一株高效氯嘧磺隆降解菌的分離鑒定及其降解機(jī)理初探

韓曉艷，阮志勇，江 旭，周義清，張慶華

（1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；3．西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，西藏 林芝 860000）

氯嘧磺?。–hlorimuron-ethyl）是美國(guó)杜邦公司于20世紀(jì)80年代研制的一種磺酰脲類(lèi)除草劑，被廣泛應(yīng)用于大豆田中的闊葉雜草、莎草及某些禾本科雜草的防治。該除草劑殘效期長(zhǎng)達(dá)2～3年，長(zhǎng)期大量施用極易對(duì)后茬敏感作物造成藥害，在土壤中沉積可致敏感作物大量減產(chǎn)，形成大豆田輪作障礙［1］。在2004～2006年，牡丹江市應(yīng)用氯嘧磺隆，乙草胺封閉除草發(fā)生藥害面積達(dá)12.23萬(wàn)hm2，經(jīng)濟(jì)損失上千萬(wàn)元［2］。殘留的氯嘧磺隆會(huì)降低土壤酶活性，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力下降，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康也會(huì)產(chǎn)生潛在威脅［3-6］。因此，減少此類(lèi)除草劑在土壤中的殘留成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

消除農(nóng)業(yè)生產(chǎn)氯嘧磺隆等除草劑殘留，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的關(guān)鍵。目前減輕甚至解除環(huán)境中磺酰脲類(lèi)除草劑污染的措施主要包括化學(xué)水解和微生物降解，其中微生物代謝作用顯著［7］。篩選獲得高效氯嘧磺隆降解菌株是氯嘧磺隆污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)的核心和關(guān)鍵。目前已經(jīng)報(bào)道的具有氯嘧磺隆降解能力的微生物有真菌，如擲孢酵母Sporobolomycessp.在含有10 mg/L氯嘧磺隆的麥芽汁液體培養(yǎng)基96 h后對(duì)氯嘧磺隆的降解率為90.12%；黑曲霉Aspergillus niger培養(yǎng)7 d后，可將初始濃度為10 mg/L的氯嘧磺隆降解，降解率達(dá)96.59%［8-11］。細(xì)菌如假單胞菌Pseudomonassp. LW3，7 d內(nèi)可降解70%～80%初始濃度為50 mg/L的氯嘧磺??；克雷伯氏菌Klebsiella jilinsis2N3在30℃、12 h內(nèi)對(duì)100 mg/L氯嘧磺隆的降解率達(dá)92.5%；Hansschlegeliasp. CHL1在30℃、4 d可降解95%濃度為50 mg/L的氯嘧磺隆；紅球菌Rhodococcussp. D310-1在28℃、5 d可將100 mg/L氯嘧磺隆降解89%；嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaD310-3在 pH 5.95、30.15℃條件下，6 d后可降解89.9%濃度為50.21 mg/L的氯嘧磺隆，路德維希氏腸桿菌Enterobacter ludwigii在pH 7.0、30℃條件下，21 d后可降解90.8%濃度為10 mg/L的氯嘧磺?。?，12-18］。此外，也有研究人員對(duì)菌株的降解途徑和功能基因及酶進(jìn)行了研究。據(jù)報(bào)道，Ancylobactersp.XJ-412-1的carboxyesterase基因可將磺酰脲轉(zhuǎn)化為其脫酯衍生物，從而降解磺酰脲類(lèi)除草劑（甲磺?。?9］。克隆了一個(gè)新的酯酶基因sulE，并在Hansschlegelia zhihuaiaeS113中表達(dá)，而該酯酶能夠利用去酯化機(jī)制降解磺酰脲類(lèi)除草劑［20］，分離并在Bacillus subtilisJH3中鑒定出糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)破壞S-N鍵，降解甲磺?。?1］。

