李 白，曹麗萍，劉英姿，張福源，張 康，邢繼紅，董金皋

(1.省部共建華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北 保定 071000；2.河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071000；3.黑龍江省農業(yè)科學院 齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；4.河北省承德市園林管理中心，河北 承德 067000)

玉米大斑?。∟CLB）是世界范圍內玉米上的重要葉部病害，其病原菌為玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica），該病菌侵染玉米葉部組織并誘導其壞死病變，嚴重影響葉片的光合作用，造成產量損失［1］。因此，挖掘玉米大斑病菌的生長發(fā)育和致病相關的基因，深入研究其作用機制將為玉米大斑病的防控提供理論依據(jù)。

犬尿氨酸途徑（Kynurenine pathway，KP）是色氨酸分解代謝的主要方式［2-3］，從酵母到人類的整個真核生物譜系中高度保守，能夠影響多種重要的生物過程［4］。色氨酸在肝臟中由色氨酸-2, 3-雙加氧酶（Tryptophan-2, 3-dioxygenase, TDO）或者其它組織里的吲哚-2, 3-雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO）的作用下生成N-甲?；虬彼幔∟-Formylkynurenine），犬尿氨酸甲酰胺酶（Kynurenine formamidase, KFA）將其水解后，得到犬尿氨酸（Kynurenine）。犬尿氨酸位于該途徑的一個重要的分支位點，依賴于NADPH，并能在犬尿氨酸上發(fā)揮羥基化，最后產生3- 羥基犬尿氨酸［5-6］。

犬尿氨酸途徑（KP）在以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的形式產生細胞能量方面起著關鍵作用［7］。NAD(P)+是所有生命體內氧化還原反應的輔助因子，同時也在DNA 修復和組蛋白去乙酰化過程中起重要作用［8-9］。在許多微生物中，犬尿氨酸途徑是其NAD+生物合成的唯一來源［10］。在哺乳動物中，犬尿氨酸單加氧酶（KMO）作用于犬尿氨酸，生成具有神經毒性的3-羥基犬尿氨酸，與多種神經退行性疾病密切相關。而在細菌和部分真菌體內，犬尿氨酸途徑與真核生物類似，不同的就是犬尿氨酸酶替換了真核生物中的犬尿氨酸單加氧酶，由犬尿氨酸生成鄰氨基苯甲酸和L-丙氨酸。鄰氨基苯甲酸被氧化酶氧化成鄰苯二酚，經過多步反應，最終轉變成CO2［11］。玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑以及此途徑中的關鍵酶基因的功能都未見報道。本研究利用生物信息學方法，對玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑中的關鍵酶基因進行系統(tǒng)分析，確定玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑的關鍵酶基因；利用玉米大斑病菌的表達譜數(shù)據(jù)，確定犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在病菌生長發(fā)育和侵染過程中的表達規(guī)律，為闡明玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其途徑關鍵酶基因在病菌生長發(fā)育和致病過程中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑關鍵酶基因序列的獲得

利用人和小鼠的犬尿氨酸途徑關鍵酶基因的氨基酸序列，從Ensembl fungi（http://fungi.ensembl.org/index.html）中用Blast 搜索得到玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）中的同源序列。

1.2 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因的系統(tǒng)進化分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸單加氧酶（Kynurenine 3-monooxygenase，KMO）、犬尿氨酸酶（Kynureninase，KYN）、吲哚-2, 3-雙加氧酶（Indoleamine-2, 3-dioxygenase，IDO）、犬尿氨酸氨基轉移酶（Kynurenine aminotransferase，KAT）的氨基酸序列，在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫中搜索玉米大斑病菌的全基因組序列；對搜索的結果進行深入的分析，并利用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行基因的多序列比對，并用鄰接法進行系統(tǒng)進化分析，設置 bootstrap 值為 1 000。

1.3 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因的結構域分析

利用玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT的氨基酸序列，通過InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）網站，對其功能域進行分析，用IBS 軟件進行結構域的繪制。

1.4 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌生長發(fā)育不同時期的表達分析

從公共平臺GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取玉米大斑病菌生長發(fā)育不同時期的表達譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號為SRR9997710、SRR9997709、SRR9997708、SRR9997715 和SRR9997714；對犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT在病菌生長發(fā)育的不同時間的數(shù)據(jù)進行分析，取log2 值后確定目的基因在病菌不同生長發(fā)育時期的表達水平。

1.5 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達分析

從公共平臺GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取玉米大斑病菌侵染過程中的表達譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號為SRR12131452、SRR12131453、SRR12131454 和SRR12131455；對犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT在病菌侵染不同時間的數(shù)據(jù)進行分析，取log2 值后確定目的基因在病菌不同侵染時間的表達水平。

2 結果與分析

2.1 犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_165798與其他物種的KMO 相似性較高（圖1A）；利用InterProScan［12］網站對其功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有犬尿氨酸單加氧酶（kynurenine 3-monooxygenase） 的功能域（ 圖1B）。 表明SETTUDRAFT_165798 為玉米大斑病菌的犬尿氨酸單加氧酶（KMO）基因，命名為StKMO。

圖1 犬尿氨酸單加氧酶KMO 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.1 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynurenine 3-monooxygenase

2.2 犬尿氨酸酶（KYN）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸酶（KYN）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_165216 與其他物種的KYN 相似性較高（圖2A）；利用InterProScan網站對其功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有一個犬尿氨酸酶（Kynureninase）的功能域，并具有高度相似性（圖2B）。表明SETTUDRAFT_165216 為玉米大斑病菌的犬尿氨酸酶（KYN）基因，命名為StKYN。

