潘丹陽(yáng)，何敬愉，陳慧芳，陳英杰，劉孟華，龔盛昭，

（1. 廣州環(huán)亞化妝品科技股份有限公司，廣東 廣州 510663；2. 南方醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；3. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

脫發(fā)（Alopecia） 或稱禿發(fā)，是一種以毛發(fā)減少為特征的皮膚疾病［1］。它的種類較多，如先天性脫發(fā)、斑禿以及雄激素源性脫發(fā)等，但病因尚不完全清楚。一般認(rèn)為與遺傳、內(nèi)分泌功能、感染病灶、自身免疫功能、精神因素以及營(yíng)養(yǎng)狀況等都有一定關(guān)系［2］。生姜為姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的新鮮根莖，具有解表散寒，溫中止嘔，化痰止咳，解魚蟹毒的功效［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生姜具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、解熱、抗氧化、降血糖、保肝、利尿、降膽固醇等作用［4］。揮發(fā)油是生姜中的主要成分，不僅應(yīng)用到醫(yī)藥產(chǎn)品中，還應(yīng)用到功能食品、化妝品和香料中?；瘜W(xué)研究表明生姜揮發(fā)油主要含有萜類化合物，如單萜烯類、單萜烯類氧化物、倍半萜烯類、倍半萜烯類氧化物，還含有酚類和鏈烴類化物［5-6］。研究表明：生姜提取物可增加人毛囊真皮乳頭細(xì)胞，從而改善脫發(fā)癥狀［7］。亦有報(bào)道證實(shí)生姜提取物具有明顯的促毛發(fā)生長(zhǎng)作用，其對(duì)毛發(fā)的生長(zhǎng)速度影響呈現(xiàn)劑量依賴性［8］，但其作用機(jī)制尚未明確。本文旨在明確生姜揮發(fā)油化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究其緩解斑禿癥狀的可能分子機(jī)制，為其應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP和BATMAN-TCM平臺(tái)得到生姜揮發(fā)油相關(guān)的化學(xué)成分。

1.2 方法

1.2.1 蛋白靶點(diǎn)的收集、篩選和處理

利 用GeneCard數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org/）對(duì)“alopecia”（Score≥10）進(jìn)行檢索，對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行保存。另外，UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//sparql.uniprot.org/）以“alopecia+reviewed +Homosapiens”進(jìn)行檢索，并對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行保存。利用Venn分析工具，將病理靶點(diǎn)進(jìn)行疊加，除去重復(fù)靶點(diǎn)。在RCSB Protein Data Bank（RCSB PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）篩選靶蛋白，并根據(jù)是否存在蛋白-配體復(fù)合物、晶體結(jié)構(gòu)以及分辨率，最終確定了57個(gè)靶蛋白。在進(jìn)行分子對(duì)接前，應(yīng)用Sybyl7.3軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行修飾處理，包括去除原配體、去除水分子、加氫以及對(duì)氨基酸殘基和力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化等處理。

1.2.2 分子對(duì)接

使用Sybyl7.3軟件中的Surflex-Dock插件將生姜揮發(fā)性成分和人類脫發(fā)癥相關(guān)靶蛋白進(jìn)行分子半柔性對(duì)接。

1.2.3 分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了更準(zhǔn)確地找到有效成分，識(shí)別分子的主要靶標(biāo)，利用Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行化合物-脫發(fā)癥靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。首先，根據(jù)上述分子對(duì)接結(jié)果，以靶蛋白與原配體的對(duì)接分?jǐn)?shù)（Total Scores）為閾值，打分高于此閾值的化合物即認(rèn)為具有較好的活性。本次實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)接分?jǐn)?shù)大于或等于6的分子-靶蛋白創(chuàng)建一個(gè)Microsoft Excel文件，將Microsoft Excel作為輸入源，導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape 3.7.1中的 “Network analyzer”對(duì)生姜分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)進(jìn)行了分析。在構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中，化合物與靶蛋白用節(jié)點(diǎn)表示，當(dāng)化合物與靶蛋白有相互作用時(shí)用邊緣連接。通過得到的拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)參數(shù)來預(yù)測(cè)可能的活性成分群和關(guān)鍵的治療脫發(fā)靶蛋白。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系的構(gòu)建

