米 彥 吳 曉 徐 進(jìn) 鄭 偉 馬 馳

細(xì)胞膜力學(xué)性能對(duì)電穿孔影響的仿真研究

米 彥 吳 曉 徐 進(jìn) 鄭 偉 馬 馳

（輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶大學(xué)） 重慶 400030）

為探究細(xì)胞膜的力學(xué)性能對(duì)電穿孔的影響，該文將細(xì)胞膜視為一種超彈性材料，在COMSOL中建立細(xì)胞膜上局部單個(gè)微孔的機(jī)電耦合模型，分析細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能對(duì)微孔形成的影響，并比較了細(xì)胞膜彈性模量不同時(shí)微孔形成過(guò)程的差異。結(jié)果表明，細(xì)胞膜的應(yīng)變能一方面增大了從疏水孔向親水孔轉(zhuǎn)變時(shí)的越過(guò)能壘，并且膜彈性模量越大，越過(guò)能壘越大，且二者線性相關(guān)；另一方面，應(yīng)變能的增加使微孔穩(wěn)定，阻止微孔無(wú)限擴(kuò)大，穩(wěn)定尺寸與細(xì)胞膜力學(xué)性能和跨膜電位有關(guān)。該文通過(guò)仿真揭示了細(xì)胞膜的力學(xué)性能在電穿孔中的重要作用，并為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)電穿孔的影響機(jī)制提供了理論參考。

力學(xué)性能 電穿孔 機(jī)電耦合 應(yīng)變能 微孔能量

0 引言

細(xì)胞膜是由脂類和蛋白質(zhì)構(gòu)成的半透性膜，這種結(jié)構(gòu)賦予了細(xì)胞膜非常特殊的機(jī)械性能。以人的紅細(xì)胞為例，細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層、血影蛋白網(wǎng)絡(luò)和膜蛋白組成[1]。膜中的脂質(zhì)具有流動(dòng)性，膜骨架蛋白對(duì)脂質(zhì)雙層起著支撐的作用。

最近幾十年來(lái)，電場(chǎng)與生物膜的相互作用得到了廣泛研究，如電穿孔。當(dāng)外部電場(chǎng)作用于膜上，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生極化，當(dāng)感應(yīng)的跨膜電勢(shì)達(dá)到臨界值（0.5～1.0V）時(shí)[2-3]，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生電擊穿，即電穿孔。目前，已有許多理論及模型對(duì)電穿孔現(xiàn)象進(jìn)行了闡述，普遍認(rèn)可的是脂質(zhì)雙分子層的親水孔模型。即完整的磷脂雙層在熱運(yùn)動(dòng)下先形成疏水孔間隙，當(dāng)微孔超過(guò)某一臨界尺寸時(shí)，由于疏水孔的脂質(zhì)的重新定向轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水孔，并基于成核理論，通過(guò)微孔形成引起的膜的自由能的變化描述微孔的發(fā)展[4]。

影響細(xì)胞膜電穿孔的因素有很多，如施加的電場(chǎng)、細(xì)胞所處溶液、細(xì)胞膜自身的材料特性[5-8]等。其中，細(xì)胞膜的力學(xué)性能在電穿孔過(guò)程中起著重要作用，已有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究。I. van Uitert 等[9]研究了細(xì)胞膜組成的分子對(duì)微孔的形成和膜電穩(wěn)定性的影響，包括磷脂、膽固醇及通道蛋白。G. L. Thompson等[10]假設(shè)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架作為細(xì)胞彈性的主要貢獻(xiàn)參數(shù)，其改變將會(huì)顯著影響納秒脈沖電場(chǎng)處理后細(xì)胞的存活率。A. Muralidharan等[11]將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞暴露于脈沖電場(chǎng)下，發(fā)現(xiàn)了肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)破壞的細(xì)胞增加了細(xì)胞膜的通透性。H. B. Kim等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通過(guò)微孔形態(tài)、膜硬度等細(xì)胞物理因素在電穿孔中發(fā)揮作用。

部分學(xué)者在仿真分析電穿孔時(shí)也考慮了細(xì)胞的力學(xué)性能。S. Sun等[13]通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)仿真分析了脂質(zhì)膜的變形性對(duì)電穿孔的影響，結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，剛度較大的膜可以抑制電穿孔。但他們只是從原子水平上進(jìn)行觀察，而未能從細(xì)胞層面探究細(xì)胞膜的力學(xué)性能在電穿孔中的作用。W. Hoiles等[14-15]將細(xì)胞膜看作線性彈性連續(xù)體，從微孔能量角度說(shuō)明其力學(xué)性能對(duì)微孔的影響，得出彈性應(yīng)變能抑制水孔的擴(kuò)大。這種最簡(jiǎn)單的線性彈性體并不能很好地描述細(xì)胞膜的彈性特性。Deng Peigang等[16-17]將細(xì)胞膜看作非線性彈性材料，通過(guò)Ansys建立了一個(gè)新的同時(shí)具有相變能和應(yīng)變能的電穿孔模型，并得到細(xì)胞膜的應(yīng)變能會(huì)阻止孔的無(wú)限增大。但是在建模過(guò)程中，只考慮了電場(chǎng)力，而忽略了微孔在形成過(guò)程中會(huì)受到其他力的作用。

