何 雷

東南大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210096

多項臨床研究表明，小劑量東莨菪堿治療抑郁癥時有快速抗抑郁的效應［1-5］，但會對認知及學習記憶功能產生一定的不良反應，特別是空間定位能力。動物實驗表明，應用東莨菪堿會降低空間定位的學習能力，表現異常的空間記憶喚起，對新環(huán)境的探究時間延長和認知能力下降等，但其作用機制不甚明確。已有實驗研究發(fā)現［6-9］，動物的空間定位能力是通過利用環(huán)境中的標記來判斷自身的位置和距離，例如，在曠場區(qū)域內，動物通過房間內標記可以判斷自身的位置，從而尋找合適的路徑來完成迷宮任務。這種空間定位能力與一些相關功能的神經元活動有關，例如位置細胞、網格細胞和邊界細胞。這些集群細胞發(fā)放可以指征動物所處的位置信息，例如位置細胞主要位于海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，其在曠場中能以精確到厘米級別的分辨率區(qū)分自身位置，并可以記錄到該位置所對應的位置細胞的信號發(fā)放；而網格細胞分布在內側內嗅皮層（medial entorhinal cortex，MEC）中，其在曠場中可以按網格化形狀分布發(fā)放信號；邊界細胞則是分布于壓后皮質（retrosplenial cor?tex，RSC）中的一類特殊細胞，當動物靠近邊界時會密集發(fā)放信號，用于指征動物是否靠近邊界。邊界細胞對于感官和空間線索影響下的自我為中心的坐標系建立有重要作用，邊界細胞放電紊亂會導致空間信息編碼錯誤，影響動物判斷自身位置和空間距離［6］。此外，邊界細胞放電還與海馬的theta振蕩具有同步化反應，提示RSC邊界細胞在自我中心的空間信息編碼期間與海馬位置細胞有重要交流，這些交流是支持空間坐標系轉換、生成異中心坐標的關鍵因素。RSC邊界細胞與MEC神經元之間也有重要聯(lián)系［10-12］，如果抑制RSC邊界細胞則會導致MEC網格細胞空間信息編碼異常，提示RSC邊界細胞在進行異中心坐標向自我中心坐標轉換的過程中起著重要作用。

本研究選取特異存在于RSC 的邊界細胞為研究對象，研究使用東莨菪堿對小鼠邊界細胞及空間記憶能力的影響，希望可以找到東莨菪堿誘發(fā)空間定位能力缺陷的原因。Morris 水迷宮是現今研究者們公認的用來測試空間學習記憶行為的經典方法，本研究首先利用Morris水迷宮實驗來測試東莨菪堿對小鼠空間記憶能力的影響。由于在水迷宮實驗中無法同時記錄在體電生理信號，于是設計曠場實驗來判斷東莨菪堿對小鼠自發(fā)活動能力及邊界細胞空間信息編碼的影響。通過向邊界細胞所在的RSC 區(qū)域植入微絲電極，在曠場測試實驗的同時記錄電信號，分離邊界細胞的放電頻率，探討東莨菪堿是否會影響邊界細胞的空間信息編碼，從而產生空間定位能力下降。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級健康成年C57BL/6 雄性小鼠26 只，鼠齡8 周，體重25～30 g，購自浙江維通利華實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2019?0001，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2016?0014。實驗動物飼養(yǎng)于SPF 級屏障環(huán)境動物室，飼養(yǎng)條件為12 h/12 h晝夜節(jié)律，恒溫25 ℃，相對濕度（60±5）%，所有小鼠自由飲食攝水。本研究所有小鼠實驗均嚴格遵循動物實驗“3R”原則，按照中華人民共和國國家標準《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 27416?2014）執(zhí)行。

東莨菪堿氫溴酸鹽（中國上海阿拉丁公司），戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司），雙氧水（南京晚晴化玻儀器有限公司）。

水迷宮、曠場儀器購自上海欣軟公司，記錄和分析軟件為Anymaze。記錄電信號的設備為64 通道在體記錄系統(tǒng)（Plexon Inc公司，美國）。信號采樣率為40 kHz，用于記錄和分析神經元胞外動作電位。

電極制備：32通道微絲陣列電極主要由微絲陣列、連接器兩部分組成。將32根聚酰亞胺電極導引管（內徑為75 μm，外徑為150 μm，Polymicro techno?logies 公司，美國）切割成5 mm 長度，用快速膠固定組成4×8 的陣列，向每個導引管插入長度為40 mm的微絲電極（直徑為0.001 4 inch，California Fine Wire 公司，美國），并用快速膠固定微絲與導引管。通過涂抹導電銀漆使微絲的另一端與連接器pin腳相接。連接器（Omnetics Connector 公司，美國）與記錄系統(tǒng)接口相連。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥

