周 啟，楊 帆，傅斯琪，邱 毓，李 欣,3,*，陳紅兵

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué) 江西省食物過敏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

牛乳富含蛋白質(zhì)，是嬰幼兒成長發(fā)育的重要營養(yǎng)來源之一[1]。然而，牛乳又是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織公論的“八大過敏食物”之一。在全世界范圍內(nèi)，兒童牛乳過敏患病率為1.0%～7.5%，成人牛乳過敏患病率為0.1%～0.5%[2]。在中國，嬰兒牛乳過敏的患病率高達(dá)2.69%[3]，嬰幼兒牛乳過敏現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，癥狀越來越多樣，嚴(yán)重影響了嬰幼兒健康和生長發(fā)育。

引起牛乳過敏的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和乳清蛋白，其中乳清蛋白中α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）為主要過敏原[4]。ALA占總牛乳蛋白的5%，占乳清蛋白的25%，其分子質(zhì)量約為14.4 kDa。BLG占牛乳乳清蛋白總量的50%以上，分子質(zhì)量約為18.3 kDa，普通牛乳中主要有2 種變異體，呈水溶性，且據(jù)統(tǒng)計(jì)，約82%的牛乳過敏患者對BLG過敏[5-6]。

過敏反應(yīng)的免疫學(xué)基礎(chǔ)是抗體對抗原的過激性免疫應(yīng)答反應(yīng)。蛋白質(zhì)的表位決定了蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答特性[7]。根據(jù)表位的結(jié)構(gòu)可將表位分為線性表位和構(gòu)象性表位[8]。線性表位的活性依賴于氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)，構(gòu)象表位的活性則依賴于空間構(gòu)象[9]。在消化過程中，表位是否被消化降解也是評估蛋白質(zhì)抗原性變化的重要指標(biāo)。

目前，國外對低致敏配方乳粉研究深入而且已工業(yè)化生產(chǎn)，我國起步較晚。國外低致敏乳粉品牌幾乎占據(jù)全部市場份額[10]，但它們的致敏性差異不詳。因此，本研究隨機(jī)選取市場上5 種乳粉進(jìn)行體外靜態(tài)模擬胃腸消化，通過電泳、水解度測定和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)評估乳粉中乳清蛋白的抗原性變化，為科學(xué)評價(jià)不同品牌乳粉的穩(wěn)定性和致敏性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用嬰幼兒配方乳粉均采購于市場，樣品信息見表1。

N-三(羥甲基)甲基甘氨酸（Tricine）、三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）、絲氨酸、四甲基乙二胺 生工生物工程（上海）股份有限公司、40 g/100 mL丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液（丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比19∶1） 北京索萊寶科技有限公司；預(yù)染大分子蛋白質(zhì)Marker 美國Thermo公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker立陶宛Thermo公司；ALA、BLG 本實(shí)驗(yàn)室；胃蛋白酶、甘氨脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、胰酵素、明膠、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）美國Sigma公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）顯色試劑盒 北京欣博盛生物科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LK-120A電子天平 日本A&D公司；Model 860酶聯(lián)免疫檢測儀、迷你型蛋白電泳儀、GS-800凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；96 孔酶標(biāo)板 深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬嬰幼兒胃腸消化

參考楊帆[11]、Ménard[12]等建立的嬰幼兒體外靜態(tài)消化方法，并稍作修改。模擬胃液和消化液按照楊帆[11]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行配制。

模擬胃部消化：將配制的10 mL總蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL的乳粉樣液與8 mL模擬胃液和5 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液混合，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為5.3，并加入水至溶液總體積18.4 mL，于37 ℃搖床上溫育10 min后加入1.6 mL胃蛋白酶溶液（3 125 U/mL），放置于37 ℃搖床上溫育。每個離心管分別控制溫育時間0（G0）、30（G30）、60（G60）、120 min（G120），分別取樣1 mL，加入適量1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，并置于冰上以停止反應(yīng)。

模擬腸道消化：取上述胃部消化60 min終止消化的溶液10 mL，加入到等體積溫育的pH 7模擬腸道消化液中，在37 ℃搖床中溫育。每個離心管分別控制溫育時間0（I0）、30（I30）、60（I60）、120 min（I120），分別取樣1 mL，加入10 μL終濃度為4 mmol/L的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，并置于冰上以停止反應(yīng)。最后將所有收集的消化溶液置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）