為此，本文在前人研究的基礎(chǔ)上，從仿真角度研究了電場(chǎng)下細(xì)胞膜的力學(xué)性能對(duì)微孔形成的影響。在COMSOL中將細(xì)胞膜視為超彈性材料，在電場(chǎng)下建立膜上單個(gè)微孔的機(jī)電耦合模型，并分析在微孔形成過(guò)程中由于細(xì)胞膜變形而產(chǎn)生的應(yīng)變能對(duì)微孔能量的影響。此外，設(shè)置不同彈性模量的細(xì)胞膜，以比較細(xì)胞膜不同的力學(xué)性能對(duì)微孔形成的差異。

1 仿真模型與方法

1.1 幾何模型

由于細(xì)胞膜是一種半透性膜，正常的細(xì)胞膜可以通過(guò)一些分子，如水分子，其直徑約為0.4nm。因此假設(shè)細(xì)胞膜上預(yù)先存在小孔，其半徑為0.2nm。以細(xì)胞膜上局部單個(gè)微孔為例，如圖1a所示，圓柱形細(xì)胞膜中心有一個(gè)預(yù)先存在的微孔。為了簡(jiǎn)化建模，本文沿著半徑方向建立二維軸對(duì)稱幾何模型，考慮圓柱形孔，如圖1b所示：所研究的空間區(qū)域?yàn)?0nm×50nm的正方形區(qū)域，其中，正方形灰色區(qū)域代表細(xì)胞膜附近的溶液，白色矩形代表細(xì)胞膜，細(xì)胞膜與旋轉(zhuǎn)軸之間的狹窄區(qū)域代表預(yù)先存在的圓柱形微孔。er和ez分別為孔邊界和膜邊界的應(yīng)力密度，細(xì)胞膜是由許多磷脂和蛋白組成，兩個(gè)相鄰蛋白之間的距離約為100nm，所以膜邊緣距中心的距離為50nm[16]。細(xì)胞膜厚度為10nm[18]。

圖1 仿真示意圖

1.2 數(shù)學(xué)模型

1.2.1 微孔在電場(chǎng)下的受力

對(duì)于上述的幾何模型，外面的正方形灰色區(qū)域是細(xì)胞膜和孔附近的溶液，其相對(duì)介電常數(shù)l=80[19]，中間的白色矩形區(qū)域?yàn)榧?xì)胞膜，其相對(duì)介電常數(shù)為m=2[19]。

在正方形上下方向施加電場(chǎng)，區(qū)域剩余邊界無(wú)電流通過(guò)。在電場(chǎng)下，細(xì)胞膜可看作是一種介電體，由于Maxwell-Wagner界面極化作用，會(huì)在細(xì)胞膜上感應(yīng)出電場(chǎng)力[20]?？衫名溈怂鬼f應(yīng)力張量法計(jì)算電場(chǎng)力，只考慮電場(chǎng)時(shí)的麥克斯韋應(yīng)力張量可表示為

式中，為單位向量。作用在表面的電場(chǎng)力密度為

式中，為法向分量。

在本模型中，由于細(xì)胞外溶液和細(xì)胞膜在電場(chǎng)下均會(huì)發(fā)生相互極化，在分界面兩側(cè)均會(huì)產(chǎn)生電場(chǎng)力，其方向如圖1b中的箭頭所示。須將這兩側(cè)的電場(chǎng)力矢量相加，才是邊界上的凈電場(chǎng)力。以孔邊界上的凈電場(chǎng)力密度er為例說(shuō)明計(jì)算過(guò)程，在邊界上選取一狹小的矩形，如圖2所示（下標(biāo)l代表溶液，m代表細(xì)胞膜）。根據(jù)式（2），分界面兩側(cè)的電場(chǎng)力密度分別為

圖2 孔邊界電場(chǎng)力方向

由于細(xì)胞膜和溶液介電常數(shù)的差異較大（80和2），在孔邊界上，考慮邊界條件ln=mn=0和lt=mt,即l=m=mt，其電場(chǎng)力密度為

同樣地，對(duì)于膜的上下邊界，邊界條件為lln=mmn，lt=mt=0，即l=ln，m=mn，則其電應(yīng)力密度為

在沒(méi)有外加電場(chǎng)時(shí)，微孔一般會(huì)受到線張力（使孔愈合的力）和表面張力（使膜擴(kuò)張的力），對(duì)于半徑為的微孔，其受到的驅(qū)動(dòng)力ne大小為[21]-/。

