芽孢桿菌與根瘤菌復(fù)合包衣對大豆結(jié)瘤固氮能力的影響

趙宇賓，關(guān)大偉，邢鵬飛，王天舒，馬鳴超，姜 昕，李 俊*

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2．農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

大豆-根瘤菌共生體是效率最高的生物固氮系統(tǒng)，一年的固氮量能夠占到所有豆科類作物固定氮量的77%，固定的氮素可為豆科植物生長提供所需氮素營養(yǎng)的50%～100%［1］。利用大豆根瘤菌接種進(jìn)行生物固氮，是一種有效減少氮肥施用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的有效措施［2］。

傳統(tǒng)的根瘤菌接種方式拌種，是在播種前將種子與液體狀根瘤菌劑混合的接種技術(shù)，能夠取得一定的增產(chǎn)效果［3-4］。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國大豆主產(chǎn)區(qū)已基本實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，現(xiàn)有的大豆播種機(jī)缺少液體根瘤菌劑施用的配套裝置，導(dǎo)致液體根瘤菌劑無法隨播種進(jìn)行施用，極大地限制了根瘤菌劑的推廣應(yīng)用。目前，北美地區(qū)采用新型的根瘤菌包衣技術(shù)，使大豆根瘤菌接種方式由傳統(tǒng)的拌種改為售前包衣，消除了播前拌種的環(huán)節(jié)，大大提高了接種效率，但是由于包衣技術(shù)接種的根瘤菌數(shù)量有限，含量一般為105～108個(gè)菌體/g，活菌數(shù)量遠(yuǎn)低于液體菌劑活菌數(shù)1010～1011個(gè)菌體/mL，會大大降低根瘤菌的接種效果，降低固氮效率［5］。因此，如何在包衣條件下增加根瘤菌的結(jié)瘤固氮效率，成為推進(jìn)根瘤菌劑機(jī)械化應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

大量研究表明，根瘤菌與促生菌復(fù)合接種是一種有效提升根瘤菌結(jié)瘤固氮效率的方式。復(fù)合菌劑不僅能夠增強(qiáng)固氮能力，還能增加可溶性磷、鉀的含量，分泌生長激素等，能為植物提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，增加植物抗逆性，進(jìn)一步促進(jìn)植物生長［6-7］。芽孢桿菌作為一類典型的促生菌，被廣泛用于根瘤菌復(fù)合菌劑的研發(fā)應(yīng)用中。膠質(zhì)類芽孢桿菌能夠活化土壤磷，產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸、激素等促進(jìn)植物生長，還能夠產(chǎn)生胞外多糖，增強(qiáng)植物非特異性免疫能力，是微生物肥料的常用功能菌種［8-10］。有研究表明，膠質(zhì)類芽孢桿菌和大豆根瘤菌復(fù)合接種，比根瘤菌單接種增產(chǎn)1.94%，比不接種對照提升9.3%，同時(shí)能夠提高土壤肥力、增加土壤生物量、改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［11］。阿氏芽孢桿菌自2009年在20～41 km平流層分離發(fā)現(xiàn)以來，后續(xù)的研究表明其分布廣泛，最大的儲存庫是土壤［12］。從土壤分離的阿氏芽孢桿菌有助于提高玉米［13］和大豆［14］耐旱耐高溫能力，提高水稻［15］、大豆［16］耐鎘、硝酸鹽毒性等抗逆能力，增加植株根、莖、葉及籽粒中氮、磷、鉀、鈣元素的含量，促進(jìn)作物生長。接種阿氏芽孢桿菌能將碳酸鋅、磷酸鋅和氧化鋅水解，促進(jìn)植物吸收鋅離子，提升植株光合作用［17］。除此之外，阿氏芽孢桿菌還能解磷、解硅、解鉀，來提升茶園的土壤肥力［18］。以上研究表明，單獨(dú)接種阿氏芽孢桿菌對多種作物包括大豆均具有促生效果，但是，關(guān)于阿氏芽孢桿菌與根瘤菌復(fù)合菌劑的研究應(yīng)用鮮有報(bào)道。

因此，本研究以慢生大豆根瘤菌5038（Bradyrhizobium japonicum5038）、阿氏芽孢桿菌MB35-5（Bacillus aryabhattai MB35-5）、膠質(zhì)類芽孢桿菌3016（Paenibacillus mucilaginosus3016）3種菌作為研究材料，設(shè)置不接種、根瘤菌單獨(dú)包衣、促生菌與根瘤菌雙包衣和3種菌混合包衣共5個(gè)處理，通過盆栽試驗(yàn)，測定大豆結(jié)瘤能力、營養(yǎng)物質(zhì)含量及根瘤固氮酶活性，篩選根瘤菌劑的最佳組合，為探究高效復(fù)合根瘤菌劑應(yīng)用于機(jī)械化種植提供可能性，也為進(jìn)一步推廣根瘤菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試大豆品種