目前已報(bào)道的氯嘧磺隆降解菌種類(lèi)相對(duì)較少，僅分布在Rhodotorula、Enterobacter、Pseudomonas、Klebsiella等9個(gè)屬內(nèi)，且降解效果并不突出。因此，繼續(xù)深入挖掘氯嘧磺隆高效降解菌株，豐富降解資源多樣性十分必要，為構(gòu)建高效降解氯嘧磺隆基因工程菌和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)降解菌劑提供支撐。本研究從安徽合肥某磺酰脲類(lèi)除草劑生產(chǎn)廠廢水處理活性污泥中分離出一株以氯嘧磺隆為唯一氮源的高效降解菌，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定及降解特性研究，并對(duì)其降解氯嘧磺隆的代謝途徑及相關(guān)降解基因進(jìn)行探索，為該類(lèi)除草劑污染環(huán)境的生物修復(fù)提供優(yōu)良的降解微生物資源，也為氯嘧磺隆生物降解提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

供試樣品采自安徽合肥某磺酰脲類(lèi)除草劑生產(chǎn)廠廢水處理池的活性污泥中，采集后裝入滅菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于氯嘧磺隆降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑

氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自合肥久易農(nóng)資公司，純度為≥98%，Taq DNA聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物購(gòu)自北京博邁德有限公司，甲醇、乙腈等有機(jī)試劑均為色譜純，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MSM培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1，pH 7.0；GSM培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1、Glucose 5，pH 7.0；Luria-Bertani LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、Agar 20，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 氯嘧磺隆降解菌的富集與分離

取10 g污泥樣品，加入100 mL MSM培養(yǎng)基（含100 mg/L氯嘧磺?。┲?，置于恒溫?fù)u床中，在30℃避光振蕩培養(yǎng)（160 r/min）。培養(yǎng)7 d后，取10 mL培養(yǎng)液接入100 mL新鮮MSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每次提高氯嘧磺隆濃度100 mg/L，并使氯嘧磺隆終濃度達(dá)到500 mg/L。取最終富集的培養(yǎng)液，稀釋涂布至MSM固體培養(yǎng)基上（含100 mg/L氯嘧磺?。?，于30℃條件下避光培養(yǎng)2 d，挑取生長(zhǎng)較快的單菌落，經(jīng)平板劃線純化，再分別接入含 50mg/L的氯嘧磺隆GSM培養(yǎng)液中，測(cè)量其降解能力，選取降解能力較強(qiáng)的菌株保存用于后續(xù)研究。

1.2.2 氯嘧磺隆降解菌的初步鑒定

形態(tài)特征鑒定：采用平板涂布法接種，30℃恒溫培養(yǎng)2 d后觀察菌落形態(tài)；采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類(lèi)型。同時(shí)對(duì)獲得的降解菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，具體如下：利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取菌株的基因組DNA，以此為PCR擴(kuò)增模版，利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為T(mén)aq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，1492R 1 μL，27F 1μL，DNA template 2 μL；總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為1500 bp左右。將PCR產(chǎn)物送到北京博邁德有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至EzBioCloud進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，下載相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并分析。

1.2.3 氯嘧磺隆降解菌降解能力的測(cè)定

將分離到的菌株接種于GSM培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)菌液在8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min后，棄上清，菌體用新鮮的0.9% NaCl生理鹽水洗滌3次后重懸，以5%接種量加入含有50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min條件下避光培養(yǎng)，研究降解菌對(duì)氯嘧磺隆的降解效果。檢測(cè)采用高效液相色譜法，具體檢測(cè)條件為色譜柱C18 反 相 柱（5 μm，4.6×150 mm i.d.，Diamonsil，USA），流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰乙酸=68∶32∶0.1（V∶V∶V），柱溫為28℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min。依據(jù)檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm處氯嘧磺隆的峰面積結(jié)果，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出培養(yǎng)液中氯嘧磺隆的濃度，再根據(jù)公式降解率（%）=（1-實(shí)測(cè)殘量/對(duì)照樣實(shí)測(cè)殘量）×100計(jì)算降解能力［22-23］。