當(dāng)細(xì)胞處在電場(chǎng)中時(shí)，在考慮上述兩個(gè)力的基礎(chǔ)上考慮電場(chǎng)力，綜合這三個(gè)力的共同作用，微孔邊界上的受力示意圖如圖3所示。

圖3 微孔受力示意圖分析[22]

1.2.2 細(xì)胞膜受力變形

細(xì)胞膜通常會(huì)被視為彈性材料，但其具有隨機(jī)取向的分子鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠經(jīng)歷很大的非線性彈性變形，部分學(xué)者基于連續(xù)介質(zhì)力學(xué)[23]，采用連續(xù)的超彈性材料來(lái)模擬。本文同樣將細(xì)胞膜視為超彈性材料，假設(shè)細(xì)胞膜是均質(zhì)、各向同性和不可壓縮的[24-25]。

用于描述細(xì)胞膜的超彈性模型形式很多，如Mooney-Rivlin模型、Neo-Hookean模型、Yeoh模型等，其中Mooney-Rivlin模型被廣泛使用，其適用范圍較大，精確度較高。對(duì)于Mooney-Rivlin模型，根據(jù)階數(shù)高低，又可分為雙參數(shù)、五參數(shù)、九參數(shù)，階次越高，可以模擬更復(fù)雜的情況，但也需要更多的計(jì)算量，最終本文選取Mooney-Rivlin雙參數(shù)模型，用應(yīng)變能函數(shù)表示為[26]

式中，為應(yīng)變能函數(shù)；1、2分別為左柯西格林變形張量的第一、第二應(yīng)變不變量；10和01為材料參數(shù)（MPa），一般存在如下關(guān)系[24]：10/01≈0.1～0.2，E=6(10+01)，E為彈性模量。

1.3 求解方法與數(shù)據(jù)處理

根據(jù)圖1b在COMSOL Multiphysics建立二維軸對(duì)稱幾何模型，選用AC-DC模塊和固體力學(xué)模塊，電應(yīng)力密度通過(guò)麥克斯韋應(yīng)力張量法進(jìn)行計(jì)算，并和線張力、表面張力添加到固體力學(xué)中的邊界載荷中。采用自由三角形網(wǎng)格進(jìn)行劃分，剖分后的模型包含6 939個(gè)域單元和380個(gè)邊界元。

改變外加直流激勵(lì)，變化范圍為[0.1V, 3.0V]，可得到細(xì)胞膜及周圍溶液上的電勢(shì)、電場(chǎng)的分布、細(xì)胞膜在電場(chǎng)下隨著邊界載荷而變形的情況，以及微孔邊界位移和細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能分別隨外加電壓變化的數(shù)據(jù)。導(dǎo)出微孔發(fā)生的位移及細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能的數(shù)據(jù)，并在Origin軟件中繪圖，可得到微孔發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞膜應(yīng)變能與微孔半徑之間的關(guān)系。

為分析細(xì)胞膜材料參數(shù)對(duì)電穿孔的影響，設(shè)置不同的材料參數(shù)10和01。以10a=0.437 5MPa，01a=0.062 5MPa為基準(zhǔn)，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞膜彈性模量數(shù)量級(jí)約為107dyn/cm2[24]（1 dyn=10-5N）。細(xì)胞膜剛度較小時(shí)，對(duì)應(yīng)的彈性模量較小，取10b=10a/3=0.145 8MPa，01b=01a/3=0.020 8MPa。細(xì)胞膜剛度較大時(shí)，對(duì)應(yīng)的彈性模量較大，取10c=310a=1.312 5MPa，01c= 301a=0.187 5MPa。比較在這三種情況下對(duì)微孔形成的影響。

2 結(jié)果

以細(xì)胞膜材料參數(shù)10a=0.4375MPa，01a= 0.062 5MPa為例分析其對(duì)微孔形成的影響。

2.1 電勢(shì)、電場(chǎng)分布

當(dāng)外加電壓增大時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生變形，微孔會(huì)擴(kuò)大，在這一過(guò)程中，微孔不會(huì)無(wú)限制地?cái)U(kuò)大，直到與變形膜中產(chǎn)生的應(yīng)力平衡時(shí)為止。假設(shè)電穿孔的閾值為0.8V，區(qū)域內(nèi)的電勢(shì)及電場(chǎng)分布如圖4所示。從電勢(shì)分布圖可以看出，外加激勵(lì)相當(dāng)于細(xì)胞膜兩側(cè)電壓，即跨膜電壓。從電場(chǎng)分布圖可以看出，細(xì)胞膜內(nèi)部和孔區(qū)域附近電場(chǎng)強(qiáng)度（≈7.3×107V/m）比細(xì)胞膜周圍溶液（≈1.8×106V/m）大。