采用Tricine-SDS-PAGE方法對乳粉體外消化后的產(chǎn)物分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定。致密膠、夾層膠和濃縮膠濃度分別為16.5%、10%和4%，每孔上樣量為15 μL，在30 V、1 h和100 V、約3 h的電泳條件下電泳。電泳結(jié)束后，凝膠分別用固定液和考馬斯亮藍(lán)染液固定15 min、染色10 min，之后進(jìn)行脫色處理，直至條帶清晰為止；最后進(jìn)行凝膠成像。

1.3.3 水解度的測定

參考Nehir Ei等[13]采用的鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法測定經(jīng)體外消化后的蛋白質(zhì)水解度，并稍作修改和調(diào)整。

OPA溶液配制：將3.81 g硼砂（十水合四硼酸鈉）和100 mg SDS溶于60 mL去離子水中至完全溶解；將80 mg OPA溶于2 mL無水乙醇中，溶解完全后轉(zhuǎn)移至先前制備的溶液中，再加入88 mg二硫蘇糖醇，最后用去離子水將溶液定容至100 mL，上述2 步制備過程避光操作。

絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：50 mgL-絲氨酸用去離子水溶解、定容至500 mL。

取3 mL制備的OPA溶液與400 μL 0.075 mg/mL胃消化和胃腸消化后的溶液混勻5 s，避光反應(yīng)2 min后用酶標(biāo)儀在340 nm波長處測定光密度（OD340nm），做3 次平行實(shí)驗(yàn)。以溶液濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，OD340nm為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度按式（1）～（3）計(jì)算。

式中：W為水解過程中每克蛋白被斷裂肽鍵數(shù)目/（mmol/g）；c為樣品中所含L-絲氨酸當(dāng)量/（mmol/L），可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；V為樣品體積/L；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g；ω為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；h為修正后的水解過程中每克蛋白被斷裂肽鍵數(shù)目/（mmol/g）；htot為每克純蛋白中肽鍵數(shù)，為8.2 mmol/g；α、β均為修正因子，分別視為常數(shù)1.039和0.383。

1.3.4 間接競爭ELISA

采用間接競爭ELISA法評估體外消化后的乳粉中ALA和BLG的IgG結(jié)合能力和抗原性變化。具體步驟參考孟軒夷[14]的方法，稍作修改。ALA稀釋質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL，BLG稀釋質(zhì)量濃度梯度為0.5、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL。

每孔用包被液包被100 μL未處理的ALA（3 μg/mL）或BLG（3 μg/mL），置于4 ℃過夜。次日傾去包被液，用PBST（含0.05%吐溫-20的PBS）洗滌3 次，5 min/次。加入3 g/100 mL明膠進(jìn)行封阻（250 μL/孔），37 ℃孵育1 h。傾去封阻液，以PBST洗滌并拍干3 次。取另一塊酶標(biāo)板以同樣的方式進(jìn)行封阻，洗板3 次后，分別加入60 μL樣品（競爭抗原）和等體積的稀釋（1∶160 000）后兔抗ALA或兔抗BLG多克隆抗體，于37 ℃孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后，每孔吸取100 μL混合物移至第1塊板內(nèi)進(jìn)行競爭，繼續(xù)37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3 次。每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），37 ℃繼續(xù)孵育1 h，PBST洗滌3 次。二抗反應(yīng)結(jié)束后，洗板3 次，加入100 μL TMB，37 ℃避光反應(yīng)15 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4以終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定光密度（OD450nm），做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)得到的OD450nm，繪制5 種配方乳粉消化不同時間后ALA或BLG的競爭抑制性曲線，計(jì)算出半抑制質(zhì)量濃度（IC50），用于表征消化產(chǎn)物中ALA和BLG的IgG結(jié)合能力變化。抑制率按式（4）計(jì)算。

式中：B0為無競爭抗原時的OD450nm；B為消化產(chǎn)物中競爭抗原對應(yīng)的OD450nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，利用Origin 2021軟件和GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并繪圖，用Excel軟件繪制表格，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳粉中主要過敏原蛋白的胃腸消化穩(wěn)定性