1.2.4 氮源對(duì)氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影響

將5 mL的LAM2021菌懸液（OD600為1.0）接種于100 mL含有不同氮源（CK、硫酸銨、磷酸二氫銨、尿素、蛋白胨、氯化銨）的GSM培養(yǎng)基中，置30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 氯嘧磺隆降解菌降解特性及降解條件優(yōu)化

菌株的降解特性研究包括菌株對(duì)溫度、pH及不同除草劑濃度的降解能力。設(shè)置不同溫度（20、30、40℃）、不同除草劑濃度（0、50、100 mg/L）、不同pH（5.0、7.0、9.0），研究不同條件對(duì)菌株LAM2021降解氯嘧磺隆的影響。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。將菌株接種至不同條件下含氯嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中作為處理組，以相同條件下不接入菌株為對(duì)照組。分別培養(yǎng)3、6、9 h后，取樣測(cè)定樣品中氯嘧磺隆殘留的濃度并根據(jù)1.2.3中的公式計(jì)算降解率。

利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken design（BBD）模型進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以pH（A）、溫度（B）、底物濃度（C）為自變量，以降解率為唯一響應(yīng)值。二次回歸方程用以擬合自變量和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。

1.2.6 短鏈有機(jī)酸的鑒定

利用HPLC檢測(cè)并鑒定菌株LAM2021在GSM培養(yǎng)基中產(chǎn)短鏈有機(jī)酸的情況，檢測(cè)條件：流動(dòng)相為磷酸二氫銨（0.02 mmol/L，pH=2.7）與甲醇混合物（比例為85∶15，V∶V），進(jìn)樣量為10 μL，光電二極管陣列檢測(cè)器的波長(zhǎng)為210 nm，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，以分析純級(jí)草酸、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸和富馬酸作為參照標(biāo)樣。

1.2.7 菌株降解氯嘧磺隆中間代謝產(chǎn)物的檢測(cè)與代謝途徑推測(cè)

將菌株LAM2021接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將培養(yǎng)液于8000 r/min條件下離心5 min，丟棄上清，收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌2次后制成OD600為1.0的菌懸液。以5%的接種量，將LAM2021菌懸液（OD600=1.0）接種到含50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中，以相同條件但不接菌為對(duì)照，分別培養(yǎng)1 d后取樣，上述所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。使用配備電噴霧電離Xevo三重四極桿（Xevo-TQD）質(zhì)譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)量模式m/z為100～450，Masslynx NTV的正模式（ESI+）和負(fù)模式（ESI-）的ESI源被用于收集和分析獲得的數(shù)據(jù)。

1.2.8 氯嘧磺隆降解菌全基因組測(cè)序及分析

將菌株LAM2021接種到LB液體培養(yǎng)基中，在160 r/min和30℃條件下振蕩培養(yǎng)2 d后，8000r/min離心5 min，用磷酸緩沖液洗滌，收集足量菌體，送至廣東美格基因科技有限公司開(kāi)展全基因組測(cè)序工作，具體流程參考文獻(xiàn)［24］。菌株全基因序列文件組裝完成后，分析預(yù)測(cè)編碼基因、非編碼RNA、重復(fù)序列、CRISPR等基因組成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼基因序列進(jìn)行功能注釋。結(jié)合已報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)中獲得的對(duì)微生物降解氯嘧磺隆的信息，搜索并預(yù)測(cè)與降解相關(guān)的功能基因及其信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯嘧磺隆降解菌的分離

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)和平板稀釋涂布分離，自磺酰脲類(lèi)除草劑生產(chǎn)廢水處理池污泥中分離獲得1株對(duì)氯嘧磺隆具有高效降解效果的菌株LAM2021，11 h內(nèi)對(duì)50 mg/L濃度的氯嘧磺隆降解率達(dá)到90%以上，對(duì)該菌株進(jìn)行后續(xù)研究。該菌株為革蘭氏陰性菌（圖1A），在LB固體培養(yǎng)基上，菌落呈白色，不透明，表面光滑，形態(tài)呈圓形（圖1B）。

