Ramdhan Dwi NUGROHO，Dieudonné Mahukpégo DANSOU，王浩，賀維朝，張軍民，湯超華，趙青余，秦玉昌

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北動物遺傳資源與營養(yǎng)科學觀測實驗站，北京 100193）

天然蝦青素作為一種非維生素A 源類胡蘿卜素，具有著色、抗氧化、提高免疫力、預防慢性疾病、抑制腫瘤和延緩衰老等功能。天然蝦青素的重要來源——雨生紅球藻在國內(nèi)已被批準為新食品資源（2010 年第17 號），并加入《飼料原料目錄》中（2018 年第1773 號）。研究表明，在蛋雞飼糧中添加雨生紅球藻可改善蛋雞抗氧化能力，提高雞蛋的蛋黃顏色和蝦青素含量。但由于天然蝦青素易氧化、易光解的特點，使其在應用過程中對加工、儲存等條件均有較高的要求。加之生物來源相對有限，極大地限制了天然蝦青素在畜禽養(yǎng)殖中的應用。為擴大蝦青素的應用范圍及提高天然蝦青素資源的多樣性，中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所作物代謝調(diào)控與營養(yǎng)強化團隊通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控-胡蘿卜素的羥化酶基因和酮酶基因，使玉米可利用玉米黃質(zhì)為底物進一步合成蝦青素，獲得富蝦青素玉米。該玉米中的蝦青素雖然具有更好的生產(chǎn)潛力和穩(wěn)定性，但富蝦青素玉米作為一種全新的飼料資源，其應用于蛋雞的營養(yǎng)有效性尚未可知。因此，本試驗以高峰期蛋雞為試驗動物，研究富蝦青素玉米對蛋雞生產(chǎn)性能、雞蛋品質(zhì)、抗氧化能力及蝦青素富集的影響，以期為富蝦青素玉米的開發(fā)與應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 蝦青素微囊粉通過提取雨生紅球藻中蝦青素，再由微囊包埋制得，蝦青素含量2.84%（云南愛爾康生物技術(shù)有限公司）。富蝦青素玉米通過調(diào)控八氫番茄紅素的合酶基因、去飽和酶基因與-胡蘿卜素的羥化酶基因、酮酶基因結(jié)合獲得，蝦青素含量為38.60 mg/kg，由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計及試驗飼糧 試驗采用單因素設(shè)計，選用28 周齡海蘭褐蛋雞270 只，按產(chǎn)蛋率無顯著性差異原則分為3 組，每組6 重復，每重復15 只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，蝦青素組在基礎(chǔ)飼糧中添加蝦青素0.086%，富蝦青素玉米組飼糧則使用的富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因玉米替換普通玉米配制。蝦青素組與富蝦青素玉米組飼糧蝦青素含量計算值相同（24.32 mg/kg，以總蝦青素計）。預試期1 周，正試期8 周。飼糧參照《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33—2004）配制，飼糧配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗蛋雞采用3 層階梯式蛋雞籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每日喂料3 次，撿蛋1 次。舍內(nèi)光照周期16 L:8 D，采取自然光照結(jié)合早晚補光，光照強度15 Lx?？v向負壓通風結(jié)合自然通風，舍溫（24±2）℃，相對濕度45%～50%，常規(guī)免疫。

1.4 生產(chǎn)性能 試驗期間，每日按重復記錄產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重，每兩周統(tǒng)計耗料量1 次。計算試驗期內(nèi)的產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

1.5 蛋品質(zhì) 正試期8 周末，每組每重復選取接近平均蛋重的3 枚無破損雞蛋，于采樣后8 h 內(nèi)完成蛋品質(zhì)指標測定。蛋黃顏色（羅氏比色法）、蛋白高度和哈氏單位采用蛋品質(zhì)自動分析儀測定（EA-01，Orka Food Technology Ltd.）。蛋黃顏色空間體系（Commission Internationale de l'Eclairage，CIELab）值采用色度分析儀（CR-400,Konica Minolta Investment Ltd.），L*為亮度值，a*為紅度值，b*為黃度值。