大豆品種：冀豆17，由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。

1.1.2 供試菌株

慢生大豆根瘤菌5038（Bradyrhizobium japonicum5038）、膠質(zhì)類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus3016）、阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai MB35-5），菌種來自中國農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所菌肥測試中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

YMA培養(yǎng)基（用于根瘤菌培養(yǎng)）：甘露醇10g、酵 母 粉3 g、MgSO40.2 g、NaCl 0.1 g、K2HPO40.25 g、KH2PO40.25 g，pH 7.0，蒸餾水定容到1000mL。

LB培養(yǎng)基（用于阿氏芽孢桿菌培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，pH 7.0，蒸餾水定容到1000 mL。

改良的ACCC55培養(yǎng)基（用于膠質(zhì)類芽孢桿菌培養(yǎng)）：蔗糖10 g、酵母粉0.5 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCO31 g、NaCl 0.2 g，pH 7.0～7.2，蒸餾水定容到1000 mL。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進(jìn)行，基質(zhì)采用蛭石∶營養(yǎng)土（體積比）=1∶1。大豆接種設(shè)為5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。分別為：處理1，不施肥對照（CK）；處理2，根瘤菌（R）；處理3，根瘤菌+阿氏芽孢桿菌（RB）；處理4，根瘤菌+膠質(zhì)類芽孢桿菌（RP）；處理5，根瘤菌+阿氏芽孢桿菌+膠質(zhì)類芽孢桿菌（RBP）。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，根瘤菌、阿氏芽孢桿菌與膠質(zhì)類芽孢桿菌之間并無明顯拮抗作用，因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)將這3種菌進(jìn)行復(fù)配研究。

表1 根瘤菌、促生菌復(fù)合包衣菌劑組成 （mL）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子包衣預(yù)處理

按體積比1∶1將多糖包衣劑溶液與根瘤菌和促生菌充分振蕩、混勻，制成混合菌液，將稱好重量的大豆種子放入干凈的自封袋中，每個(gè)處理選取100粒大豆種子，加入30 mL混合菌液，吹氣并扎緊自封袋袋口，反覆搖勻，晾干備用。

1.3.2 大豆生物性狀測定

種植45 d后，取樣，測定大豆鮮重和干重、根瘤數(shù)量和干重。測定干重的方法為將鮮植株與根瘤置于105℃的烘箱中殺青30 min，80℃條件下烘干至恒重，再用天平測量其質(zhì)量。

1.3.3 大豆?fàn)I養(yǎng)成分測定

將烘干的植物樣品，粉碎研磨，過1 mm篩，分別用凱氏定氮法、鉬銻抗比色法和火焰光度法［19］對大豆植株氮、磷、鉀含量進(jìn)行測定。大豆生長至45 d采用SPAD-502葉綠素儀測定葉綠素含量。

1.3.4 根瘤固氮酶活測定

將生長45 d的大豆植株根部用清水洗凈，每個(gè)處理選取6株大豆植株，將每一株植株根部剪下放入一個(gè)20 mL的棕色反應(yīng)瓶中反應(yīng)2 h，采用乙炔還原法測定固氮酶活性［20］。

式中，U：根瘤固氮酶活性［nmol/（mg·h）］；n：乙烯含量（nmol）；m：根瘤鮮重（mg）；t：反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010繪制圖表；利用SPSS 20.0分析處理數(shù)據(jù)，不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同促生菌與根瘤菌包衣對大豆植株生物性狀的影響

阿氏芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌混合包衣對大豆植株生物形狀影響不同（表2、3）?？傮w而言，根瘤菌單獨(dú)包衣，或與2種促生菌包衣，或者3種菌包衣，都能夠促進(jìn)大豆生長，且大豆植株的鮮、干重分別增加44.36%～82.55%、23.42%～51.80%，其中阿氏芽孢桿菌與根瘤菌雙接種處理（RB）獲得最高的植株鮮、干重，但是植株干重在處理間并沒有顯著性差異（P＞0.05）。不同菌種包衣大豆根瘤數(shù)量與根瘤干重具有差異性；同樣的，RB處理獲得了最多的根瘤數(shù)量與根瘤干重，分別比不接種CK增加14.44%和53.33%，但是處理間沒有顯著性差異（P＞0.05）。但是，RP和RBP處理的根瘤數(shù)量與根瘤干重卻略低于根瘤菌單獨(dú)接種。