圖4 電勢(shì)和電場(chǎng)強(qiáng)度分布

2.2 細(xì)胞膜受力、變形情況

電場(chǎng)與細(xì)胞膜的機(jī)械響應(yīng)互相耦合，電場(chǎng)的分布和細(xì)胞膜變形互相影響。在孔邊界上的電場(chǎng)分布不同導(dǎo)致沿著孔邊界上的電應(yīng)力不同，其結(jié)果是電場(chǎng)力密度在孔邊界上下兩端的值較小，在邊界中間區(qū)域值較大，如圖5a所示。再考慮表面張力和線張力，孔邊界上受到的合力大小如圖5b所示，可以看出應(yīng)力的大小在邊界上是分布不均勻的。

圖5 孔邊界上的電應(yīng)力和合力分布

細(xì)胞膜是一種柔軟的彈性材料，在力的作用下會(huì)發(fā)生變形，其二維、三維變形情況如圖6所示，微孔邊界上的受力方向如圖6a中的箭頭所示，箭頭的長(zhǎng)短能夠相對(duì)表示不同位置處的受力大小。圖6b和圖6c表示微孔邊界上的電場(chǎng)力和應(yīng)力，從顏色的深淺也可看出微孔不同位置處的受力大小，在中間區(qū)域受力較大，上下區(qū)域受力較小。而且，從圖6b和圖6c中的放大圖可以看出，合力的作用效果是使膜沿著徑向方向壓縮、微孔會(huì)擴(kuò)大，并且膜在孔周圍的局部擠壓過(guò)程使微孔的形態(tài)像火山口。

圖6 細(xì)胞膜變形情況

2.3 孔能量變化

在孔擴(kuò)大過(guò)程中，細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能與孔半徑之間的關(guān)系如圖7a中的數(shù)據(jù)點(diǎn)所示，通過(guò)數(shù)值擬合可以得到二者之間的定量關(guān)系為（相關(guān)指數(shù)2=0.999 54，2接近1，說(shuō)明擬合效果好）

式中，sa為中等硬度的細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能（10-21J）；為孔半徑（nm）。

目前，廣泛使用孔能量方程來(lái)描述微孔的形成發(fā)展過(guò)程。在跨膜電壓為時(shí)，半徑為的自由能的變化為[27]

式中，這兩個(gè)方程式分別描述疏水孔和親水孔的能量變化。I是(=0,1)階修改后的Bessel函數(shù)，其余參數(shù)的物理意義及數(shù)值見(jiàn)表1。

表1 孔能量方程相關(guān)參數(shù)

Tab.1 Parameters of pore energy equation

當(dāng)考慮細(xì)胞膜的力學(xué)性能及其變形產(chǎn)生的應(yīng)變能時(shí)，孔能量方程為

根據(jù)式（11），在Matlab中畫出不同跨膜電壓U（U=0V、0.3V、0.5V、0.8V、1.0V）下孔能量曲線，如圖7b所示。從圖7b中可以看出，當(dāng)跨膜電壓U不同時(shí)，其孔能量曲線也會(huì)不同，但從趨勢(shì)上可分為跨膜電壓較?。║≤0.5V）和較大（U≥0.8V）兩種情況。為了說(shuō)明細(xì)胞膜力學(xué)性能對(duì)電穿孔的影響，以U=0.5V和U=0.8V時(shí)為例，比較考慮和不考慮細(xì)胞膜應(yīng)變能時(shí)的孔能量曲線。

當(dāng)=0.5V時(shí)（見(jiàn)圖7c），當(dāng)=0時(shí)，微孔閉合；當(dāng)外加的熱波動(dòng)超過(guò)第一個(gè)極大值點(diǎn)（,）（≈0.5nm）時(shí)，孔由疏水孔轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水孔，此時(shí)的微孔能量為微孔從疏水孔轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水孔所克服的越過(guò)能壘。不考慮應(yīng)變能時(shí)，微孔在到達(dá)越過(guò)能壘點(diǎn)（）后，微孔能量一直降低，微孔一直擴(kuò)大；當(dāng)考慮應(yīng)變能之后，孔能量曲線上移，微孔能量會(huì)先有一個(gè)短暫快速地下降后一直上升，此時(shí)，短暫的下降到達(dá)暫穩(wěn)態(tài)點(diǎn)（m,m），對(duì)應(yīng)的孔徑約為1nm，由能量最低原理可知，微孔能夠穩(wěn)定在極小值點(diǎn)，即能量最低點(diǎn)（m,m）處。

當(dāng)=0.8V時(shí)（見(jiàn)圖7d），若不考慮應(yīng)變能，微孔在到達(dá)越過(guò)能壘點(diǎn)（）后，微孔能量一直降低，微孔會(huì)一直擴(kuò)大；考慮應(yīng)變能后，孔能量曲線會(huì)有抬升，孔能量曲線先有一個(gè)緩慢的下降后上升，此時(shí)穩(wěn)態(tài)點(diǎn)（ee）為孔能量的最低點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的孔徑有幾納米。

