yǎng)條件（茍攀寧等，2021）。

1.5.4 不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用1% HCl和1% NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為8個(gè)不同梯度（4、5、6、7、8、9、10和11）（姚錦愛(ài)等，2021）。

1.5.5 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將5 mm的菌碟接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于3種光照條件（全光照、全黑暗、12 h光暗交替）的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

材料計(jì)劃應(yīng)詳盡并略有富余，一般應(yīng)為計(jì)劃用量的102%，數(shù)量較少的關(guān)鍵管件應(yīng)加倍計(jì)劃，計(jì)劃應(yīng)周密、全面，必須有復(fù)核手續(xù)，避免出現(xiàn)因材料短缺造成停工、窩工現(xiàn)象，確保工程順利施工。

1.5.6 病原菌菌絲致死溫度測(cè)定 將5 mm的菌碟放入裝有1 mL無(wú)菌水的1.5 mL無(wú)菌離心管中，分別置于40、45、50、55、60和65 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min（先預(yù)熱1 min），取出后立即放入裝有常溫水的燒杯中冷卻；將處理后的菌碟接于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d，確定菌絲致死溫度，以1 ℃為溫度梯度，重復(fù)上述試驗(yàn)，最終確定致死溫度范圍（徐輝等，2020）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2010求取試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及構(gòu)建柱形圖，采用SPSS Statistics 26的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

病害主要發(fā)生在烤煙成熟期，病原菌侵染葉片形成病斑。田間癥狀表現(xiàn)為病斑不規(guī)則或近橢圓形，中央灰白色，邊緣棕褐色且有黃綠色暈圈（圖1）。隨著病害的加重，病斑不斷擴(kuò)大，易破裂形成穿孔，表面產(chǎn)生小黑點(diǎn)。

圖1 煙草葉斑病病害田間癥狀Fig.1 Field symptoms of tobacco leaf spot disease

2.2 病原菌分離純化結(jié)果

采用組織分離法對(duì)病樣進(jìn)行病原菌分離，純化獲得7株菌株，其中，來(lái)自鐘山縣菌株4株，編號(hào)分別為GHZS80、GHZS21、GHZS8和GHZS3；來(lái)自富川縣菌株3株，編號(hào)分別為GHFC63、GHFC54和GHFC2。

2.3 病原菌致病性測(cè)定結(jié)果

健康盆栽煙株在無(wú)傷接種病原菌3 d后，接種部位開(kāi)始變黃，周圍長(zhǎng)出白色菌絲；接種7 d后，水漬狀病斑出現(xiàn)，逐漸變?yōu)楹稚▓D2-A），與田間自然發(fā)病癥狀相似，對(duì)照未表現(xiàn)癥狀（圖2-B）。對(duì)發(fā)病的葉片進(jìn)行分離觀察，得到與原接種菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征一致的病原菌，且7株菌株間的致病力無(wú)明顯差異。依據(jù)柯赫氏法則，確定接種菌為煙草葉斑病致病菌。

圖2 煙草葉斑病病原菌對(duì)煙草品種K326的致病性測(cè)定Fig.2 Pathogenicity determination of pathogen of tobacco leaf spot to K326 tobacco variety

2.4 病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征描述

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)5 d后菌落呈現(xiàn)出同心圓，正面內(nèi)層菌落深灰色，向外棕黃色，最外層黃膚色，菌絲較緊密，氣生菌絲稀疏，平板背面表現(xiàn)為中間黑褐色，向外棕褐色，邊緣淺灰色（圖3-A）；培養(yǎng)25 d后菌落變黑色（圖3-C）。在OA培養(yǎng)基上菌落深灰色，菌絲稠密，氣生菌絲較PDA上發(fā)達(dá)（圖3-B）。分生孢子器黑色，單房近球形，平均大小為109.300～440.330 μm×94.280～318.250 μm（n=8），產(chǎn)孢器上具喙?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（大小約為169.130 μm×31.953 μm）（圖3-D）；分生孢子無(wú)色，近似橢圓形，無(wú)隔膜，平均大小為3.520～3.830 μm×1.840～2.230 μm（n=80）（圖3-E）；菌絲具分支有橫隔，菌絲末端或中央分化出無(wú)色鏈珠狀膨大細(xì)胞（圖3-F）。

圖3 病原菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征Fig.3 Culture traits and morphological characteristics of pathogens