為了更好地探索生姜揮發(fā)性成分改善脫發(fā)癥的作用機(jī)制，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)建立了靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將與脫發(fā)癥靶點(diǎn)的基因輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），限定物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，以置信度（0.4）為條件篩選，獲取蛋白相互作用關(guān)系。分析結(jié)果保存為Tsv格式文件，導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape 3.7.1中的 “Network analyzer”對(duì)生姜分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)合節(jié)點(diǎn)度值大小，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 靶點(diǎn)通路分析

借助于DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)疾病相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸類展示。KEGG通路富集分析獲得的信號(hào)通路結(jié)果根據(jù)FDR＜0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選、排序、展示。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)油成分分析

通過對(duì)TCMSP平臺(tái)和BATMAN-TCM平臺(tái)進(jìn)行檢索，除去烷烴類化合物后，共獲取生姜揮發(fā)性成分105個(gè)。其化合物名稱見表1。

表1 生姜揮發(fā)油中化合物信息

2.2 蛋白靶點(diǎn)的分析

GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與人類脫發(fā)癥相關(guān)的基因有182個(gè)（Score≥10），通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的人類脫發(fā)癥相關(guān)的基因有46個(gè)，除去重復(fù)基因，共獲取196個(gè)與人類脫發(fā)癥相關(guān)的基因。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選蛋白靶點(diǎn)，并根據(jù)是否存在蛋白-配體復(fù)合物、晶體結(jié)構(gòu)以及分辨率，最終確定了57個(gè)靶蛋白。

2.3 分子-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Sybyl7.3軟件中的Surflex-Dock 插件將生姜揮發(fā)油中105個(gè)化合物和57個(gè)人類脫發(fā)癥相關(guān)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子半柔性對(duì)接，如表2所示。根據(jù)設(shè)定的閾值，有48個(gè)化合物對(duì)48個(gè)靶蛋白表現(xiàn)出較好的活性，并構(gòu)建分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（見圖1，綠色表示靶點(diǎn)；紫色表示化合物；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度呈正比例關(guān)系）。構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)數(shù)為96個(gè)，邊數(shù)為470條，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)9.771個(gè)，最短路徑為9 120，特征路徑長(zhǎng)度2.600，網(wǎng)絡(luò)密度0.103，網(wǎng)絡(luò)中心度0.293，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性0.825。分析獲得生物網(wǎng)絡(luò)和節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)特征，挖掘潛在的生物學(xué)信息。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選出的度值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些連接化合物或靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐作用，可能為關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn)。有36.7%的化合物的作用靶點(diǎn)≥10個(gè)，作用靶點(diǎn)≥20個(gè)的化合物有10個(gè)。從化合物角度來看，度值排名前5位 的 是6-Methylgingediacetate（Com10）、10-Gingediol （Com73）、Gingerenone B（Com72）、10-Gingerol（Com29）、Gingerdione（Com87）。從蛋白靶點(diǎn)角度來看，度值排名前5位為FLG、SLITRK1、IL1B、CASR、ANTR1。

圖1 生姜揮發(fā)油-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 用于分子對(duì)接的靶點(diǎn)信息

2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

構(gòu)建的蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)數(shù)為40個(gè)，邊數(shù)為269條，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖2，藍(lán)色表示Degree≥20的蛋白；粉色表示10≤Degree ＜ 20的蛋白；綠色表示Degree ＜ 10的蛋白；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度呈正比例關(guān)系）的平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)13.45個(gè)，最短路徑為1560，特征路徑長(zhǎng)度1.822，網(wǎng)絡(luò)密度0. 345，網(wǎng)絡(luò)中心度0.420，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性0.652。Degree≥20的節(jié)點(diǎn)有12個(gè)，包括TNF、IL6、ALB、IL10、IL17A、IL2、PTPRC、IFNG、IL4、ICAM1、IL13、CXCL10。其中度值前3名為TNF、IL6、ALB，分別能與29、28、27個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。

