鄭州地區(qū)固定單采血小板捐獻(xiàn)人群血小板供者庫建立分析

張麗，劉錚，張伯偉，康軼青，王娜

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州 450000）

血小板輸注無效（PTR）是目前臨床輸血領(lǐng)域廣泛關(guān)注的問題之一。 有調(diào)查顯示，免疫性血小板抗體[主要包括人類白細(xì)胞抗原（HLA）與人類血小板抗原（HPA）]造成的PTR 占18%～25%[1-2]。 HLA與HPA 多態(tài)性高，能夠在藥物、輸血與妊娠等各種免疫因素下形成相應(yīng)抗體， 各種抗原抗體間所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可造成免疫源性PTR， 即予以非同型輸注會導(dǎo)致同種抗體產(chǎn)生[3]。 但是，當(dāng)前輸血技術(shù)規(guī)范尚未對血小板同型輸注進(jìn)行規(guī)定， 臨床實踐中，存在大量PTR；對于部分需長期多次輸注治療患者而言， 如果產(chǎn)生抗體， 將使得其 “無血可輸”；同時由于目前血小板供應(yīng)情況相對緊張，PTR屬于資源浪費現(xiàn)象[4-5]。 故建立血小板供者HLA-I類以及HPA 基因分型的相應(yīng)血小板庫， 有利于為患者提供各種抗原相匹配單采血小板， 有效地降低PTR 發(fā)生風(fēng)險，提高血小板資源利用效率，避免血小板輸注問題產(chǎn)生。 本研究主要對河南省鄭州地區(qū)血液中心固定無償單采血小板捐獻(xiàn)者予以HLA-I 類基因、HPA 基因分型檢測，建立血小板供者庫，希望為減少血小板輸注問題提供有效指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以河南省鄭州地區(qū)血液中心2014年6 月1 日至2014 年12 月31 日1585 名固定單采血小板捐獻(xiàn)者為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：每年獻(xiàn)單采血小板三次以上。 并在這1585 名研究對象中隨機(jī)抽取500 名捐獻(xiàn)者血樣， 檢測HLA-I 類基因與HPA 基因的分型。

1.2 方法 記錄并整理1585 名研究對象性別、年齡、血型分布、職業(yè)分布、捐獻(xiàn)次數(shù)等資料。 利用血液中心現(xiàn)代血站管理信息系統(tǒng)SHINOW 9.0，收集兩個月無償固定單采血小板捐獻(xiàn)者的血樣。 留取固定無償單采血小板捐獻(xiàn)者的血液標(biāo)本3 mL，通過AutoMate Express 自動DNA 提取系統(tǒng) （購自美國Life Technologies）， 選擇天根DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，嚴(yán)格依據(jù)說明書操作，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增前，控制DNA 濃度50 ng/μL。基因檢測： 采取聚合酶鏈-序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）對HPA1-17 基因進(jìn)行檢測，使用美國Texas BioGene.inc 公司提供的HPAtyper 分型試劑盒（批號為M313041）；采取聚合酶鏈-序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSO）對HLA-I 類抗原進(jìn)行檢測，使用美國one lambda 公司提供的LABTypeSSO 試劑盒(批號為：A 位點RSSO1A13，B 位點RSSOIB16)。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 HPA 基因分型通過直接計數(shù)法計算獲得基因頻率；HLA-A、B 位點基因分型，通過方根法計算基因頻率： 其中f 為抗原頻率，f=C/N， 其中N 表示調(diào)查樣本總數(shù)，C 表示有某抗原個體數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 固定無償單采血小板獻(xiàn)血者資料分析 1585名固定無償單采血小板獻(xiàn)血者中，男性（76.47%）、36～55 歲（69.78%）、農(nóng)民（34.01%）、捐獻(xiàn)3～9 次（78.87%）者占比較多，血型AB 型（11.86%）者占比較少。 見表1。

表1 固定無償單采血小板獻(xiàn)血者資料

2.2 固定無償捐獻(xiàn)單采血小板人群HLA-I 基因頻率 各等位基因頻率見表2，A 位點基因頻率前5位為A*1101 （16.6%）、A*0201 （16.3%）、A*2402（16.3%）、A*3001（8.2%）、 A*3303（8.0%）；B 位點前5 位為B*1302（7.90%）、B*4001（7.4%）、B*5101（6.4%）、B*4601（6.2%）和B*0702（5.1%）。 基因頻率較高的（>2%）見表3。

表2 HLA-A、B 等位基因頻率分布

表3 HLA-A、B 等位基因頻率分布（基因頻率≥2%）

2.3 固定無償捐獻(xiàn)單采血小板人群HPA 基因及基因型頻率 HPA-4、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17系統(tǒng)基因型呈單態(tài)性，只檢測到a 等位基因，其a/a基因頻率為100%。 HPA-1、2、3、5、6、15 系統(tǒng)具有多態(tài)性，HPA-3 與HPA-15 雜合度 （a/b 雜合子基因型）最高，分別為57.00% 和49.80%；HPA-1、2、5、6 以a/a 純合子基因型為主， 分別為99.2%，94.8%，98.4%，99.4%，無b/b 純合子基因型。 見表4。