1.6 蝦青素和玉米黃質(zhì)測定 正試期8 周末，采集雞蛋分離蛋黃，稱取蛋黃約1 g 置于15 mL 離心管中，錫箔紙包裹離心管或在避光條件下進行操作，加入5 mL 四氫呋喃:甲醇（1:1）混合液，渦旋振蕩2 min（蛋黃樣品需加入鋼珠協(xié)助混勻）?；靹蚝?0℃水浴20 min，取出后振蕩2 min。加5 mL 乙酸乙酯，振蕩1 min。4 000 r/min，離心5 min，提取上清液1 mL 至1.5 mL離心管中。10 000 r/min離心10 min，過0.45 μm 濾膜后，加入棕色上樣瓶中上機。采用高效液相色譜（LC-20A，Shimadzu Corp.,Kyoto Japan）分析。色譜柱 為C（250 mm × 4.6 nm，5 μm），柱溫為25 ℃，紫外檢測器波長為474 nm，進樣量為10 μL。柱速為1.0 mL/min。流動相為有機相A 92%（甲醇:叔丁基甲基醚，81:15），水相B 8%（超純水），等梯度洗脫12 min。

蝦青素富集效率計算公式：

其中，蛋黃蝦青素含量（μg/g）為每克蛋黃中蝦青素含量，蛋黃比例（%）為蛋黃重/蛋重，平均日產(chǎn)蛋量[g/（d·只）]為平均每日每只雞產(chǎn)蛋重量，平均日采食量[g/（d·只）]為平均每日每只雞采食重量，飼糧蝦青素含量（μg/g）為每克飼糧中蝦青素含量。

1.7 血清抗氧化指標測定 正試期8 周末，每組選取12 只雞（每重復2 只），翅靜脈竇采血于分離膠促凝管中，3 000 r/min 離心取得血清于-25℃條件保存?zhèn)溆?。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物還原酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA），具體操作均按照說明書進行。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件（SPSS Inc，Chicago IL）檢驗數(shù)據(jù)的方差齊次性，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)再采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用Tukey's HSD 法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差顯示，<0.05 表示差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 富蝦青素玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 由表2 可知，不同周齡和試驗全期各組間產(chǎn)蛋率和平均蛋重均無顯著差異。各周齡內(nèi)，各組間平均日采食量無顯著差異；與對照組相比，蝦青素組和富蝦青素玉米組試驗全期平均日采食量降低（<0.05），且試驗全期料蛋比具有降低趨勢（=0.051，=0.059）。蝦青素與富蝦青素玉米組間，不同周齡及試驗全期各項生產(chǎn)性能指標均無顯著差異。

表2 富蝦青素玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 富蝦青素玉米對雞蛋內(nèi)部品質(zhì)的影響 由表3 可知，各組間蛋品質(zhì)的蛋白高度、哈夫單位及蛋黃百分比均無顯著差異。與對照組相比，蝦青素和富蝦青素玉米均可提高蛋黃顏色（羅氏比色法）及蛋黃顏色a*值，其中富蝦青素玉米組a* 值高于其他2 組（<0.05）。蝦青素組和富蝦青素玉米組蛋黃顏色L*和b*值均低于對照組（<0.05），且富蝦青素玉米組蛋黃顏色b* 值低于其他2 組（<0.05）。

表3 富蝦青素玉米對雞蛋內(nèi)部品質(zhì)的影響

2.3 富蝦青素玉米對蛋黃蝦青素含量、富集效率及葉黃素含量的影響 由表4 可知，對照組蛋黃中未檢出蝦青素，蝦青素和富蝦青素玉米組蛋黃蝦青素含量分別為13.67 μg/g 和14.15 μg/g，且2 組間蝦青素含量及富集效率均無顯著差異。與對照組相比，蝦青素組蛋黃玉米黃質(zhì)含量數(shù)值降低（>0.05）。富蝦青素玉米組玉米黃質(zhì)含量則低于對照組和蝦青素組（<0.05）。