表2 不同促生菌與根瘤菌包衣大豆生物性狀

表3 不同促生菌與根瘤菌包衣大豆生物性狀增量 （%）

2.2 不同促生菌與根瘤菌包衣對大豆根瘤固氮酶活性的影響

阿氏芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌混合包衣對大豆根瘤固氮酶活性具有顯著性影響（P＜0.05）（圖1）。R、RB、RP和RBP處理酶活性比CK分別提高4.99%、44.36%、40.77%和28.22%，RB處理固氮酶活性最高，達(dá)到7.38［nmol/（mg·h）］。由此可見，阿氏芽孢桿菌與根瘤菌、膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌雙接種或者3接種，都能夠提高大豆根瘤固氮酶活性，并且固氮酶活性都高于根瘤菌單獨(dú)接種，但是3種菌混合接種卻沒有達(dá)到最高的固氮酶活性。

圖1 不同促生菌與根瘤菌包衣大豆固氮酶活性及增加百分比

2.3 不同促生菌與根瘤菌包衣對大豆植株?duì)I養(yǎng)成分的影響

阿氏芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌混合包衣對大豆植株氮、磷、鉀含量的影響差異性較大（圖2）。CK、R、RB、RP、RBP處理對大豆植株氮含量均沒有顯著性影響（P＞0.05），且含量在1.68%～2.11%之間，其中RB處理獲得最高的氮含量。R、RB、RP和RBP 4個(gè)接種處理的大豆植株氮含量分別比CK增加10.34%、25.61%、2.86%、8.57%。膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌混合接種含氮量雖然高于不接種處理，但是卻低于根瘤菌單獨(dú)接種。阿氏芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌包衣增加大豆植株磷含量，與根瘤菌單獨(dú)接種具有顯著性差異（P＜0.05）。RB與RBP處理含磷量高，分別為0.97%和0.94%，比根瘤菌單獨(dú)接種處理提高25.97%和22.08%。4個(gè)接種處理鉀含量在1.88%～1.92%之間，不具有顯著性差異（P＞0.05），但是，接種處理與不接種CK（1.67%）均存在顯著性差異，且含量提高12.86%～14.40%（P＜0.05）。

圖2 不同促生菌與根瘤菌包衣大豆氮、磷、鉀含量

阿氏芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌混合包衣，能夠增加大豆植株葉綠素含量（圖3），其中阿氏芽孢桿菌與根瘤菌雙接種效果最好，提高10.16%，其次為膠質(zhì)類芽孢桿菌與根瘤菌雙接種，比CK高7.71%。R與RBP處理沒有顯著性差異（P＞0.05），分別比CK高3.14%和3.98%。

圖3 不同促生菌與根瘤菌包衣大豆植株葉綠素含量及增加百分比

2.4 大豆生物性狀與營養(yǎng)成分的相關(guān)性分析

如表4所示，固氮酶活性與根瘤干重呈顯著正相關(guān)關(guān)系，根瘤干重又與根瘤數(shù)量和大豆植株全氮含量呈正相關(guān)關(guān)系。表明大豆根瘤的數(shù)量與質(zhì)量可直接影響根瘤的固氮酶活性，從而影響大豆植株對氮的吸收利用?？梢?，用固氮酶活性作為評價(jià)根瘤共生系統(tǒng)工作效率是可行的，還可以考慮作為一項(xiàng)間接指標(biāo)預(yù)測大豆產(chǎn)量，使用根瘤作為大豆產(chǎn)量預(yù)測指標(biāo)要同時(shí)考慮數(shù)量與質(zhì)量，才有可能更加準(zhǔn)確。