2.4 不同力學(xué)性能對(duì)微孔形成影響

當(dāng)改變細(xì)胞膜材料參數(shù)時(shí)，細(xì)胞膜彈性模量不同，剛度不同，其電勢(shì)、電場(chǎng)強(qiáng)度及變形情況與2.1節(jié)、2.2節(jié)中的細(xì)胞膜是類似的，在數(shù)值上會(huì)有區(qū)別。三種參數(shù)下，細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能與孔半徑之間的關(guān)系如圖8a所示。明顯看到，對(duì)于某一種材料參數(shù)的細(xì)胞膜，隨著微孔擴(kuò)大，孔徑增大，細(xì)胞膜由于變形而儲(chǔ)存的應(yīng)變能越多，并且當(dāng)孔徑越大時(shí)，應(yīng)變能增加越快。不同材料參數(shù)時(shí)，當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量越大，其彈性應(yīng)變能越大。經(jīng)數(shù)值擬合，彈性應(yīng)變能與微孔半徑的關(guān)系如下。

當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量較小時(shí)有

10b=10a/3=0.145 8MPa01b=01a/3=0.020 8MPa

圖8 細(xì)胞膜力學(xué)性能不同對(duì)微孔的影響

當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量較大時(shí)，有

細(xì)胞膜材料參數(shù)為10a、01a時(shí)，應(yīng)變能與孔半徑之間的關(guān)系如式（9）所示。

將三種材料參數(shù)下的細(xì)胞膜應(yīng)變能添加到孔能量關(guān)系式（10）中，并以跨膜電壓=0.8V為例比較其微孔發(fā)展過(guò)程，如圖8b所示?？梢钥闯?，細(xì)胞膜彈性模量越大，微孔能量越大，孔能量曲線上移。一方面，當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量越大時(shí)，微孔從疏水孔轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水孔所需要克服的越過(guò)能壘越大，微孔形成更加困難。不同材料參數(shù)下的微孔越過(guò)能壘大小如圖8c所示，當(dāng)細(xì)胞膜材料參數(shù)10線性增大時(shí)，微孔的越過(guò)能壘也呈線性增大變化，即微孔的越過(guò)能壘與細(xì)胞膜的彈性模量呈線性相關(guān)。此外，當(dāng)微孔跨過(guò)疏水階段后，隨著細(xì)胞膜彈性模量增大，孔能量曲線上的穩(wěn)態(tài)點(diǎn)（e,e）左移，對(duì)應(yīng)的微孔半徑越小，細(xì)胞膜彈性模量較小時(shí)，可穩(wěn)定在4nm左右；當(dāng)彈性模量較大時(shí)，穩(wěn)定在很小的半徑，只有1nm左右。

3 討論

3.1 細(xì)胞膜力學(xué)性能對(duì)電穿孔的影響

本文在電場(chǎng)中考慮了細(xì)胞膜的彈性性能，在電場(chǎng)力、線張力和表面張力的共同作用下微孔會(huì)發(fā)展擴(kuò)大，并且由于細(xì)胞膜變形產(chǎn)生了彈性應(yīng)變能。然后分析應(yīng)變能對(duì)微孔能量的改變，以此說(shuō)明細(xì)胞膜的力學(xué)性能對(duì)微孔形成的影響。雖然已有部分學(xué)者[13-15]也研究了細(xì)胞膜應(yīng)變能對(duì)電穿孔的影響，但本文將細(xì)胞膜看作超彈性材料，相較于簡(jiǎn)單的線性彈性材料，能夠更好地描述細(xì)胞膜的特性；而且本文分析了不同力學(xué)性能的細(xì)胞膜下微孔形成的區(qū)別。

細(xì)胞膜的力學(xué)性能及產(chǎn)生的彈性應(yīng)變能對(duì)電穿孔有重要影響，一方面，應(yīng)變能增大了微孔能量，例如從疏水孔向親水孔轉(zhuǎn)變時(shí)的越過(guò)能壘，如當(dāng)跨膜電壓為0.8V時(shí)，增加了17.2×10-21J。而且，細(xì)胞膜彈性模量越大，其微孔越過(guò)能壘越大，并且二者呈線性相關(guān)，導(dǎo)致微孔形成更加困難，這一結(jié)論十分重要。首先，這為不同的細(xì)胞對(duì)脈沖參數(shù)具有選擇性提供了一種可能的解釋，在同一脈沖參數(shù)下，不同的細(xì)胞，不僅它們的幾何參數(shù)和電學(xué)參數(shù)不同，其種類、組成和結(jié)構(gòu)不同而使力學(xué)性能也不同，在電場(chǎng)下所發(fā)生的電穿孔效應(yīng)也會(huì)有差異。例如有很多研究表明[19-20]，當(dāng)細(xì)胞膜上的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架破壞，其彈性降低，電穿孔效應(yīng)越強(qiáng)，如比細(xì)胞骨架未被破壞的細(xì)胞顯示出更多的磷脂酰絲氨酸外翻和碘化丙碇分子的攝取。其次，這對(duì)實(shí)驗(yàn)具有指導(dǎo)意義，例如，為了使彈性模量較大的細(xì)胞發(fā)生電穿孔，就要對(duì)其他影響因素進(jìn)行加強(qiáng)，如外加電場(chǎng)的參數(shù)、細(xì)胞溶液的參數(shù)。

