早產(chǎn)兒B303 亞型鑒定及家系調(diào)查分析

徐子恒，王蓮慧，萬貝妮，徐秀云，劉昕

（江西省兒童醫(yī)院輸血科，江西 南昌 330006）

ABO 血型系統(tǒng)是最具臨床意義的血型系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)除了A、B、AB、O 四種表型外，還存在一些罕見且有特殊意義的ABO 亞型[1-2]。 常規(guī)血清學試驗方法易造成ABO 亞型的漏檢或誤判， 從而給臨床輸血工作帶來極大的安全隱患。 臨床上，因基因變異使紅細胞上B 抗原數(shù)量較正常減弱的特異性的血型稱為B 亞型， 依據(jù)血清學的不同特征，B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel、Bend，以及弱表型的Bw亞型[3]。 目前，已經(jīng)檢測出的B 亞型基因有48 個（根據(jù)國際輸血協(xié)會ISBT 統(tǒng)計，截止于2017 年10月23 日，之后系統(tǒng)未再更新），僅B3 亞型等位基因就有13 種[4-5]。 在嬰幼兒、新生兒、早產(chǎn)兒群體中， 由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善存在生理性的紅細胞表面抗原表達偏弱， 通常常規(guī)血清學方法難以準確鑒定亞型[6-8]。 隨著基因檢測技術(shù)在輸血領域的應用，越來越多的ABO 疑難血型得到準確鑒定?，F(xiàn)就我院在早產(chǎn)兒群體中發(fā)現(xiàn)的1 例罕見B303亞型的血型鑒定分析過程報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 患兒，女，22 d，孕29+5 周出生早產(chǎn)兒，G5P3， 2021 年8 月因黃疸十余天入我院，到我科進行新生兒溶血病項目的檢測。 血型檢測時發(fā)現(xiàn)正定型B 抗原減弱（1+W），懷疑血型為ABO 亞型，進一步進行血型基因檢測分析。 同時在征得其家屬知情同意的情況下采集患兒父親、 母親的血液標本備查。

1.2 試劑與儀器 抗-A、抗-B、抗-H 試劑和ABO標準紅細胞來自上海血液生物醫(yī)藥責任有限公司(批 號 分 別 為20210615、201210615、20210114 和20205335), ABO 血型鑒定微柱凝膠卡由長春博迅生物有限公司提供（批號20200910），基因組DNA提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品(批號S7114), ABO-B基因分型試劑盒為天津秀鵬公司提供 (批號K202101001)，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。血型專用離心機(日本久保田公司KA-2200 型)、高速離心機(德國Eppendorf5430 型)、血型血清學用離心機(TD-3A 型， 長春博研科學儀器公司)、PCR 擴增儀(Bio-Rad C1000 型)、 凝膠成像系統(tǒng) (美國伯樂Bio-Rad GelDocXR+型）, 電泳儀 (六一儀器廠DYY-8C 型)。

1.3 方法

1.3.1 ABO 血型血清學試驗 患兒血型鑒定采用鹽水法和微柱凝膠卡法， 所有試驗均嚴格按照操作規(guī)范及生產(chǎn)廠家使用說明書進行操作和結(jié)果判讀。

1.3.2 血標本DNA 提取 參照天根公司試劑盒說明書提取血液標本DNA。

1.3.3 PCR-SSP 法ABO-B 亞型基因分型檢測調(diào) 整DNA 濃 度 范 圍30~50 ng/μL，A260/A280 為1.6~1.8，PCR 擴增反應按說明書設置，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝胺電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下分析,按說明書 判讀結(jié)果并記錄。

2 結(jié)果

2.1 ABO 血型正反定型結(jié)果 室溫條件下ABO 血型正定型B 抗原極弱，易誤判為O 型，多次離心后發(fā)現(xiàn)正定型B 抗原出現(xiàn)弱凝集(抗B:1+w)，反定型為O 型(Ac：3＋，Bc：1+)。 患兒血型初步判斷為B 亞型， 其父、 母親血型血清學結(jié)果分別為AB3 和O型。 見表1。

表1 先證者及其父母血型血清學反應格局

2.2 PCR-SSP B 亞型基因檢測結(jié)果 該兒童基因型通過ABO-B 亞型基因分型檢測, 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果提示該兒童血型基因型為B303/O 型，根據(jù)血清學檢測結(jié)果分析此亞型來源于父親的可能性大， 對父親的DNA 標本進行B 亞型基因檢測，提示其父親的血型基因型為A/B303。