表4 大豆生物性狀與營養(yǎng)成分的相關(guān)性分析

3 討論

膠質(zhì)類芽孢桿菌作為常用的微生物菌劑，能夠促進(jìn)植物生長，對其促生效果和功能基因機(jī)制研究的比較多［9，21］，本研究也獲得了類似的研究結(jié)果，與根瘤菌包衣能夠促進(jìn)大豆結(jié)瘤固氮。阿氏芽孢桿菌能夠促進(jìn)大豆生長的研究機(jī)理較少，可能與其高效分解硅酸鹽、磷酸鹽能力有關(guān)。有研究表明，外源添加硅能夠緩解NO3-對辣椒的脅迫，增加辣椒干、鮮重、光合能力、氮代謝酶活性［22］。硅可顯著增加稻田土壤的微生物總量，從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分的同化固定，提高土壤中氮和磷的礦化，提高氮肥和磷肥利用率，減少化肥的施用［23］。施用硅提高了光合作用和根系形態(tài)，從而提高了大豆的產(chǎn)量［24］，尤其在干旱等逆境條件下，能增強(qiáng)干旱條件下大豆幼苗的新陳代謝與滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而改善其株高、莖粗、側(cè)根條數(shù)及莖葉干物質(zhì)重［25］。但是，有研究表明，低氮高硅的配比最能促進(jìn)水稻分蘗，增加葉片含氮量［26］，施用硅肥要注意用量才能起到促生作用［27］。也有研究表明，阿氏芽孢桿菌可溶解無機(jī)磷酸鹽，合成鐵載體，并產(chǎn)生生物激素如吲哚乙酸（IAA）等活性有機(jī)物，促進(jìn)植物生長，或者直接定殖于植物根系，與植物共生［28］。阿氏芽孢桿菌與根瘤菌復(fù)合接種，對大豆的促生因素主要有哪些，在不同生境下這些促生因素如何發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步探究。

促生菌接種并不都會增加作物產(chǎn)量，Chibeba等［29］在莫桑比克通過慢生根瘤菌單接種和根瘤菌與固氮螺旋菌共接種試驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，單株接種大豆增產(chǎn)22%，與施肥處理的增產(chǎn)幅度相同，共接種并沒有增加籽粒產(chǎn)量，這表明需要進(jìn)一步研究有效的共接種菌種來探究多功能菌種共接種在生產(chǎn)上的限制因素，本研究中解磷的膠質(zhì)芽孢桿菌與解硅的阿氏芽孢桿菌，分別接種都具有良好的促生效果，但是三者混合卻沒有取得更高的共生固氮效率。可能是因?yàn)榫g的競爭、菌間配比失調(diào)，導(dǎo)致接種效果不好。黃秋良等［30］研究了褐球固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌不同接種量組合對芳樟生長的影響，發(fā)現(xiàn)不同接種量會影響接種效果。Gao等［31］發(fā)現(xiàn)初始菌種比例確實(shí)可以影響群落結(jié)構(gòu)、代謝和功能。因此，多微生物種類的復(fù)合根瘤菌劑的開發(fā)需要對于限制固氮結(jié)瘤的內(nèi)在機(jī)制，如菌劑配比，菌間代謝物的互相影響，與真菌的互作等外在因素如土壤性質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、中微量元素含量、土著微生物等進(jìn)行深入研究，才能研發(fā)出穩(wěn)定高效的復(fù)合根瘤菌劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

固氮酶活性、全氮含量、根瘤數(shù)量及質(zhì)量等是評價(jià)根瘤菌與大豆共生固氮效率的指標(biāo)［32］。本研究發(fā)現(xiàn)根瘤數(shù)量、干重與植株干重顯著正相關(guān)，根瘤作為評價(jià)固氮效率的重要指標(biāo)，對它的檢測分析對評價(jià)接種效果至關(guān)重要。通常情況，對于根瘤的檢測手段是通過手動計(jì)數(shù)數(shù)量與測量根瘤大小，處理能力有限，人為操作還可能會出現(xiàn)較大的誤差。Chung等［33］采用了先進(jìn)的掃描機(jī)器與分析技術(shù)來確定根瘤的數(shù)量和大小，還能夠從根圖像中識別出根表型，大大增加了根瘤研究的準(zhǔn)確性與標(biāo)準(zhǔn)性。因此，先進(jìn)技術(shù)的使用能夠更加準(zhǔn)確地評價(jià)根瘤固氮效率，為快速篩選高效根瘤菌劑提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

阿氏芽孢桿菌與膠質(zhì)類芽孢桿菌分別與根瘤菌包衣接種都能夠促進(jìn)大豆結(jié)瘤固氮，增加大豆植物氮、磷、鉀含量。其中，MB35-5阿氏芽孢桿菌促生效果最好，能夠?yàn)閺?fù)合根瘤菌包衣劑的研發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)，但是3種菌混合卻沒有達(dá)到促生效果的疊加效應(yīng)，可能是因?yàn)閮煞N促生菌間存在種間競爭，導(dǎo)致接種效果不如雙接種。因此，在后續(xù)根瘤菌復(fù)合包衣劑的研發(fā)中要充分考慮促生菌間的協(xié)同性和競爭性，避免根際資源浪費(fèi)，影響接種效果。