另一方面，考慮到細(xì)胞膜的力學(xué)性能，應(yīng)變能的增加會(huì)使微孔的尺寸穩(wěn)定，而不是無(wú)限制地?cái)U(kuò)大，這與研究[28-29]中的一些結(jié)論是一致的，他們認(rèn)為電穿孔不能產(chǎn)生比細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)錨點(diǎn)更大的孔，換句話說(shuō)，由于細(xì)胞膜上附著有細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)，微孔最初可以迅速擴(kuò)張，直到達(dá)到與細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)中的孔相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定尺寸。通過(guò)本文的仿真，從微孔能量曲線上可預(yù)測(cè)微孔的穩(wěn)定尺寸，從結(jié)果可發(fā)現(xiàn)跨膜電壓和細(xì)胞膜的力學(xué)性能均會(huì)影響微孔的穩(wěn)定尺寸。當(dāng)細(xì)胞膜的彈性模量較小且跨膜電壓較大時(shí)，預(yù)測(cè)可穩(wěn)定的微孔半徑可達(dá)幾納米；當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量較大或跨膜電壓較小時(shí)，穩(wěn)定的微孔半徑約為1nm。

當(dāng)考慮到細(xì)胞膜力學(xué)性能，微孔的形成發(fā)展會(huì)更加困難，從能量守恒角度對(duì)這一現(xiàn)象也能夠很好地解釋。假如把細(xì)胞膜看作電容，在電場(chǎng)下充電儲(chǔ)存的能量為0.5LW2（LW為穿孔前后細(xì)胞膜的單位面積電容，為跨膜電壓），不考慮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或力學(xué)性能時(shí)，這些能量都會(huì)轉(zhuǎn)換為微孔形成并擴(kuò)大的能量。而考慮細(xì)胞膜機(jī)械結(jié)構(gòu)后，細(xì)胞膜上微孔的擴(kuò)大過(guò)程中，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化而變形，變形過(guò)程中需要消耗能量，這部分能量需要從電容能中轉(zhuǎn)化一部分，所以導(dǎo)致完全用于擴(kuò)大微孔的能量減少，表現(xiàn)為微孔的形成會(huì)受到細(xì)胞膜的阻礙作用。

3.2 微孔形態(tài)

在本文中，從細(xì)胞膜變形情況可以看出（見(jiàn)圖6），細(xì)胞膜在電場(chǎng)力、線張力和表面張力的共同作用下沿著孔徑擴(kuò)大的方向壓縮。由于本文把細(xì)胞膜看作不可壓縮彈性材料，細(xì)胞膜在徑向上壓縮使其在厚度方向上凸出，細(xì)胞膜的局部變形導(dǎo)致微孔的邊緣比周圍平整的細(xì)胞膜高出一部分，這就使微孔在整體上呈現(xiàn)火山口形態(tài)。這與D. C. Chang等[28]通過(guò)冷凍電鏡，首次在紅細(xì)胞膜上觀察到電場(chǎng)作用后形成的開口形態(tài)為火山形狀的微孔的現(xiàn)象是一致的。

3.3 微孔重新密封過(guò)程

當(dāng)考慮細(xì)胞膜的力學(xué)性能后，從孔能量曲線上也能預(yù)測(cè)微孔的重新密封過(guò)程，如圖9所示。假設(shè)微孔已從疏水孔過(guò)渡到親水孔狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞膜上的電壓為0.8V時(shí)，微孔能量沿著路徑①，微孔穩(wěn)定時(shí)的半徑約為2.5nm。當(dāng)外加電場(chǎng)撤去后，微孔能量會(huì)跳躍到=0V時(shí)的曲線上（路徑②），之后微孔會(huì)沿著=0V時(shí)的能量曲線變化（路徑③），由能量最低原理可知，微孔半徑會(huì)縮小直至恢復(fù)到微孔半徑約為0.5nm左右的狀態(tài)。但從中也能發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞膜彈性應(yīng)變能的增加，導(dǎo)致孔能量曲線之后會(huì)一直上升，而沒(méi)有發(fā)生不可逆電穿孔的極值點(diǎn)。所以，本文從細(xì)胞膜的力學(xué)性能角度對(duì)電穿孔模型進(jìn)行了改進(jìn)，能夠比較好地描述可逆電穿孔現(xiàn)象，但還不能對(duì)不可逆電穿孔[17, 30]現(xiàn)象進(jìn)行很好的解釋。