2.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將7株菌株的ITS、LSU、和序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理和整合后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)（表1）。從GenBank中下載與7株菌株同源性較高以及同屬內(nèi)其他種的代表菌株的ITS、、、LSU序列（表2），以CBS 108.49作外群聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4）顯示，7株菌株與LFN0148和YTH-12以100%的支持率聚為一支，能明顯與其他種區(qū)分。對(duì)7株菌株的ITS、LSU、和序列信息進(jìn)行BLAST比較分析，結(jié)果表明，各菌株在基因序列上未存在差異。菌株GHZS80、GHZS21、GHZS8、GHZS3、GHFC63、GHFC54、GHFC2與菌株LFN0148和YTH-12相比，ITS、LSU、和的同源性均達(dá)100%。因此，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，將7株菌株鑒定為。

圖4 基于ITS、LSU、RPB2和TUB2構(gòu)建的煙草葉斑病病原菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of tobacco leaf spot pathogens based on ITS，LSU，RPB2 and TUB2

表1 菌株登錄號(hào)Table 1 Strain login ID

表2 從GenBank下載的相關(guān)菌株序列及信息Table 2 Sequence and information of relative fungal strains downloaded from GenBank

2.6 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

圖5 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different temperatures on mycelium growth of pathogens

2.6.2 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在CMA、CDA、TomA、TobA和PA 5種培養(yǎng)基上，菌株GHZS8的生長(zhǎng)速度最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著；菌株GHZS8的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PA，菌株GHZS80、GHZS21、GHZS3、GHFC63、GHFC54和GHFC2的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基均為PDA（圖6）。綜合各方面因素，7株病原菌的適宜培養(yǎng)基為PDA、OA和PA培養(yǎng)基。

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different media on mycelium growth of pathogens

2.6.3 碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 7株菌株的最適碳源均為可溶性淀粉，且菌株GHZS8的生長(zhǎng)速度最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著；在以乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上菌株GHZS3生長(zhǎng)最快，菌株GHFC63生長(zhǎng)最慢；菌株GHZS8在除乳糖外的所有碳源條件下均表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)速度均最快，與其余6株菌株的菌落直徑差異顯著（圖7）。

圖7 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different carbon sources on mycelium growth of pathogens

2.6.4 氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，菌株GHZS21、GHZS3和GHFC2的生長(zhǎng)速度最快，優(yōu)于在其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑；以牛肉浸粉為唯一氮源時(shí)，菌株GHZS80、GHZS8、GHFC63和GHFC54的生長(zhǎng)速度最快，優(yōu)于在其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑；菌株GHZS8在分別以蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、硝酸銨、牛肉浸粉和尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度均顯著快于其他菌株，在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，說(shuō)明氯化銨為菌株GHZS8生長(zhǎng)的最不適宜氮源（圖8）。

圖8 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth of pathogens

2.6.5 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 7株菌株在pH 4～pH 11內(nèi)均能生長(zhǎng)，但最適pH不盡相同，其中，菌株GHFC54和GHFC2最適生長(zhǎng)pH為6，菌株GHZS80、GHZS3和GHFC63最適生長(zhǎng)pH為7，菌株GHZS21最適生長(zhǎng)pH為8，菌株GHZS8最適生長(zhǎng)pH為9；當(dāng)pH為4時(shí)，7株菌株的生長(zhǎng)均受到明顯抑制，但菌株GHZS8的生長(zhǎng)顯著快于其他菌株（圖9）。

圖9 不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of different pH on mycelium growth of pathogens

2.6.6 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 7株菌株均在全光照條件下生長(zhǎng)最快，全光照處理對(duì)菌株GHFC2菌絲生長(zhǎng)的影響較其余2種處理明顯；光暗交替處理則對(duì)菌株GHFC54生長(zhǎng)的影響較大；在全黑暗條件下菌株GHZS3生長(zhǎng)最慢，與其他菌株的菌落直徑差異顯著（圖10）。

圖10 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effects of different light conditions on mycelium growth of pathogens

2.7 病原菌的致死溫度測(cè)定結(jié)果

7株菌株經(jīng)45 ℃水浴處理10 min后在PDA培養(yǎng)皿上仍能生長(zhǎng)，經(jīng)50、55、60和65 ℃水浴處理10 min后菌株未生長(zhǎng)。以1 ℃為梯度在45～50 ℃內(nèi)對(duì)病原菌菌株進(jìn)行水浴處理，結(jié)果顯示7株菌株在50 ℃水浴處理10 min后菌絲不再生長(zhǎng)，表明菌株的致死溫度為50 ℃水浴10 min。