圖1 菌株LAM2021的革蘭氏染色結(jié)果與在LB平板上的菌落形態(tài)

2.2 基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株LAM2021的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（序列登錄號(hào)為MW429194），以該序列信息在EzBiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，LAM2021的16S rRNA基因序列與Kosakonia sacchari（JQ001784）相似性最高，達(dá)到99.32%；與Kosakonia pseudosacchari（FXWP01000029）的相似性是98.91%。從利用 NJ（Neighbor Joining method）法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）中可以看出，菌株LAM2021與來(lái)自Kosakonia屬的菌株聚在一起，形成一個(gè)獨(dú)立的分支，因此，初步將該菌株鑒定 為Kosakoniasp. LAM2021。Kosakonia sacchari的基因組信息在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。通過(guò)OrthoANIu algorithm（https：//www.ezbiocloud.net/tools/ani）分 析 疑似新種菌株與相似菌株的平均核苷酸水平（ANI）可得，LAM2021的基因組序列Kosakonia sacchari的ANI值是95.79%，Kosakonia pseudosacchari的ANI值是93.84%；同時(shí)利用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http：//ggdc.dsmz.de/）對(duì)疑似新種與相似菌株間的DNA同源性（DDH）值進(jìn)行計(jì)算。LAM2021的基因組序列Kosakonia sacchari的DDH值是65.30%，Kosakonia pseudosacchari的DDH值是54.10%。

圖2 菌株LAM2021 的 16S rRNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

2.3 氮源對(duì)氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影響

將菌株LAM2021接種到不同氮源的GSM培養(yǎng)基中，于30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，外加氮源能夠提高氯嘧磺隆的降解能力，其中氮源為硫酸銨，菌株的降解能力最強(qiáng)，因此氯嘧磺隆最佳的氮源是硫酸銨。

圖3 不同氮源對(duì)菌株LMA2021降解能力的影響

2.4 氯嘧磺隆降解菌降解條件優(yōu)化

菌株LAM2021能以氯嘧磺隆為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，從降解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同氯嘧磺隆底物濃度對(duì)菌株LAM2021的降解率影響較?。▓D4A），而在160 r/min、pH 7.0、接種量為5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物濃度為100 mg/L的條件下，溫度對(duì)菌株LAM2021的降解率影響較大（圖4B），菌株在30℃時(shí)的降解率達(dá)到最大值，為92.6%；菌株在20℃中9 h內(nèi)幾乎不降解，說(shuō)明菌株LAM2021在低溫下生長(zhǎng)較慢。在160 r/min、30℃、接種量為5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物濃度為100 mg/L的條件下，pH為5.0～9.0的范圍內(nèi)，降解率先增加后減少（圖4C），pH為7.0的降解率在9 h達(dá)到最大值88.6%，同時(shí)9 h后pH為5.0時(shí)，菌株的降解率達(dá)到100%。

圖4 不同環(huán)境因素對(duì)氯嘧磺隆降解的影響

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6，對(duì)BBD模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析得到擬合模型：Y=-345.58+65.30A+13.83B+0.50978C-0.564AB-0.080AC-8.067BC-3.38A2-0.155B2-6.56C2，回歸方程中，Y為菌株LAM2021氯嘧磺隆降解率；其中A為pH、B為溫度、C為底物濃度。