圖9 微孔重新密封過(guò)程

4 結(jié)論

本文從仿真角度分析了細(xì)胞膜的力學(xué)性能及其彈性應(yīng)變能在電穿孔中的重要作用，得出以下結(jié)論：

1）在微孔擴(kuò)大過(guò)程中，由于細(xì)胞膜的局部變形會(huì)使微孔邊緣整體呈現(xiàn)火山口形態(tài)。

2）在微孔形成過(guò)程中，細(xì)胞膜的應(yīng)變能會(huì)增大微孔越過(guò)能壘，導(dǎo)致微孔形成更加困難；并且細(xì)胞膜彈性模量越大，微孔所需的越過(guò)能壘越大，且二者線性相關(guān)。

3）在微孔發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞膜應(yīng)變能的增加會(huì)使微孔穩(wěn)定，而不是無(wú)限擴(kuò)大。微孔穩(wěn)定的半徑與跨膜電壓和細(xì)胞膜的力學(xué)性能有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞膜彈性模量較小且跨膜電壓較大時(shí)，微孔可穩(wěn)定在幾個(gè)納米；反之，可穩(wěn)定在1nm左右。本研究為探討細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)電穿孔的影響機(jī)制提供了理論參考。

[1] 吳建光. 利用光鑷研究生物細(xì)胞的力學(xué)行為[D]. 合肥: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué), 2009.

[2] Weaver J C. Electroporation of cells and tissues[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28(1): 24-33.

[3] 程顯, 陳碩, 呂彥鵬, 等. 納秒脈沖作用下核孔復(fù)合體影響細(xì)胞核膜電穿孔變化的仿真研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2021, 36(18): 3821-3828.

Cheng Xian, Chen Shuo, Lü Yanpeng, et al. Simulation study on the effect of nuclear pore complexes on cell electroporation under nanosecond pulse[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2021, 36(18): 3821-3828.

[4] Freeman S A, Wang M A, Weaver J C. Theory of electroporation of planar bilayer membranes: predictions of the aqueous area, change in capacitance, and pore-pore separation[J]. Biophysical Journal, 1994, 67(1): 42-56.

[5] 唐瀟, 姚陳果, 鄭爽, 等. 不可逆電穿孔多因素動(dòng)態(tài)電導(dǎo)率模型的研究與分析[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2021, 36(14): 2912-2921.

Tang Xiao, Yao Chenguo, Zheng Shuang, et al. Establishment and analysis of multi-factor dynamic conductivity model for irreversible electroporation[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2021, 36(14): 2912-2921.

[6] 米彥, 代璐健, 劉權(quán), 等. 靶向金納米棒聯(lián)合納秒脈沖電場(chǎng)對(duì)體外A375黑色素瘤2D模擬組織的消融效果研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2021, 36(18): 3766-3775.

Mi Yan, Dai Lujian, Liu Quan, et al. Ablation effects of A375 melanoma cells treated by targeted gold nanorods combined with nanosecond pulsed electric fields[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2021, 36(18): 3766-3775.

[7] 米彥, 劉權(quán), 李盼, 等. 低強(qiáng)度納秒脈沖電場(chǎng)聯(lián)合靶向金納米棒對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞的殺傷效果研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2020, 35(12): 2534-2544.

Mi Yan, Liu Quan, Li Pan, et al. Study of killing effects of A375 melanoma cells treated by low intensity nanosecond pulsed electric fields combined with targeted gold nanorods[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2020, 35(12): 2534-2544.

[8] 姚陳果, 寧郡怡, 劉紅梅, 等. 微/納秒脈沖電場(chǎng)靶向不同尺寸腫瘤細(xì)胞內(nèi)外膜電穿孔效應(yīng)研究[J]. 電工技術(shù)學(xué)報(bào), 2020, 35(1): 115-124.

Yao Chenguo, Ning Junyi, Liu Hongmei, et al. Study of electroporation effect of different size tumor cells targeted by micro-nanosecond pulsed electric field[J]. Transactions of China Electrotechnical Society, 2020, 35(1): 115-124.

[9] van Uitert I, Le Gac S, van den Berg A. The influence of different membrane components on the electrical stability of bilayer lipid membranes[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1798(1): 21-31.

[10] Thompson G L, Roth C, Tolstykh G, et al. Disruption of the actin cortex contributes to susceptibility of mammalian cells to nanosecond pulsed electric fields[J]. Bioelectromagnetics, 2014, 35(4): 262-272.

[11] Muralidharan A, Rems L, Kreutzer M T, et al. Actin networks regulate the cell membrane permeability during electroporation[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 2021, 1863(1): 183468.

[12] Kim H B, Lee S, Chung J H, et al. Effects of actin cytoskeleton disruption on electroporation invitro[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2020, 191(4): 1545-1561.

[13] Sun Sheng, Yin Guangyao, Lee Y K, et al. Effects of deformability and thermal motion of lipid membrane onelectroporation: by molecular dynamics simulations[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 404(2): 684-688.

[14] Hoiles W, Krishnamurthy V, Cranfield C G, et al. An engineered membrane to measure electroporation: effect of tethers and bioelectronic interface[J]. Biophysical Journal, 2014, 107(6): 1339-1351.