3 討論

本課題組在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)廣西賀州市鐘山縣和富川縣煙草品種K326上存在一種真菌性葉斑病害，田間癥狀表現(xiàn)為病斑不規(guī)則或近橢圓形，中央灰白色，邊緣棕褐色且有黃綠色暈圈，受害后期病斑易破裂形成穿孔，表面產(chǎn)生小黑點(diǎn)，與常見(jiàn)煙草葉部病害的癥狀有所不同。通過(guò)形態(tài)特征結(jié)合多基因序列分析（ITS、LSU、和），將病原菌鑒定為，這是由引起煙草葉斑病在國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道。2019年，Crous等報(bào)道在巴西是一種植物致病真菌，可引起大豆豆莢炭疽病，隨后He等（2021）報(bào)道在我國(guó)廣西百色市可引起菊科雜草野茼蒿葉斑病，證實(shí)的非寄主專一性。菊科是煙田種類最多的雜草之一（羅戰(zhàn)勇等，2007），野茼蒿是否可作為在煙田中傳播病原體的橋梁以及對(duì)除煙草品種K326以外的其他品種煙草的致病性還有待驗(yàn)證。

本研究中在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的正面菌落特征為最內(nèi)層深灰色，向外棕黃色，最外層黃膚色，與大豆豆莢炭疽病的致病菌株LFN0148和野茼蒿葉斑病的致病菌株YTH-12在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征存在一定差異，菌株LFN0148表現(xiàn)出正面中央黑褐色，邊緣醋灰色，菌株YTH-12表現(xiàn)為正面內(nèi)圈灰白色，外圈橙黃色，產(chǎn)生上述特征差異的原因可能與地域、不同寄主以及培養(yǎng)周期有關(guān)。本研究中的分生孢子器、分生孢子大小以及菌絲等的形態(tài)特征與Crous等（2019）和He（2021）等的描述基本吻合。本研究在前人對(duì)形態(tài)特征描述的基礎(chǔ)上增加了對(duì)膨大細(xì)胞的描述，并對(duì)產(chǎn)孢器上的喙?fàn)罱Y(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)量，大小約為169.130 μm×31.953 μm。

目前，尚無(wú)關(guān)于生物學(xué)特性方面的報(bào)道。本研究對(duì)7株分離菌株的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，7株菌株在10～35 ℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，菌絲的最低致死溫度為50 ℃水浴10 min，病原菌的生長(zhǎng)溫度范圍較廣，適宜菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍為25～28 ℃。賀州市為典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，日照充足，土壤肥沃（莫水英，2020），4—7月的月平均溫度為18～34 ℃，年平均相對(duì)濕度在78%左右，年均降水量1535.6 mm，病原菌的生長(zhǎng)特性與該地區(qū)的氣候與環(huán)境條件相適宜，因此由引起的煙草葉斑病發(fā)生流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)較高。菌株GHFC54和GHFC2生長(zhǎng)最適pH為6；菌株GHZS3、GHZS80和GHFC63生長(zhǎng)最適pH為7；菌株GHZS21生長(zhǎng)最適pH為8；菌株GHZS8生長(zhǎng)最適pH為9，表明喜好在弱酸性至弱堿性環(huán)境條件下生長(zhǎng)。7株菌株在全光照條件下生長(zhǎng)最快，最適碳源為可溶性淀粉，菌株GHZS21、GHZS3和GHFC2的最適氮源為蛋白胨，菌株GHZS80、GHZS8、GHFC63和GHFC54的最適氮源為牛肉浸粉，說(shuō)明同一病原菌的生物學(xué)特性在不同分離菌株上存在差異。本研究初步探討了不同溫度、pH、光照、培養(yǎng)基以及不同碳氮源處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，存在一定的局限性，但對(duì)引起煙草葉斑病的發(fā)生和防治提供了理論參考，下一步研究工作將聚集在的侵染機(jī)制以及病害防治等方面。

4 結(jié)論

引起廣西賀州煙區(qū)煙草葉斑病的病原菌為，最適菌絲生長(zhǎng)的溫度為25～28 ℃，菌絲的最低致死溫度為50 ℃水浴10 min，該菌喜好在弱酸性至弱堿性、陽(yáng)光充足且營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境條件下生長(zhǎng)。根據(jù)病原菌的生物學(xué)特性，在煙草生產(chǎn)過(guò)程中可通過(guò)控制煙草種植密度、加強(qiáng)田間管理以及采取化學(xué)、生物防治手段對(duì)由引起的煙草葉斑病進(jìn)行綜合防控。