由圖1可知，隨胃腸道消化時間的延長，蛋白質(zhì)電泳條帶的顏色逐漸變淺，擴(kuò)散帶逐漸消失，表明在消化過程中乳粉中的蛋白質(zhì)逐漸被降解為小分子肽段[15]。5 種配方乳粉中的酪蛋白經(jīng)胃消化60 min、腸消化30 min后幾乎全部被降解為小分子肽段，但BLG和ALA在5 種配方乳粉中幾乎不受胃消化的影響，在腸消化過程均逐漸降解，并且BLG在腸消化120 min后幾乎全部被降解為小分子肽段，ALA在腸消化120 min后雖然降解程度很大，但未被完全降解為小分子肽段，穩(wěn)定性相對較高。水解過程中，條帶的差異可能由乳粉配方不同導(dǎo)致，由于蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特性及電荷屬性，乳粉中特殊的配方成分與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而屏蔽、遮掩了水解位點(diǎn)，導(dǎo)致條帶差異明顯[16]。

圖1 模擬嬰幼兒體外消化前后5 種嬰幼兒配方乳粉的Tricine-SDS-PAGE圖Fig. 1 Tricine-SDS-PAGE profiles of the five infant formulas digested in simulated gastrointestinal fluid

2.2 乳粉中主要過敏原蛋白胃腸消化產(chǎn)物的水解度

水解度是評估蛋白質(zhì)體外消化的重要指標(biāo)之一，表示消化過程中蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂程度[17]。由圖2可知，隨著消化時間的延長，乳粉中蛋白質(zhì)的水解度整體呈上升趨勢，且在腸消化過程上升幅度較大，表明與胃蛋白酶相比，胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)速率更快。且與對照組（G0）相比，腸消化組水解度存在極顯著差異（P＜0.01），大部分乳粉的胃消化水解度與對照組存在極顯著差異（P＜0.01），但部分乳粉的胃消化水解度與對照組只存在顯著差異（P＜0.05）?？赡苁怯捎谖傅鞍酌笇儆趦?nèi)切型蛋白酶，其酶切位點(diǎn)較特異，因此通常其水解肽鍵程度較低；而胰蛋白酶具有更多酶切位點(diǎn)，能更快水解蛋白質(zhì)，使其變成肽段和游離氨基酸，從而使其水解度增大[18]。然而，在胃腸道水解蛋白質(zhì)過程中，短肽間可能會形成聚集體，增加空間位阻、改變酶的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響部分蛋白的水解程度。但結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)水解度整體不超過18%，水解度較低，消化穩(wěn)定性較好，與嬰幼兒的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、消化功能較弱事實(shí)相符。

圖2 5 種乳粉體外消化后的蛋白質(zhì)水解度Fig. 2 Degree of hydrolysis of proteins in digested milk formulas in simulated infant gastrointestinal fluid

值得注意的是，結(jié)合電泳條帶和水解度來看，乳粉樣品5中的主要過敏原BLG和ALA在胃腸消化過程中降解程度最大，消化穩(wěn)定性最差，且在腸消化60 min時幾乎全部降解，說明乳粉樣品5更容易被嬰幼兒的胃腸道消化。

2.3 乳粉胃腸消化產(chǎn)物中ALA和BLG的抗原性

在間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)中，一般用IC50表示抗原-抗體結(jié)合能力，二者呈負(fù)相關(guān)，即當(dāng)競爭抗原的IC50越大，則說明達(dá)到半抑制率所需的競爭抗原量越多，也就是競爭抗原與抗體的結(jié)合能力越弱[14]。由圖3和表2可知，隨著消化時間的延長，各乳粉中乳清蛋白與IgG的結(jié)合能力變化不同。乳粉1和4中ALA與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，乳粉2和3中ALA與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，乳粉5中ALA與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢。此外，乳粉1和5中BLG與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；乳粉3和4中BLG與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢；乳粉2中BLG與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢。

表2 5 種乳粉胃腸消化產(chǎn)物對IgG的IC50Table 2 IC50 for IgG of gastrointestinal digestive products of five milk powders μg/mL

圖3 乳粉中乳清蛋白體外消化后對IgG的抑制率Fig. 3 Inhibition rates of whey protein in milk powder subjected to in vitro digestion toward IgG

分析各乳粉的抗原性變化發(fā)現(xiàn)，大部分乳粉經(jīng)過消化之后，乳清蛋白與IgG結(jié)合能力比消化前更低，可能是由于消化水解破壞了部分過敏原蛋白質(zhì)原有的表位和空間結(jié)構(gòu)，Tricine-SDS-PAGE條帶與水解度的測定結(jié)果表明，大分子蛋白經(jīng)體外消化后降解為更多的小分子蛋白，甚至是短肽、氨基酸，這能夠間接證明蛋白質(zhì)表位受到一定程度的破壞，進(jìn)而降低乳粉消化產(chǎn)物的抗原性。同時，蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后會產(chǎn)生游離氨基酸殘基，水解酶對過敏原蛋白的修飾會導(dǎo)致線性和構(gòu)象表位丟失。