表4 富蝦青素玉米對雞蛋蝦青素含量、富集效率及葉黃素含量的影響

2.4 富蝦青素玉米對蛋雞血清抗氧化指標的影響 由表5 可知，與對照相比，蝦青素組和富蝦青素玉米組可提高血清T-AOC、GSH-Px 并降低NO（>0.05），其中，蝦青素組GSH-Px 具有升高趨勢（=0.092）。蝦青素及富蝦青素玉米組血清SOD 與對照組相比具有提高趨勢（=0.098），蝦青素組數(shù)值最高（=0.057）。蝦青素與富蝦青素玉米均可降低蛋雞血清中的MDA（<0.05），且兩組之間無顯著差異。

表5 富蝦青素玉米對蛋雞血清抗氧化的影響

3 討 論

3.1 富蝦青素玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 富蝦青素玉米作為蛋雞飼糧的主要能量來源，在評價營養(yǎng)有效性時，首先會關(guān)注其對蛋雞生產(chǎn)性能的影響。由于本試驗首次評價富蝦青素玉米的營養(yǎng)有效性，因此采用完全替換飼糧玉米的方式與對照組、蝦青素組（正對照組）進行比較。本研究結(jié)果顯示，蝦青素組與富蝦青素玉米組的生產(chǎn)性能指標均無顯著差異，表明富蝦青素玉米作為蛋雞飼糧的能量飼料與普通玉米無顯著差異；與對照組相比，蝦青素與富蝦青素玉米均具有改善飼料利用率的趨勢，表明2 種來源的蝦青素在蛋雞生產(chǎn)性能上發(fā)揮了相似作用。由于蝦青素的生物學功能多以抗氧化為基礎(chǔ)，而高峰期蛋雞體內(nèi)氧化應激程度相對較低。因此，飼糧中添加蝦青素通常對高峰期蛋雞生產(chǎn)性能無顯著影響或是有小幅改善作用。

3.2 富蝦青素玉米對雞蛋內(nèi)部品質(zhì)的影響 蛋白高度和哈夫單位是反映雞蛋新鮮程度的蛋品質(zhì)指標，主要受飼糧蛋白組成和蛋雞日齡等因素影響。由于高峰期蛋雞的雞蛋品質(zhì)相對穩(wěn)定，在基礎(chǔ)飼糧無差異前提下，添加不同水平和不同來源的蝦青素通常對蛋白高度和哈氏單位無顯著影響。本試驗也得到了相似結(jié)果。蛋黃顏色作為雞蛋的重要感官品質(zhì)指標，主要受飼糧中脂溶性色素的影響。在玉米-豆粕型飼糧中，玉米黃質(zhì)是形成蛋黃顏色的關(guān)鍵色素；當飼糧中添加其他脂溶性色素時，蛋黃顏色則由玉米黃質(zhì)和其他色素共同調(diào)控。大量研究表明，飼糧添加蝦青素可顯著提高蛋黃顏色（羅氏比色法），且蛋黃顏色提高與蝦青素添加水平呈正相關(guān)。在本試驗中也得到了相似的結(jié)果，通過CIELab 值進一步分析蛋黃顏色可知，與對照組相比，蝦青素與富蝦青素玉米均提高了蛋黃顏色的a*值，并降低了L*值、b*值。其原因在于蝦青素富集于蛋黃后，其暗紅色的著色特點可使蛋黃顏色a*值顯著提高，并抑制了玉米黃質(zhì)在高L* 值和b* 值上的表現(xiàn)。蛋黃在兩者的共同作用下呈現(xiàn)橘黃或橘紅色，進而導致羅氏比色單位提高。此外，富蝦青素玉米以玉米黃質(zhì)為底物進行蝦青素合成，因此其玉米黃質(zhì)含量顯著低于普通玉米，進而導致了富蝦青素玉米組蛋黃b*值顯著低于對照組，同時也顯著低于蝦青素組。