表4 鄭州地區(qū)固定無償捐獻(xiàn)單采血小板人群HPA 基因型頻率分布

3 討論

歐美地區(qū)很多國家血液中心以及輸血服務(wù)中心均構(gòu)建了明確HPA、HLA 基因型的相應(yīng)血小板供者庫， 便于為新生兒同種免疫血小板減少癥與PTR 病人予以血小板配合型的有效輸注[6]。 有調(diào)查顯示， 美國威斯康辛地區(qū)血液中心所構(gòu)建的血小板供者庫，人數(shù)高達(dá)14000，并且每年大約1000 人接受配合型輸注治療； 瑞士日內(nèi)瓦地區(qū)構(gòu)建的明確HPA 型血小板供者庫包含2142 人[7-8]。 很多發(fā)達(dá)國家均已經(jīng)構(gòu)建已知血型的龐大血小板供者庫，且正在逐步擴(kuò)增及完善。 我國近年來只有上海等大城市已經(jīng)構(gòu)建血小板供者資料庫， 且樣本量一般較小[9]。 河南省目前沒有自己的血小板庫，在臨床上沒有對血小板抗原基因進(jìn)行分型及配型，導(dǎo)致臨床血小板輸注效果不理想， 并且增加了患者的負(fù)擔(dān)。 因此， 建立河南鄭州地區(qū)血小板供者庫， 有利于提高本地臨床血小板輸注治療安全性以及有效性，具有非常重要的現(xiàn)實意義。 本研究分析1 585 名固定無償單采血小板獻(xiàn)血者資料發(fā)現(xiàn)，以男性（76.47%）、36～55 歲群體（69.78%）、 農(nóng)民（34.01%）、A 型（27.51%）、B 型（30.79%）與O 型（29.84%）血為主，且大部分（78.87%）捐獻(xiàn)3～9 次。造成PTR 原因眾多， 其中人體免疫因素發(fā)揮著重要作用[10]。血小板表面存在十分豐富并且復(fù)雜的抗原物質(zhì)， 其基因多態(tài)性呈現(xiàn)種族以及群體特征[11]。對于血小板輸注治療時同種免疫反應(yīng)，有大約5%為血小板同種抗原HPA 之間不配合使得機(jī)體分泌相應(yīng)抗體所致， 大約80%是因為供血小板表面存在的HLA-I 類抗原抗體間產(chǎn)生同種反應(yīng)損害到血小板所致[12-13]。 確保受血者與供血者之間HLA 完全相同具有較大難度，根據(jù)臨床經(jīng)驗，采用HLA 部分位點相同以及HPA 完全相同血小板進(jìn)行輸注，可獲得良好療效[14-15]。 本研究顯示，HLA-A 位點基因頻率前5 位分別為A*1101 （16.6%）、A*0201（16.3%）、A*2402（16.3%）、A*3001（8.2%）、 A*3303（8.0%），B 位點前5 位分別為B*1302 （7.90%）、B*4001（7.4%）、B*5101（6.4%）、B*4601（6.2%）和

B*0702 （5.1%），A*2402、B*4601、B*5101、B*0702與我國其他地區(qū)調(diào)查研究[16]結(jié)果較為相似，其中A*1101、A*0201、A*3001、A*3303、B*1302、B*4001具有較大地域性特點， 對于北方人群比較罕見的B*78、B*82、A*36 以及A*43，均沒有檢出。 本研究發(fā)現(xiàn)，HPA-4、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17 系統(tǒng)基因型呈單態(tài)性，只檢測到a 等位基因，a/a 基因頻率高達(dá)100%，而HPA-1、2、3、5、6、15 系統(tǒng)呈現(xiàn)多態(tài)性，其中HPA-3、HPA-15 雜合度（a/b 雜合子基因型）最高，將其歸為同種免疫風(fēng)險比較高的基因型，需予以高度重視；HPA-1、2、5、6 主要為a/a 純合子基因型，未見b/b 純合子基因型。 本研究根據(jù)鄭州地區(qū)固定單采血小板捐獻(xiàn)人群HLA 以及HPA 基因特征，構(gòu)建了相應(yīng)系統(tǒng)基因庫。 臨床對于PTR 者，應(yīng)該首先予以HLA、HPA 分型，并且對血小板抗體進(jìn)行篩查，若為長期輸血者，必須提前干預(yù)，采取HLA、HPA 相合的相應(yīng)血小板進(jìn)行輸注治療[17]。通過建立固定單采血小板捐獻(xiàn)人群血小板供者庫，有利于選擇配型血小板予以輸注，起到節(jié)約血小板資源、避免浪費以及減輕患者負(fù)擔(dān)作用。

綜上， 河南省鄭州地區(qū)固定單采血小板捐獻(xiàn)人群大部分為男性、36～55 歲、 捐獻(xiàn)3～9 次者，AB型較少，HLA-A、B 等位基因以及HPA1-17 基因均表現(xiàn)出明顯區(qū)域性特征， 通過構(gòu)建血小板供者庫，可更好地滿足臨床需求，降低PTR 發(fā)生率。