然而，隨著消化的進(jìn)行，部分乳粉的蛋白質(zhì)消化過程中，乳清蛋白與IgG結(jié)合能力上升，這可能是由于在蛋白質(zhì)消化過程中，乳粉中蛋白質(zhì)與不同物質(zhì)形成新聚集體復(fù)合物，特殊的聚集體復(fù)合物結(jié)構(gòu)增大了空間位阻，難以與水解酶結(jié)合，甚至在此過程中可能產(chǎn)生了新的過敏表位。乳粉3和4中BLG與IgG的結(jié)合能力隨著消化時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，可能是由于蛋白酶水解消化破壞蛋白質(zhì)原有的空間結(jié)構(gòu)和表位時，隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)的更多線性或構(gòu)象表位暴露[19]，但隨著蛋白酶進(jìn)一步水解，新暴露的表位被破壞，IgG結(jié)合能力又下降至低于未水解的乳清蛋白結(jié)合能力。乳粉2和5經(jīng)過120 min腸消化后，其水解產(chǎn)物的IgG結(jié)合能力比未經(jīng)腸消化更高，但從SDS-PAGE及水解度的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大分子蛋白基本被降解，水解度卻較消化90 min有一定降低，這可能是因?yàn)橛坞x的氨基酸、短肽之間相互結(jié)合形成了新的表位序列，或者總體比較，在蛋白酶水解消化破壞蛋白質(zhì)原有的空間結(jié)構(gòu)和表位時，隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)的線性或構(gòu)象表位被暴露更多[19]，從而使消化后乳粉的抗原性增加。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，體外消化對不同乳粉水解度和抗原性變化的影響不同。首先，可能是由于乳粉的配方不同，乳粉中蛋白質(zhì)與不同物質(zhì)形成的新聚集體復(fù)合物不同，聚集體結(jié)構(gòu)增大產(chǎn)物的空間位阻大小不一；其次，也可能是由于乳粉的不同加工處理方式，乳粉加工過程的熱處理可能會引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，使蛋白質(zhì)暴露的過敏表位不同；再者，經(jīng)過體外消化處理，不同乳粉中的蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)存在差異，導(dǎo)致水解度不一致。除此之外，如今國際標(biāo)準(zhǔn)的配方乳粉一般由40%酪蛋白和60%乳清蛋白及特定的氨基酸序列配方組成，但不同乳粉的配方有一定差異，由于不同乳粉配方選擇不同氨基酸，可能會形成不同蛋白質(zhì)致敏性表位，同時不同類型的蛋白質(zhì)經(jīng)消化后，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的特殊性、致敏性表位位點(diǎn)可能被屏蔽、覆蓋，甚至暴露、破壞，這都會導(dǎo)致消化后乳粉中乳清蛋白的抗原性變化[20]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立體外消化模型，對市場上選取的5 種乳粉進(jìn)行體外消化，再采用Tricine-SDS-PAGE、水解度測定和間接競爭ELISA評估乳粉中乳清蛋白消化穩(wěn)定性和抗原性的變化。結(jié)果表明，不同乳粉的消化穩(wěn)定性有所差異，且消化對乳粉中乳清蛋白抗原性影響較大，部分乳粉中乳清蛋白與抗體結(jié)合能力降低，部分有所增加。不同乳粉中乳清蛋白的抗原性隨著消化時間延長發(fā)生了不同的變化，這可能是由于體外動態(tài)消化更能模擬牛乳蛋白在體內(nèi)胃腸消化的消化特性和抗原性的變化，而靜態(tài)消化的模擬效果相對較差?？傮w而言，體外消化有利于降低乳粉中乳清蛋白消化穩(wěn)定性和抗原性，因此，乳粉配方或可使用經(jīng)體外消化中的胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的乳清蛋白，即以酶水解蛋白質(zhì)的過敏表位，降低乳粉潛在致敏風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，本研究為客觀評價(jià)不同品牌乳粉的致敏性提供了部分科學(xué)依據(jù)，有助于乳過敏患者的安全膳食管理。