3 討論

ABO 基因位于人類第9 號染色體（9q34），ABO 亞型的形成與其第6、7 號外顯子的突變密切相關。 亞型形成的分子機制包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、堿基缺失或插入、啟動子區(qū)域CpG 甲基化、基因重組和雜交基因、剪接位點突變等[9-12]。目前基因分型檢測、 基因測序等基因檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛用于ABO 亞型的輔助鑒定[7，9]。

B 亞型在我國并不少見，根據(jù)國內(nèi)文獻報道B亞型較A 亞型更為常見[13]。 而B3 亞型是B 亞型中最為罕見的一種， B3 亞型具有明顯的家系遺傳特點，因紅細胞上B 抗原位點數(shù)稀少[14]導致部分紅細胞與抗-B 抗體不發(fā)生凝集， 在臨床上常因正定型出現(xiàn)“混合視野凝集”或“雙群”現(xiàn)象而被發(fā)現(xiàn)[15]，嬰幼兒、 特別是早產(chǎn)兒因自身紅細胞抗原發(fā)育不完全，亦或疾病等原因，造成紅細胞表面抗原表達不完全， 血型正反定型時易被漏檢或誤判。 本研究中， 先證者為出生22 d 的早產(chǎn)兒，ABO 血型血清學結(jié)果顯示正定型（微柱凝膠法）檢出很弱的B 抗原， 試管法患兒紅細胞與抗B 血清室溫下立即離心為陰性，多次離心逐漸出現(xiàn)2+混合凝集，推測因患兒低齡且早產(chǎn)的原因，因此未出現(xiàn)典型“雙群”現(xiàn)象。 反定型檢測到正常的抗-A 抗體（3+）和弱B抗體（1+） ，H 抗原相應增強（4+w），同時血清中檢測到含有抗-B 抗體， 但不能排外體內(nèi)含有來自母親的抗B 抗體干擾，僅初步懷疑為B 亞型，體現(xiàn)出血清學檢測ABO 亞型的局限之處。遂進行ABO-B亞型基因分型， 證實患兒血型基因型為B303/O型，其父親血型基因型為A/B303，符合遺傳規(guī)律。該病例因缺少樣本無法繼續(xù)做測序確認， 待患兒滿1 周歲后隨訪調(diào)研。

B303 亞型的特征性突變?yōu)锳BO 基因第3 內(nèi)含子IVS3+5G > A 的突變， 與常見的第6、7 外顯子突變位點不同， 基因測序時如果未覆蓋內(nèi)含子編碼區(qū)域?qū)е翨3 亞型漏檢，這可能是導致臨床上B3 亞型被較少發(fā)現(xiàn)的原因之一。 IVS3+5G >A 的突變導致ABO 基因的保守序列被破壞， 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程異常，最終導致α-1，3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GTB 酶）的部分氨基酸缺失[16-17]，GTB 酶活性或結(jié)構(gòu)上發(fā)生特異性改變， 從而導致B 抗原表達減弱以及混合凝集視野的B3 亞型出現(xiàn)[18-19]。

本研究中該早產(chǎn)兒在進行血型復核時發(fā)現(xiàn)與初查血型不一致， 在初查血型時將其ABO 血型正定型誤判為O 型， 該患兒標本送我科進行溶血病檢測時用其他廠家的微柱凝膠卡檢測發(fā)現(xiàn)存在B抗原。因此，我們建議臨床上涉及患者ABO 血型初查與復查時應使用不同品牌試劑（或微柱凝膠卡）進行檢測，特別是新生兒群體因抗原發(fā)育不完全、來自母體的抗體干擾等因素， 給血型的準確鑒定帶來困擾。 ABO 血型亞型的鑒定需要結(jié)合血清學實驗的特性， 聯(lián)合應用分子生物學技術(shù)進行綜合判斷[11，20-22]。 本研究中患兒血清中含有抗-B 抗體，若輸入正常AB 型或B 型血液易發(fā)生輸血反應。該早產(chǎn)兒輸血時應選擇O 型洗滌紅細胞配合型輸注， 選擇B 型或O 型懸浮紅細胞輸注將影響輸血治療效果。

綜上所述，隨著臨床用血量的日益增加，伴隨的ABO 亞型輸血者也越來越多。新生兒、早產(chǎn)兒等特殊群體因生理發(fā)育的特殊性， 臨床上僅靠血清學方法很難發(fā)現(xiàn)ABO 亞型。 我們建議針對6 月齡以內(nèi)的嬰幼兒也應開展ABO 血型正反鑒定， 正定型明顯偏弱（<3+），反定型有/無抗體時，均應考慮通過基因分型等分子生物學手段， 結(jié)合血清學試驗來結(jié)合判斷ABO 血型以準確定型， 為臨床輸血安全提供重要保障。