李小平， 陳渝珂， 朱 明

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201210）

貝母藥材來源于百合科貝母屬數(shù)種植物的干燥鱗莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，自唐代以后，以貝母屬植物作為中藥貝母正品一直沿用至今。川貝母和浙貝母為大宗藥材，野生川貝母逐年減少，造成其市場價(jià)格昂貴，混偽品繁多。2020年版中國藥典收載有川貝母、伊貝母、浙貝母、湖北貝母和平貝母5大類貝母藥材（國家藥典委員會(huì)編，2020），各地還有幾十種貝母屬植物的鱗莖習(xí)慣性作為貝母入藥。貝母素甲、貝母素乙是浙貝母飲片中常用的質(zhì)控指標(biāo) （國家藥典委員會(huì)編，2020；趙耀東等，2013；曾榮香等，2009；程顯隆等，2008；薛燕和顧好糧，2005）；貝母素乙是湖北貝母質(zhì)控指標(biāo)，也是川貝母鑒別的對(duì)照品（國家藥典委員會(huì)編，2020）。近來研究發(fā)現(xiàn)，貝母辛具有很好的平喘作用（趙益等，2009），并在瓦布貝母（劉晶等，2010）、太白貝母（王懷玉等，2011；劉晶等，2010）、彭澤貝母（劉紅寧等，2010）、伊貝母（段寶忠等，2010）、川貝母（黃林芳等，2009）、爐貝母（蔣玉虎等，2014）、新疆貝母（劉玉明等，2014；鄒和平等，2014）、康定貝母（鄒和平等，2014）等不同種類貝母的研究中作為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行檢測。為了保證用藥安全有效，擴(kuò)大用藥資源，本文采用HPLCELSD法對(duì)9個(gè)不同產(chǎn)地貝母中3種生物堿貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量進(jìn)行測定，比較不同產(chǎn)地貝母藥材中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量差異，并對(duì)貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)利用貝母資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器、供試材料及試驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 供試材料 本試驗(yàn)共收集到9個(gè)不同產(chǎn)地的5大類貝母藥材，經(jīng)鑒定，涵蓋了2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載的浙貝母、伊貝母、平貝母、川貝母和湖北貝母所有種類的貝母藥材。S1、S2、S3、S4、S5號(hào)生藥樣品由四川大學(xué)鑒定，S6、S7、S8、S9號(hào)生藥樣品由上海中醫(yī)藥大學(xué)鑒定，具體樣品來源見表1。

表1 樣品來源

1.1.2 試劑 對(duì)照品貝母辛（110892-201911）、貝母 素 甲 （110750-201908）、 貝 母 素 乙 （110751-201909）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均≥98%；乙睛為色譜純（美國Fisher公司），四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，牛胎血清（FBS）購自美國Gibco-BRL公司，其他試劑為分析純。

1.1.3 儀器Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2420 ELSD檢 測 器 ；Empower2色 譜 工 作站；Newllassic MF電子天平（瑞士Mettler公司）；酸度計(jì)（瑞士Mettler公司）；RV 10D S25旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；Milli-Q超純水儀 （Millipore公司）；InfiniteF50酶標(biāo)儀（TECAN有限公司）。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c小鼠，雄性，8～10周齡，重18～20 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對(duì)照品適量，分別加甲醇制成含貝母辛1.8 mg/mL，含貝母素甲0.4 mg/mL，含貝母素乙1.2 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；于4℃冷藏保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末 （過四號(hào)篩）約2.0 g，精密稱定，置燒瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4:1）40 mL，稱量，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱量，加三氯甲烷-甲醇（4:1）補(bǔ)足減失的量，濾過。精密量取濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，然后過0.45 μm微孔濾膜，即得。每個(gè)樣品平行制備3份供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液；梯度洗脫（0～10 min，25%A，10～20 min，25%A→40%A，20～25 min，40%A→95%A，25～50 min，95%A）； 柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；漂移管溫度：40℃；載氣流速：2.0 L/min。

1.2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下迅速分離小鼠脾臟，置于冷的PBS下沖洗，剝?nèi)ソY(jié)締組織并以200目不銹鋼篩網(wǎng)輕輕研磨過濾。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次（4℃，250 g，5 min）之后，再用RPMI-1640培養(yǎng)基（25 mmol/L的谷氨酰胺、100 IU/mL的青霉素、80 IU/mL的鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的β-二巰基乙醇和10%的胎牛血清）重懸細(xì)胞，配制成密度為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。每孔200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，最后置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 MTT比色法檢測貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的藥物毒性 按“1.2.4”項(xiàng)下方法在96孔板中接種200 μL細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液中加入不同濃度的貝母辛、貝母素甲和貝母素乙 （終濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL（質(zhì)量濃度為5 mg/L）的MTT，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育4 h后，離心（300 g，5 min）棄上清，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上570 nm波長檢測各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。并利用Reed-Muench法，計(jì)算出貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的CC50即對(duì)50%的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以甲醇稀釋，得到6個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取6個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，考察貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的線性關(guān)系。

1.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，分別計(jì)算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的RSD。

1.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批次浙貝母藥材粉末6份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液6份，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，分別計(jì)算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定；記錄貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的峰面積，分別計(jì)算貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的平均含量及RSD。

1.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的浙貝母樣品1.0 g，共6份，置圓底燒瓶中，分別精密加入對(duì)照品貝母辛0.8 mg、貝母素甲0.1 mg、貝母素乙1.0 mg，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率及RSD。