[15] Hoiles W, Krishnamurthy V, Cornell B. Modelling the bioelectronic interface in engineered tethered membranes: from biosensing to electroporation[J]. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems, 2015, 9(3): 321-333.

[16] Deng Peigang, Lee Y K, Zhang Tongyi. A nonlinear electromechanical coupling model for electropore expansion in cell electroporation[J]. Journal of Physics D: Applied Physics, 2014, 47(44): 445401.

[17] Deng Peigang, Lee Y K, Lin Ran, et al. Nonlinear electro-mechanobiological behavior of cell membrane during electroporation[J]. Applied Physics Letters, 2012, 101(5): 053702.

[18] Heyden S, Ortiz M. Investigation of the influence of viscoelasticity on oncotripsy[J]. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering, 2017, 314: 314-322.

[19] Neu W K, Neu J C. Mechanism of irreversible electroporation in cells: insight from the models[M]. Berlin, Heidelberg: Springer, 2010.

[20] Dastani K, Moghimi Zand M, Hadi Amin, et al. Revealing electrical stresses acting on the surface of protoplast cells under electric field[J]. European Journal of Mechanics - B/Fluids, 2019, 76: 292-302.

[21] Karatekin E, Sandre O, Guitouni H, et al. Cascades of transient pores in giant vesicles: line tension and transport[J]. Biophysical Journal, 2003, 84(3): 1734-1749.

[22] 董守龍. 高頻雙極性微秒脈沖電場(chǎng)不可逆電穿孔消融腫瘤的實(shí)驗(yàn)與機(jī)理研究[D]. 重慶: 重慶大學(xué), 2017.

[23] Boyce M C, Arruda E M. Constitutive models of rubber elasticity: a review[J]. Rubber Chemistry and Technology, 2000, 73(3): 504-523.

[24] Tan Youhua, Sun Dong, Huang Wenhao. A mechanical model of biological cells in microinjection[C]//2008 IEEE International Conference on Robotics and Biomimetics, Bangkok, Thailand, 2009: 61-66.

[25] Skalak R, Tozeren A, Zarda R P, et al. Strain energy function of red blood cell membranes[J]. Biophysical Journal, 1973, 13(3): 245-264.

[26] Xu Dong, Kaliviotis E, Munjiza A, et al. Large scale simulation of red blood cell aggregation in shear flows[J]. Journal of Biomechanics, 2013, 46(11): 1810-1817.

[27] Kotnik T, Rems L, Tarek M, et al. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models[J]. Annual Review of Biophysics, 2019, 48: 63-91.

[28] Chang D C, Reese T S. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy[J]. Biophysical Journal, 1990, 58(1): 1-12.

[29] Graybill P M, Davalos R V. Cytoskeletal disruption after electroporation and its significance to pulsed electric field therapies[J]. Cancers, 2020, 12(5): 1132.

[30] Latouche E L, Arena C B, Ivey J W, et al. High-frequency irreversible electroporation for intracranial meningioma: a feasibility study in a spontaneous canine tumor model[J]. Technology in Cancer Research & Treatment, 2018, 17: 1533033818785285.

Simulation Study on the Effect of Cell Membrane Mechanical Properties on Electroporation

Mi Yan Wu Xiao Xu Jin Zheng Wei Ma Chi

（State Key Laboratory of Power Transmission Equipment & System Security and New Technology Chongqing University Chongqing 400030 China）

To explore the influence of the mechanical properties of cell membrane on electroporation, cell membrane was regarded as a hyperelastic material, and an electromechanical coupling model of local single pore on the cell membrane was established in COMSOL. The influence of the elastic strain energy of the cell membrane on the pore formation was analyzed and the difference of pore formation with different elastic modulus of the cell membrane was compared. The results show that the strain energy of the cell membrane increases the energy barrier for transition from hydrophobic pore to hydrophilic pore. The greater the elastic modulus of the cell membrane, the greater the energy barrier is, and the two are linearly related. On the other hand, the increased strain energy stabilizes the pores and prevents them from expanding indefinitely, and the stable size is related to the mechanical properties of the cell membrane and the transmembrane potential. This paper reveals the importance role of the mechanical properties of the cell membrane in electroporation through simulation, which provides a theoretical reference for studying the influence mechanism of cell structure on electroporation.

Mechanical properties, electroporation, electromechanical coupling, strain energy, pore energy

10.19595/j.cnki.1000-6753.tces.211105

TM836；Q64

國(guó)家自然科學(xué)基金（52077022，51477022）和“111”引智項(xiàng)目（BP0820005）資助。

2021-07-15

2021-09-20

米 彥 男，1978年生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楦唠妷盒录夹g(shù)。E-mail：miyan@cqu.edu.cn（通信作者）

吳 曉 女，1996年生，碩士研究生，研究方向?yàn)楦唠妷盒录夹g(shù)。E-mail：20191102061t@cqu.edu.cn

（編輯 郭麗軍）