圖2 生姜揮發(fā)油相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析

對(duì)生姜揮發(fā)油中化合物有作用的48個(gè)蛋白進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析（見表3）。根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05確定了687個(gè)生物過程（Biological Process，BP）條目，21個(gè)分子功能（Molecular Function，MF）條目，14個(gè)細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）條目，分別占95.15%、2.91%、1.94%，表3根 據(jù)FDR列出前20個(gè)BP條目，前5個(gè)MF條目，前5個(gè)CC條目。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的GO條目

2.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析，對(duì)生姜揮發(fā)油中化合物有作用的48個(gè)蛋白在信號(hào)通路中的作用進(jìn)行了研究，得到118條信號(hào)通路，根據(jù)FDR＜ 0.01篩選出20條（見表4）與炎癥及免疫相關(guān)的信號(hào)通路，如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作 用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、IL-17信 號(hào) 通 路（IL-17 signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）。

表4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的KEGG通路

3 討論

中藥是一個(gè)由多類別化合物組成的復(fù)雜體系，同時(shí)通過多分子、多靶點(diǎn)、多途徑作用于疾病，而起到一定的治療效果。脫發(fā)是臨床上常見的皮膚病，由諸多因素引起，存在多種發(fā)病機(jī)制［1］。本研究通過分子對(duì)接手段分析活性化合物與靶點(diǎn)蛋白間的相互作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)，探究生姜揮發(fā)油改善和治療脫發(fā)癥的作用機(jī)制。當(dāng)前研究表明生姜提取物具有明顯的促毛發(fā)生長(zhǎng)作用，其對(duì)毛發(fā)的生長(zhǎng)速度影響呈現(xiàn)劑量依賴性［8］。但有一報(bào)道提示，涂抹1 mg/ml高濃度的6-姜辣素可顯著減少C57BL/6小鼠的毛囊數(shù)量［9］。生姜揮發(fā)油的使用量是一個(gè)影響其治療功效的重要因素。

