張悅，趙勇，鄭金鳳，劉雁鳴，謝瑩瑩*（1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，長沙 410001；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410001）

乳酸（lactic acid）又名2-羥基丙酸，是一種天然存在的重要有機(jī)酸，作為消毒防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、助溶劑等，可用于肌內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、口服糖漿、片劑、外用和陰道用制劑[1-2]。

乳酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生甲醇、乙醇等有機(jī)副產(chǎn)物，采用酯化水解法也可能使用甲醇和乙醇與乳酸成酯[3-4]。這些溶劑的殘留會對人體健康造成危害，控制其殘留量對保證藥品質(zhì)量和用藥安全有重要意義。目前歐洲藥典（EP10.0）[5]規(guī)定了注射用乳酸中甲醇的限度（不得過50 μg·g－1），而我國尚未見乳酸中殘留溶劑檢測方面的相關(guān)報(bào)道。為考察國內(nèi)乳酸中甲醇、乙醇?xì)埩舻恼w情況，本研究根據(jù)《人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會質(zhì)量部分》（ICH）[6]的指導(dǎo)原則（甲醇每日允許暴露量30.0 μg·g－1，乙醇每日允許暴露量50.0 μg·g－1）和《中國藥典》2020年版四部[7]中的相關(guān)規(guī)定，并參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，擬建立GC-MS/MS法測定乳酸中甲醇、乙醇的含量，并評價(jià)國內(nèi)市場收集的33批乳酸的總體質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890-7010B GC-MS/MS色譜儀（美國安捷倫公司）；MS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為十萬分之一）；VF-WAX ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國安捷倫公司）；固定液為聚乙二醇（PEG-20 M）。

1.2 試藥

甲醇（純度≥99.99%，美國霍尼韋爾公司，批號：12G1H）；乙醇（純度≥99.9%，德國CNW Technologies GmbH公司，批號：E5450210）。33批乳酸樣品包括12批原料藥級、13批藥用輔料、5批食品級、2批工業(yè)級及1批進(jìn)口高純級，詳細(xì)信息見表1。

表1 乳酸樣品信息Tab 1 Lactic acid sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取甲醇、乙醇適量，精密稱定，用水溶解并稀釋成10 mg·mL－1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水配制成質(zhì)量濃度為0、5、10、50、100、150 μg·mL－1的系列對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取乳酸0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，精密加入5 mL 水溶解，即得。

2.2 色譜條件

程序升溫：初溫50℃，保持4 min，以30℃·min－1的升溫速率升至200℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度220℃；載氣為高純He（純度＞99.999%）；流速2.0 mL·min－1，分流進(jìn)樣，分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 mL；頂空瓶平衡溫度80℃，平衡時(shí)間30 min，定量環(huán)溫度90℃，傳輸線溫度100℃。

2.3 質(zhì)譜條件

采用電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，離子源溫度230℃，溶劑延遲0.5 min，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描。甲醇：定量離子對為m/z32.1＞30.1，碰撞能量（CE）5 eV；定性離子對為m/z32.1＞28.1，碰撞能量5 eV。乙醇：定量離子對為m/z46.1＞45.1，碰撞能量5 eV；定性離子對為m/z46.1＞31.1，碰撞能量5 eV。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.1”項(xiàng)下空白溶液（水）、對照品溶液和供試品溶液各5 mL，注入GC-MS/MS儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，空白溶液無干擾，各雜質(zhì)能有效分離。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig 1 Chromatogram of specificity test

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量限

精密量取甲醇、乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水定量稀釋制成0、5、10、50、100、150 μg·mL－1系列對照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y甲醇＝1.82x＋0.65，r＝0.9999；y乙醇＝3.99x－0.27，r＝0.9997。甲醇、乙醇在0～150 μg·mL－1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用信噪比S/N≈3計(jì)算檢出限，得甲醇、乙醇的檢出限分別為9.85、11.60 ng·mL－1；S/N≈10計(jì)算定量限，得甲醇、乙醇的定量限分別為32.83、38.67 ng·mL－1。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：CD190602C）0.5 g，置頂空瓶中，加入“2.1.1”項(xiàng)下對照品溶液（甲醇49.2 μg·mL－1，乙醇50.1 μg·mL－1）5 mL，平行制備6份，進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，計(jì)算甲醇、乙醇含量。結(jié)果甲醇平均含量為45.7 μg·mL－1，RSD為4.6%；乙醇平均含量為45.2 μg·mL－1，RSD為5.7%。說明本方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 樣 品（批 號：CD190602C）5 g，置50 mL量瓶中，加對照品溶液（甲醇、乙醇：50 μg·mL－1）50 mL稀釋并定容至刻度，再精密量取5 mL，置頂空瓶中，于0、2、4、8、12、20 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果供試品溶液在20 h內(nèi)甲醇、乙醇峰面積的RSD分別為4.5%、5.3%（n＝6），表明方法穩(wěn)定性良好。