C57BL/6小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為生理鹽水對照組和東莨菪堿組。向小鼠RSC 植入32 通道微絲電極后恢復7 d，進行曠場實驗，觀察其礦場活動速度，并同時記錄電信號。隨后通過腹腔給藥方式，給予小鼠25 μg/kg東莨菪堿［13］或等體積的生理鹽水，24 h后進行曠場實驗并同時記錄電信號，分析其對邊界細胞放電及邊界細胞陸地移動距離（earth mover’s distance，EMD）的影響。水迷宮實驗中，在訓練階段每次訓練前注射同上濃度的東莨菪堿或等體積生理鹽水，5 d之后的測試階段則不注射任何藥物。

1.2.2 電極植入手術

使用戊巴比妥鈉（腹腔注射10 mg/kg 體重）麻醉。刮去頭頂上方皮毛，固定在立體定位儀上。使用剪刀剪開頭皮，暴露出顱骨，使用雙氧水去除表面結締組織。根據小鼠圖譜定位到RSC 上方（AP 2.0 mm；ML 0.8 mm；DV 1.0 mm），使用微型顱鉆在小鼠定位處開孔，直徑約為1.2 mm。用注射針倒鉤挑開硬腦膜，清理植入窗面，將制備好的32 通道微絲陣列電極通過氣動微推緩慢植入小孔中，達到目標深度后使用醫(yī)用膠封閉顱骨開孔，待干后用牙科水泥將電極導引管及連接器固定在小鼠顱骨上。等待7 d，便可開始觀察記錄。

1.2.3 Morris水迷宮實驗

利用Morris 水迷宮實驗來檢測動物的學習記憶能力。Morris 水迷宮由1個圓形水池（直徑1.0 m、深0.6 m）和用于監(jiān)測動物運動軌跡與速度的視頻監(jiān)控系統(tǒng)組成。實驗時保持水溫36 ℃。利用Anymaze軟件將水迷宮劃分成4 個虛擬象限，每個象限中間位置安置實體空間標志（正上方45 cm 處），選擇其中1個象限為目標象限，放置透明逃生平臺，位于水下1.5 cm，其他3個象限設定4個動物入水點。訓練階段共5 d，每天8次，每4次之間間隔1 h，每次訓練時間1 min。每4次訓練，入水點的釋放順序采用偽隨機方式，將小鼠面向池壁放入水中。每只小鼠在臺上停留20 s用來觀察空間標志，若小鼠超過1 min未尋臺成功，則引導其尋臺。訓練階段結束后24 h進行probe測試，實驗時間1 min。取出逃生平臺，在目標象限的對側象限中間位置釋放動物，記錄并統(tǒng)計動物在各象限的停留時間及穿過平臺位置的次數。

1.2.4 曠場測試

利用曠場測試來判定小鼠自發(fā)活動能力，并配合電信號分析判斷邊界細胞放電。提前將小鼠放入測試室1 h，測試時將小鼠放入曠場內，記錄10 min，并同步記錄在體電生理信號。每次實驗結束后使用稀釋的酒精完全清潔曠場，并晾干，以免上次動物余留的信息影響下次測試結果。

1.2.5 數據處理方法

在體采集到的電生理信號以pl2文件格式保存在電腦上，使用Offline Sorter 軟件對記錄到的單細胞放電信號進行聚類分析，區(qū)分出單個神經元的放電活動。將預處理好的單神經元放電時間序列導出，使用自行編寫的matlab程序，同時導入Anymaze分析的軌跡時間信息，計算神經元放電分布，計算EMD 從而判斷邊界細胞等信息。EMD 的計算參考已發(fā)表的文獻［14］。計算過程為（Cm?Dm）/（Cm+Dm），其中Cm 定義為任何墻面的單個最大覆蓋面積，Dm則表示平均放電點的距離，計算得到區(qū)域內所有計算單位離最近墻面的平均距離，對于每一面獨立的墻都計算，選取最大的分數作為此細胞的EMD。EMD值越小，說明該細胞表征邊界的程度越好。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0對數據進行統(tǒng)計學處理，使用均數±標準差（）的方法表示數據。分析各組水迷宮學習過程運用二因素重復測量方差分析，使用最小顯著差異法（least?significant difference，LSD）進行事后檢驗。對照組和東莨菪堿組各自注射前后的EMD數據對比運用配對t檢驗，曠場下總路程、邊界細胞放電頻率、EMD 數值采用獨立樣本t檢驗進行兩組比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 東莨菪堿對小鼠水迷宮中空間記憶的影響

分別對兩組小鼠在水迷宮中的表現進行分析，東莨菪堿組在學習過程中就表現出與對照組的明顯差異，尋臺時間明顯比對照組長，學習速度明顯慢于對照組。在測試階段，東莨菪堿組無論是在平臺所在象限的停留時間或穿越平臺的次數都明顯少于對照組（圖1）。以上結果均表明，注射小劑量東莨菪堿會導致小鼠空間記憶能力下降。

圖1 東莨菪堿影響小鼠水迷宮中空間記憶Figure 1 Scopolamine affected spatial memory in mouse water maze

2.2 小劑量東莨菪堿對小鼠曠場行為的影響

利用曠場測試來判斷東莨菪堿對小鼠自發(fā)活動能力的影響。電極植入手術完成后，兩組小鼠的曠場平均活動時間差異沒有統(tǒng)計學意義。通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg 東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h 后，觀察其曠場活動速度。實驗發(fā)現，與生理鹽水對照組比較，東莨菪堿組的活動速度沒有顯著差異（P>0.05，表1）。表明兩組小鼠曠場總路程差異無統(tǒng)計學意義，注射小劑量東莨菪堿不會影響小鼠的曠場活動能力。