利用Design-Expert 8.0.6分析得出菌株LAM2021對(duì)氯嘧磺隆降解率響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果見(jiàn)圖4D。菌株LAM2021采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示氯嘧磺隆的最佳降解條件為：在接種量5%的基礎(chǔ)上，30℃、pH 6.0，底物濃度50 mg/L。雖然pH為5.0時(shí)，氯嘧磺隆降解率可達(dá)100%，可以推斷出氯嘧磺隆在酸性條件下可以發(fā)生水解，但是酸性條件下氯嘧磺隆以化學(xué)水解為主，而中性或偏中性有利于菌株LAM2021的生長(zhǎng)和降解酶活性的提高。

2.6 氯嘧磺隆降解菌LAM2021產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸的鑒定

菌株LAM2021在含氯嘧磺隆的GSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液體系pH在1 d之內(nèi)從7.0降至3.4，由于氯嘧磺隆在酸性條件下極不穩(wěn)定，推測(cè)菌株LAM2021對(duì)氯嘧磺隆的降解存在由于pH下降造成酸解的機(jī)制。利用HPLC對(duì)菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有檸檬酸的產(chǎn)生。同時(shí)不同時(shí)間取樣，發(fā)現(xiàn)在22 h有檸檬酸的大量累積，累積量高達(dá)750 mg/L（圖5）。

圖5 降解菌LAM2021在GSM培養(yǎng)基產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸

2.7 菌株LAM2021降解氯嘧磺隆代謝產(chǎn)物檢測(cè)及其代謝途徑推測(cè)

利用LC-MS檢測(cè)了菌株LAM2021與氯嘧磺隆共培養(yǎng)1 d后的中間代謝產(chǎn)物。通過(guò)ESI源檢測(cè)結(jié)果表明，在陰離子模式中，共檢測(cè)到5個(gè)片段，質(zhì)荷比分別為413.03、228.03、200、181.99、158.01 m/z。根據(jù)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜的結(jié)果及其氯嘧磺隆自身的結(jié)構(gòu)特征，初步判定物質(zhì)A是氯嘧磺隆，物質(zhì)B是鄰甲酸乙酯苯磺酰胺，物質(zhì)C是鄰甲酸苯磺酰胺，物質(zhì)D是N-醛基糖精，物質(zhì)E是2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶（圖6）。

圖6 降解菌LAM2021的代謝產(chǎn)物

氯嘧磺隆在GSM培養(yǎng)基中，在微生物的作用下，磺酰脲橋首先發(fā)生斷裂，生成產(chǎn)物2-氨基-4-氯-6甲氧基嘧啶（產(chǎn)物E）和鄰甲酸乙酯苯磺酰胺（產(chǎn)物B）。鄰甲酸乙酯苯磺酰胺繼續(xù)在微生物的代謝作用下發(fā)生水解反應(yīng)，生成鄰甲酸苯磺酰胺（產(chǎn)物C）。由于鄰磺酰胺苯甲酸不穩(wěn)定，發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成N-醛基糖精（產(chǎn)物D）?；谝陨蠙z測(cè)到的代謝產(chǎn)物，推測(cè)LAM2021降解氯嘧磺隆的代謝途徑如圖7所示。

圖7 降解菌LAM2021的代謝途徑

2.8 氯嘧磺隆降解菌的基因組信息

將菌株LAM2021的基因組信息提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（序列登錄號(hào)為：JAENHT000000000），全基因組測(cè)序結(jié)果如表1所示。

表1 LAM2021的基因組組分分析

基于已報(bào)道的氯嘧磺隆降解基因信息，菌株LAM2021中有17個(gè)可能與降解相關(guān)的功能基因，包括2個(gè)羧酸酯酶基因、5個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因、10個(gè)酯酶基因。