在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中白細(xì)胞介素（IL）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在脫發(fā)癥中是重要的靶點(diǎn)。IL是在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用［10］。TNF-α是一種重要的促炎因子，通過引起機(jī)體失衡和炎癥反應(yīng)，破壞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持過程［11］。生姜水提物、6-姜辣素和山姜醇有抗炎作用，通過抑制IL-1β、TNF-α、 IL-6和 IL-8的產(chǎn)生，對(duì)UVB誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞和小鼠皮膚損傷有保護(hù)作用［12］。6-姜烯酚以濃度依賴的方式抑制細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生［13］。另外，8-姜辣素、10-姜辣素、8-姜烯酚和10-姜烯酚可以抑制TNF-α的產(chǎn)生［14］。細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）是一種屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面糖蛋白。ICAM-1在許多類型的細(xì)胞中低水平表達(dá)，其表達(dá)主要在NF-κB轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)以響應(yīng)促炎性細(xì)胞因子［15］。IFN-γ是由特定抗原或有絲分裂原激活的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能［16］。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，毛囊的喪失是由先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)共同介導(dǎo)的，Th1細(xì)胞因子和CD8+T細(xì)胞是主要的效應(yīng)因子［17-18］。脫發(fā)皮損中IFNγ水平的升高可誘導(dǎo)趨化因子CXCL9和CXCL10，這些趨化因子在放大毛囊周圍的T細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，從而使其靶向應(yīng)對(duì)脫發(fā)的特異性自身抗原［19-20］。目前，對(duì)生姜揮發(fā)油中免疫和抗炎成分研究主要集中于姜酚和姜烯酚，對(duì)于本研究挖掘到的潛在活性化合物6-Methylgingediacetate、10-Gingediol、Gingerenone B和Gingerdione，在免疫和炎癥方面的研究非常少。這也提示生姜揮發(fā)油中姜酮和姜烯酮是兩類重要的活性組分。從分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析，對(duì)于脫發(fā)癥改善和治療，生姜中存在多分子與單靶蛋白作用、單分子與多靶蛋白作用的現(xiàn)象，符合中藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特征。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，生姜揮發(fā)油在改善脫發(fā)時(shí)的基因功能主要體現(xiàn)在對(duì)生物過程、分子功能、細(xì)胞成分等過程，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)控方面。對(duì)基因的KEGG通路富集分析中，大部分基因富集到了與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)相關(guān)的通路上，主要有細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路，分別富集了18，8，8，9，11個(gè)基因。細(xì)胞因子是可溶的細(xì)胞外蛋白或糖蛋白，是細(xì)胞的重要細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子和動(dòng)員劑，參與固有和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞死亡、血管生成以及旨在恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和修復(fù)過程［21］。白細(xì)胞介素17（IL-17）家族通過其相應(yīng)的受體發(fā)出信號(hào)，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內(nèi)的下游通路，誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，在急性和慢性炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用［22］。生姜提取物可以抑制絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）、p38和c-Jun N-末端激酶（JNK）的磷酸化以及NF-κB的激活，通過MAPK和NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮 抗炎 作 用［23］。T細(xì) 胞 受體（T Cell Receptor，TCR）在T細(xì)胞的功能和免疫突觸的形成中起著關(guān)鍵作用。它提供T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間的聯(lián)系。TCRs的激活促進(jìn)了許多信號(hào)級(jí)聯(lián)，這些級(jí)聯(lián)最終通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞存活、增殖和分化來決定細(xì)胞的命運(yùn)［24］。生姜提取物能顯著抑制Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這表現(xiàn)為IL-4和IL-5的mRNA表達(dá)水平降低［25］。6-姜辣素抑制了Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞從初始T細(xì)胞的體外分化，還影響T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［26］。Jak-STAT信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路是脫發(fā)癥狀中不可忽視的；Jak/STAT途徑是為數(shù)不多的多效性級(jí)聯(lián)之一，是一系列細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的主要信號(hào)機(jī)制，用于在動(dòng)物中傳遞大量的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)信號(hào)。除了激活STATs外，Jaks還介導(dǎo)其他分子的募集，如MAPK、PI3K等［27］。在PI3K-Akt 信號(hào)通路中，PI3K催化細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）的生成。PIP3反過來充當(dāng)?shù)诙€(gè)信使，幫助激活A(yù)kt。激活后的Akt可以通過磷酸化參與凋亡、蛋白質(zhì)合成、代謝和細(xì)胞周期的底物來控制關(guān)鍵的細(xì)胞過程［28］。研究表明姜烯酮A能夠抑制Jak2；與6-姜烯酚、姜黃素、四氫姜黃素比較，它還能抑制STAT3的磷酸化［29］。此外，6-姜烯酚通過抑制NF-κBp65的磷酸化和核轉(zhuǎn)位來抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化［13］。這些說明由炎癥及自身免疫引起的脫發(fā)癥，生姜揮發(fā)油可以通過對(duì)炎癥和免疫等多個(gè)生物途徑信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)揮改善和治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，分析了生姜揮發(fā)油的多成分、多靶點(diǎn)以及多通路的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，揭示了生姜揮發(fā)油改善脫發(fā)癥狀的潛在分子機(jī)制。為了對(duì)篩選出來的相關(guān)基因及蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，需要進(jìn)一步從細(xì)胞及分子層面闡明生姜揮發(fā)油中各個(gè)化合物，特別是在本研究中挖掘到的潛在化合物，在免疫和抗炎等信號(hào)通路的調(diào)控作用機(jī)制，明確化合物的有效性、安全性及起效用量，為臨床使用及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。