表1 注射藥物前后兩組小鼠體重和曠場實驗的測試值Table 1 Body weight and open field test value of mice in two groups before and after drug injection

2.3 邊界細胞分離

分別對兩組小鼠進行曠場測試并同時記錄電信號，在此基礎上成功分離出數個信噪比較好的單細胞Spike信號，通過分析EMD判斷為邊界細胞（圖2）。

圖2 分離Spike信號并通過EMD判斷是否為邊界細胞Figure 2 Separating spike signals and judging whether they were boundary cells by EMD

2.4 小劑量東莨菪堿對邊界細胞放電特征的影響

通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h后，觀察給藥前后對之前分離的邊界細胞放電頻率的影響。實驗發(fā)現，兩組小鼠邊界細胞的放電頻率差異并無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表2）。結果表明，注射小劑量東莨菪堿對邊界細胞的基礎活動沒有明顯影響。

表2 注射藥物前后兩組小鼠邊界細胞放電頻率變化Table 2 Discharge frequency of border cells in two groups before and after drug injection

2.5 小劑量東莨菪堿對邊界細胞EMD的影響

EMD 是反映邊界細胞空間信息編碼狀態(tài)的重要標志，EMD 增加表明邊界細胞對空間信息編碼異常。本研究通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg 東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h 后，觀察給藥前后對之前分離的邊界細胞EMD 的影響。實驗發(fā)現，注射東莨菪堿后，邊界細胞EMD明顯增加，邊界細胞效應明顯下降，表明注射小劑量東莨菪堿影響邊界細胞編碼，影響邊界細胞行使功能（P<0.05，表3）。

表3 注射藥物前后兩組小鼠邊界細胞EMD變化Table 3 EMD changes of border cells in two groups before and after drug injection

3 討論

近年研究發(fā)現，東莨菪堿有快速抗抑郁的效果，但同時會產生認知學習、空間定位能力缺陷等不良反應，其作用機制尚不明確。而RSC的邊界細胞承擔著動物在迷宮活動中判斷迷宮邊界距離及自我中心位置的重要作用［15-16］。在曠場的二維空間內，RSC 邊界細胞的相關放電會構成動物的空間感受野，這種信號能定位以動物自身為中心的坐標系。所以通過研究東莨菪堿對特異存在于RSC 的邊界細胞的影響，可以幫助找到東莨菪堿誘發(fā)空間定位能力缺陷的原因，對理解藥理機制，降低聯(lián)合用藥不良反應具有重要意義。

本研究首先通過水迷宮實驗來測試使用東莨菪堿對小鼠空間記憶能力的影響，結果發(fā)現，東莨菪堿組在學習階段尋臺時間明顯比對照組長，學習速度明顯慢于對照組；在測試階段，東莨菪堿組無論是在平臺所在象限的停留時間或穿越平臺的次數都明顯少于對照組。結果表明，注射小劑量東莨菪堿會導致小鼠空間記憶能力下降。

前人研究結果表明，邊界細胞的空間信息編碼對動物的空間定位功能極其重要［6］，邊界細胞空間信息編碼異常會導致其空間定位能力下降。所以本研究隨后設計了曠場實驗，通過曠場測試同時記錄電信號的方法來判斷東莨菪堿是否會對小鼠的自發(fā)活動能力及邊界細胞空間信息編碼產生影響。結果顯示：①注射小劑量東莨菪堿24 h 后，兩組小鼠的曠場活動速度差異沒有統(tǒng)計學意義，說明注射小劑量東莨菪堿不會影響小鼠的曠場活動能力；②兩組小鼠邊界細胞的放電頻率差異并無統(tǒng)計學意義，說明這一劑量及作用時間不會影響RSC腦區(qū)邊界細胞的基礎活動；③東莨菪堿組的邊界細胞EMD明顯增加，說明這一劑量及作用時間可能會影響RSC腦區(qū)邊界細胞行使功能。這些結果說明，注射小劑量東莨菪堿會導致邊界細胞空間信息編碼異常。

綜上所述，注射小劑量東莨菪堿會導致小鼠空間記憶能力下降，并會導致曠場中小鼠邊界細胞空間信息編碼異常。而邊界細胞對于邊界距離及動物自我中心位置的判斷具有重要作用，其相關放電能標定自我中心的坐標系定位，邊界細胞空間信息編碼異常會導致空間定位障礙。故可以推測，東莨菪堿可能是通過影響小鼠邊界細胞空間信息編碼從而影響其空間記憶能力，通過影響邊界細胞空間信息編碼，從而影響距離判斷，導致自我中心定位出錯。但后續(xù)還需進一步研究來探討兩者間的直接關系，可以設計T迷宮或Y迷宮等實驗，來監(jiān)測空間定位過程中邊界細胞空間信息編碼的變化情況。