3 討論

3.1 氯嘧磺隆的降解

長(zhǎng)期大量施用氯嘧磺隆產(chǎn)生的殘留會(huì)對(duì)后茬敏感作物造成一定的藥害，造成產(chǎn)量下降，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染，還會(huì)通過(guò)食物鏈影響人類(lèi)健康。因此探尋高效、安全、經(jīng)濟(jì)的除草劑污染環(huán)境治理方法十分迫切。在生態(tài)系統(tǒng)中，微生物對(duì)于農(nóng)藥的降解起著關(guān)鍵的作用，以微生物修復(fù)理論為基礎(chǔ)的除草劑殘留降解技術(shù)是解決土壤修復(fù)問(wèn)題的有效途徑［25］。目前，已報(bào)道的可降解細(xì)菌種屬以假單胞菌和黃桿菌屬為代表的革蘭氏陰性菌占多數(shù)，這些細(xì)菌借助外壁層脂多糖保護(hù)，免受農(nóng)藥的毒害，對(duì)多種農(nóng)藥有分解作用［26］。本研究從某磺酰脲類(lèi)除草劑生產(chǎn)廠廢水處理池活性污泥中，富集馴化分離出一株氯嘧磺隆高效降解菌LAM2021，經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)分析，初步將該菌株鑒定為Kosakoniasp.，這是首次關(guān)于Kosakonia屬菌株具有氯嘧磺隆降解功能的報(bào)道，豐富了氯嘧磺隆降解微生物資源多樣性。

3.2 初探氯嘧磺隆降解菌降解氯嘧磺隆的降解機(jī)理

在已報(bào)道的氯嘧磺隆微生物降解途徑與相關(guān)機(jī)制中，氯嘧磺隆主要通過(guò)脲橋斷裂和酯鍵斷裂兩類(lèi)反應(yīng)完成降解。Ma等［12］在氯嘧磺隆的降解產(chǎn)物研究中發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶。Zou等［27］在真菌TR-H降解氯嘧磺隆過(guò)程中發(fā)現(xiàn)鄰磺酰苯甲酸亞胺和2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶兩種產(chǎn)物。在本研究中，利用LC-MS共檢測(cè)到4種代謝產(chǎn)物（鄰磺酰苯甲酸亞胺、鄰甲酸乙酯苯磺酰胺、鄰甲酸苯磺酰胺和2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶）。同時(shí)監(jiān)測(cè)到菌株與氯嘧磺隆共培養(yǎng)過(guò)程中，體系的pH從7.0減少到3.4，致使環(huán)境酸化，造成氯嘧磺隆的脲橋發(fā)生斷裂［28］。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，這是由于菌株在代謝過(guò)程中主要產(chǎn)生檸檬酸所致。同時(shí)該菌株中還有多個(gè)已報(bào)道的參與氯嘧磺隆降解的功能基因，如羧酸酯酶基因、細(xì)胞色素P-450基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因等［29］，其中羧酸酯酶主要參與氯嘧磺隆的酯鍵斷裂［30］。

4 結(jié)論

本研究從安徽合肥某磺酰脲類(lèi)除草劑生產(chǎn)廢水處理池污泥中分離獲得一株高效氯嘧磺隆降解菌Kosakoniasp. LAM2021。通過(guò)RSM方法優(yōu)化出該菌株的最佳降解條件為：30℃，底物濃度為50 mg/L，pH為6.0。在此條件下，降解率為94.6%?；诖x產(chǎn)物初步推定了菌株降解氯嘧磺隆的降解途徑；菌株代謝氯嘧磺隆過(guò)程中主要通過(guò)代謝產(chǎn)生檸檬酸，排出胞外致使環(huán)境酸化，造成除草劑脲橋斷裂。通過(guò)菌株的全基因組信息分析，發(fā)現(xiàn)該菌株含有大量已報(bào)道參與氯嘧磺隆降解的功能基因。本研究從菌株降解特性、降解條件優(yōu)化、代謝途徑及降解相關(guān)功能基因4個(gè)層面系統(tǒng)探索了新分離菌株Kosakoniasp. LAM2021對(duì)氯嘧磺隆的降解特性及代謝機(jī)理，結(jié)果表明，該菌株對(duì)氯嘧磺隆具有較高的降解能力，為今后高效降解工程菌株的構(gòu)建與功能菌劑的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)良的菌株。