3.3 富蝦青素玉米對蛋黃蝦青素含量、富集效率及葉黃素含量的影響 雞蛋作為類胡蘿卜素的優(yōu)良載體，其蛋黃富含玉米黃質(zhì)，還可富集番茄紅素、蝦青素等多種類胡蘿卜素。研究表明，飼糧中添加蝦青素至210 mg/kg 時，雞蛋中蝦青素含量仍隨飼糧添加水品提高而顯著增加。在本試驗中飼糧提供同等水平蝦青素前提下，蝦青素組和富蝦青素玉米組蛋黃蝦青素含量也無顯著差異，分別為13.67 μg/g 和14.15 μg/g。而不同來源蝦青素在雞蛋中的富集效率也與多數(shù)非維生素A源類胡蘿卜素相似，且兩組間無顯著差異。這表明在蛋雞飼糧中富蝦青素玉米與天然蝦青素具有同等的營養(yǎng)有效性。此外，盡管玉米黃質(zhì)與蝦青素同為類胡蘿卜素，但在蛋雞吸收、轉(zhuǎn)運和向雞蛋富集過程中并無直接的競爭關(guān)系，因此對照組與蝦青素組玉米黃質(zhì)含量無顯著差異。而富蝦青素玉米組蛋黃中玉米黃質(zhì)含量較低則是由于合成蝦青素所致，同時該結(jié)果也與蛋黃顏色CIELab 值相互印證。

3.4 富蝦青素玉米對蛋雞血清抗氧化能力的影響 抗氧化既是天然蝦青素的重要功能，也是其發(fā)揮多種生物學作用的基礎(chǔ)。蝦青素通常會通過非酶促和酶促途徑發(fā)揮其抗氧化功能。非酶促途徑是蝦青素利用紫羅蘭環(huán)上雙羥基和多個共軛雙鍵競爭結(jié)合超氧離子、羥自由基等促氧化物質(zhì)，再通過自身環(huán)氧化和共軛雙鍵斷裂實現(xiàn)的抗氧化作用。酶促途徑則是通過激活SOD、GSH-Px 等抗氧化酶體系實現(xiàn)抗氧化功能。本試驗中飼糧添加蝦青素與富蝦青素玉米抗氧化效果相近，均可提高血清GSH-Px、SOD，并顯著降低MDA 含量，其中GSH-Px、SOD 活性提高均相對有限，表明來源于玉米和雨生紅球藻的蝦青素在蛋雞抗氧化性能上可發(fā)揮同等作用。此外，該結(jié)果也與蝦青素抗氧化途徑密切相關(guān)。蝦青素的非酶促反應是通過競爭自氧化完成，主要抑制脂質(zhì)氧化反應且持續(xù)發(fā)生。MDA 作為脂質(zhì)氧化的典型產(chǎn)物，其含量降低表明蝦青素在抑制蛋雞脂質(zhì)氧化上發(fā)揮了作用。酶促抗氧化途徑則是在氧化應激條件下更易被激活，發(fā)揮抗氧化功能。本試驗選擇的高峰期蛋雞，機體狀態(tài)相對穩(wěn)定，氧化應激也相對較弱，導致蝦青素的對酶促抗氧化過程中GSH-Px、SOD活性提高并不顯著。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，來源于富蝦青素玉米和雨生紅球藻的蝦青素均可改善蛋雞飼料利用率，提高蛋黃顏色，增強機體抗氧化能力并使蝦青素在雞蛋中富集，且作用效果接近，表明在蛋雞飼糧中使用富蝦青素玉米可與飼糧添加蝦青素發(fā)揮同等的營養(yǎng)有效性。