2.8 回收試驗(yàn)

取樣品（批號：CD190602C）約0.5 g，共6份，置頂空瓶中，精密加入對照品溶液（甲醇4.987 μg·mL－1，乙 醇5.132 μg·mL－1）5 mL，進(jìn)樣測定。結(jié)果甲醇、乙醇平均回收率分別為93.5%（RSD＝4.0%）、89.8%（RSD＝4.3%），說明本法準(zhǔn)確度好。

2.9 樣品測定

取33批乳酸樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備，平行制備兩份，進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中甲醇、乙醇含量，結(jié)果有2批次檢測出殘留溶劑，四川金川制藥有限公司200801批次的樣品檢出乙醇9.4 μg·mL－1，武藏野化學(xué)（中國）有限公司的樣品檢出甲醇8.7 μg·mL－1。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

選擇質(zhì)譜專用毛細(xì)管色譜柱DB-1 ms、HP-5 ms、DB-624 ms和VF-WAX ms進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示VF-WAX ms毛細(xì)管柱進(jìn)行分離時(shí)，分離效果最好，且靈敏度較高，峰形最尖銳、對稱，故選用VF-WAX ms毛細(xì)管柱為色譜柱。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

取10 μg·mL－1的甲醇、乙醇溶液進(jìn)行MS1 Scan 模式全掃描，掃描范圍10～200 amu，通過譜庫檢索確定各成分，并選擇豐度最高的離子作為母離子（m/z32.1作為甲醇母離子，m/z46.1作為乙醇母離子）。再對母離子進(jìn)行Product ion掃描，確定各產(chǎn)物離子的時(shí)間片斷和駐留時(shí)間，選擇豐度最高的特征碎片離子作為子離子。設(shè)定不同碰撞池電壓的運(yùn)行序列（CE：3、5、8、10 V），優(yōu)化子離子的最佳碰撞能量，建立MRM方法。

3.3 平衡溫度和平衡時(shí)間的考察

頂空氣體的濃度隨著平衡溫度的升高而升高，當(dāng)瓶內(nèi)處于氣液平衡后，各組分響應(yīng)值趨于穩(wěn)定[11-13]。本研究考察了不同溫度80、90、100、110℃下各組分的響應(yīng)情況。發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇響應(yīng)值隨平衡溫度升高而增大，但溫度升至90℃以后，響應(yīng)值變化不明顯?？紤]到平衡溫度太高，頂空瓶氣密性變差，會影響測定結(jié)果的穩(wěn)定性，故選擇90℃作為最佳的平衡溫度。在平衡溫度90℃條件下，對不同平衡時(shí)間20、30、40、50 min的平衡效果進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇響應(yīng)值隨著時(shí)間的增加而增加，當(dāng)時(shí)間超過30 min后，響應(yīng)值變化較小，故最終選擇30 min作為最佳的平衡時(shí)間。

3.4 國內(nèi)市場中不同級別乳酸質(zhì)量情況

本研究結(jié)果顯示，33批乳酸樣品中，僅1批樣品檢出乙醇（為藥用輔料級），1批樣品檢出甲醇（為進(jìn)口高純級），其他樣品均未檢出殘留溶劑?！吨袊幍洹?020年版四部通則0861殘留溶劑測定法規(guī)定乙醇限度為0.5%，甲醇限度為0.3%；EP10.0規(guī)定注射用乳酸控制甲醇不得過50 μg·g－1。本研究33批次乳酸中的乙醇和甲醇?xì)埩袅烤h(yuǎn)低于上述限度。說明國內(nèi)市場中原料藥、藥用輔料、食品級、工業(yè)級、進(jìn)口高純級等不同級別乳酸整體工藝控制良好，甲醇、乙醇?xì)埩袅枯^低。

甲醇是ICH中第二類溶劑，是非遺傳毒性動(dòng)物致癌或可能導(dǎo)致其他不可逆毒性神經(jīng)毒性或致畸形的試劑，為應(yīng)限制的溶劑。本次研究收集到1批進(jìn)口高純級樣品，且在這批樣品中檢出少量甲醇，故應(yīng)多關(guān)注高純級樣品的溶劑殘留情況。另外研究中還發(fā)現(xiàn)，有藥品生產(chǎn)企業(yè)混用不同級別乳酸的情況，如將食品級（2021032931）乳酸當(dāng)作藥用輔料級用于藥品生產(chǎn)中。故監(jiān)管部門應(yīng)多關(guān)注乳酸的混用情況，特別注意高純級乳酸用于藥品或食品市場中的溶劑殘留情況。