圖2 犬尿氨酸酶KYN 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.2 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynureninase

2.3 犬尿氨酸氨基轉移酶（KAT）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸氨基轉移酶（KAT）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_177407與其他物種的KAT 相似性較高（圖3A）；利用InterProScan 網站對其功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有一個犬尿氨酸氨基轉移酶（Kynurenine aminotransferase） 的功能域（ 圖3B）。 表明SETTUDRAFT_177407 為玉米大斑病菌犬尿氨酸氨基轉移酶（KAT）基因，命名為StKAT。

圖3 犬尿氨酸氨基轉移酶KAT 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.3 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynurenine aminotransferase

2.4 吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_102413、SETTUDRAFT_171749與其他物種的IDO 相似性較高（圖4A）；利用InterProScan 網站對其功能域進行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有吲哚-2, 3- 雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase）的功能域，并具有高度相似性（圖4B）。表明SETTUDRAFT_102413、SETTUDRAFT_171749 為玉米大斑病菌的吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）基因，命名為StIDOs。

圖4 吲哚-2, 3-雙加氧酶IDO 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.4 Phylogenetic tree and functional domain analysis of indoleamine-2, 3-dioxygenase

2.5 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌生長發(fā)育不同時期的表達分析

利用公共平臺GEO 中玉米大斑病菌的表達譜數(shù)據(jù)，對犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT、StIDOs在病菌的附著孢時期、萌芽時期，早萌時期以及分生孢子發(fā)育時期的數(shù)據(jù)進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，StKMO基因在病菌萌芽和分生孢子發(fā)育時期高水平表達，在附著胞時期和早萌時期表達相對較低；StKYN基因在病菌生長發(fā)育的4 個時期均呈現(xiàn)高水平表達；StKAT基因在病菌分生孢子發(fā)育時期高水平表達，在附著胞時期、萌芽時期和早萌時期表達相對較低；StIDO-1（SETTUDRAFT_102413）基因在病菌生長發(fā)育的4 個時期均呈現(xiàn)高表達，StIDO-2（SETTUDRAFT_171749）基因在病菌萌芽時不表達，其他時間均表達（見圖5）。

圖5 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌生長發(fā)育中的表達Fig.5 Expression of key enzyme genes of the kynurenine pathway in growth and development of Setosphaeria turcica

2.6 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達分析

利用公共平臺GEO 中玉米大斑病菌的表達譜數(shù)據(jù)，對犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT、StIDOs在病菌侵染的3、5、9、13 d 的數(shù)據(jù)與對照（0 d）進行對比分析。結果發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌StKMO基因在病菌侵染3、9 和13 d 時高水平表達，在侵染0 d 和5 d 時不表達；StKYN基因和StKAT基因在病菌侵染9 d、13 d 時高水平表達，在病菌侵染的前5 d 均不表達；StIDOs（SETTUDRAFT_102413 和SETTUDRAFT_171749）基因只在病菌侵染9 d 時表達，其他時間均不表達（見圖6）。

圖6 犬尿氨酸途徑關鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達Fig.6 Expression of key enzyme genes of kynurenine pathway in infection of Setosphaeria turcica

3 結論與討論

在哺乳動物中，KMO 作用于犬尿氨酸，使其轉變?yōu)榫哂猩窠浂拘缘?-羥基犬尿氨酸，與亨廷頓?。℉untington’s, HD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s, AD）和帕金森病（Parkinson’s, PD）等多種神經退行性疾病密切相關［13-16］。研究報道，細菌以及部分真菌中也存在與哺乳動物相似的犬尿氨酸途徑。如，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）通過犬尿氨酸途徑分解代謝色氨酸［17］。玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）達托霉素生物合成基因簇中含有色氨酸2, 3-雙加氧酶基因dptJ，dptJ基因敲除后，達托霉素的產量顯著降低；將玫瑰孢鏈霉菌中的TDO 敲除后，達托霉素的產量也顯著降低；分別遺傳回補后產量得到增加，表明犬尿氨酸途徑在達托霉素生物合成中的重要作用［18］。相關研究發(fā)現(xiàn)，在人體炎癥條件下，犬尿氨酸途徑中的關鍵酶，特別是犬尿氨酸3-單加氧酶（KMO）會有明顯的上調［19］。

目前，玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其途徑關鍵酶基因的功能均未見相關報道。本研究通過對Ensembl fungi 數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲得了玉米大斑病菌中犬尿氨酸途徑關鍵酶的編碼基因，包括1 個犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的編碼基因StKMO、1 個犬尿氨酸酶（KYN）的編碼基因StKYN、1 個犬尿氨酸氨基轉移酶（KAT）的編碼基因StKAT以及2 個吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的編碼基因StIDOs。利用生物信息相關方法對玉米大斑病菌的犬尿氨酸途徑關鍵酶基因進行了系統(tǒng)發(fā)育分析和保守結構域分析，證明了玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑的存在。利用玉米大斑病菌的轉錄組數(shù)據(jù)，對犬尿氨酸途徑關鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT和StIDOs在病菌生長發(fā)育和侵染過程中的表達規(guī)律進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在病菌不同生長發(fā)育和侵染時期呈現(xiàn)高水平表達，推測這些基因在玉米大斑病菌生長發(fā)育以及侵染過程中發(fā)揮重要功能。但是玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其關鍵酶基因在病菌生長發(fā)育和致病過程中功能以及作用機制還需進一步的深入研究。