1.3.6 貝母樣品中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量測定 精密稱取9個(gè)不同產(chǎn)地的貝母樣品，分別按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品及對(duì)照品色譜圖 在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，可見供試品溶液及對(duì)照品溶液基線平穩(wěn)，各色譜峰分離度好，其他成分無干擾（圖1）。

圖1 對(duì)照品（A）及樣品（B）的HPLC-ELSD色譜圖

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系 測定貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積，以峰面積積分值（Y）對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的回歸方程分別為：貝母辛，Y1=1.7953X1+13.221，r1=0.9992； 貝 母 素 甲 ，Y2=1.8021X2+12.863，r2=0.9991； 貝 母 素 乙 ，Y3=1.8127X3+12.478，r3=0.9997;表明貝母辛、貝母素甲、貝母乙素在質(zhì)量濃度3.6～288、0.8～64、2.4～192 μg/mL與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為2.13%、1.97%和1.78%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量的平均值分別為267.4、94.5、304.7 μg/g，RSD分別為1.95%、2.27%和2.03%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.87%、2.05%、1.96%；表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙平均回收率分別為101.13%、99.26%、101.29%，RSD分別為2.03%、1.95%和2.56%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 樣品中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量的測定結(jié)果 由表2可知，9個(gè)不同產(chǎn)地的5大類貝母中，在達(dá)到定量限的供試品中，貝母辛、貝母素甲和貝母素乙的含量分別在19.7～937.6、6.2～221.2、31.2～599.2 μg/g。 其中，貝母辛在川貝母中含量最高，貝母素甲在梭砂貝母含量最高，貝母素乙在湖北貝母中含量最高。

表2 不同產(chǎn)地貝母中貝母辛、貝母素甲和貝母素乙含量 μg/g

2.4 貝母辛、貝母素甲和貝母素乙細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià) 分別用0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的貝母辛、貝母素甲、貝母素乙處理小鼠脾淋巴細(xì)胞后，細(xì)胞相對(duì)存活率及CC50如表3所示。

表3 貝母辛、貝母素甲、貝母素乙對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的毒性

由上述結(jié)果可知，貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的半數(shù)致死量 （CC50）分別為65.38、146.8、91.44 μg/mL，其中，貝母辛對(duì)細(xì)胞毒性最大（CC50＝65.38 μg/mL）。 依據(jù)William S.Stokes（程顯隆等，2008）建立的體外實(shí)驗(yàn)對(duì)于急性毒性實(shí)驗(yàn)起始劑量的公式：log（LD50）＝0.435×log（IC50）+0.625，IC50＝CC50＝65.38 μg/mL，計(jì)算出小鼠的LD50為0.796 g/kg。默認(rèn)每日服藥量為ED50，治療指數(shù)TI＝LD50/ED50，依據(jù)經(jīng)驗(yàn)值，人的劑量為LD50＝0.796/9×70＝6.191 g。貝母辛在川貝母中的含量最高，為937.6 μg/g，《中國藥典》2020版（一部）記載川貝母的用藥量為3～10 g（程顯隆等，2008），得出川貝母的治療指數(shù)（TI）為661～2203。 當(dāng)治療指數(shù)TI＞10時(shí)，說明用藥安全，故在不考慮貝母辛對(duì)胚胎細(xì)胞潛在致畸毒性的前提下，可認(rèn)為不同產(chǎn)地貝母的臨床用藥安全。

3 結(jié)論與討論

貝母中的主要活性物質(zhì)生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中沒有共軛雙鍵和發(fā)光團(tuán)，不能直接用紫外檢測器進(jìn)行分析和檢測。HPLC-ELSD適合于沒有紫外吸收、不易揮發(fā)的化學(xué)成分的含量測定。本文采用HPLC-ELSD方法對(duì)9個(gè)產(chǎn)地的貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的含量進(jìn)行測定和比較分析，該方法靈敏度高，干擾少，重現(xiàn)性好，是檢測貝母中甾體和異甾體生物堿有效、簡便的分析方法。

不同產(chǎn)地貝母藥材中，貝母辛、貝母素甲、貝母素乙含量測定的結(jié)果顯示，浙貝母和湖北貝母中3種生物堿含量都較高。平貝母中3種生物堿含量都很低，均只達(dá)到檢測線，但未達(dá)到定量限，這與周劍俠等（2006）的研究結(jié)論相符，即平貝母中單一生物堿成分含量過低，不宜作為平貝母藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)；以平貝母中總生物堿含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，能更客觀地反映平貝母活性成分情況。在伊犁貝母中，貝母素甲和貝母素乙含量都較低，貝母辛含量相對(duì)較高，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。瓦布貝母和濃密貝母是川貝母的新培育品種，瓦布貝母中貝母辛和貝母素乙含量都較高；貝母辛、貝母素甲和貝母素乙三個(gè)單體成分，在暗紫貝母、川貝母、梭砂貝母等組成的川貝母復(fù)合群中，整體含量偏低。貝母素甲在瓦布貝母中達(dá)到檢測限，但未達(dá)到定量限（朱明，2011）。

周劍俠等（2006）研究表明，當(dāng)異甾體生物堿結(jié)構(gòu)中同時(shí)存在醚氧結(jié)構(gòu)和呋喃環(huán)時(shí)可能會(huì)對(duì)妊娠期的動(dòng)物和人的胚胎產(chǎn)生致畸作用。本文所測貝母的3種生物堿中川貝母中貝母辛的含量最高，川貝具有悠久的應(yīng)用歷史，一直是貝母藥材重要品種之一，故貝母辛的遺傳毒性仍需引起關(guān)注。