●李雪萍 金 鑫

（1.蘭州新區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院 甘肅 蘭州 730300；2.臨沂大學(xué) 山東 臨沂 276005）

萬(wàn)壽菊（Tagetes erectaL.），又名臭芙蓉，為菊科萬(wàn)壽菊屬植物。為了提高萬(wàn)壽菊的栽培觀(guān)賞價(jià)值，研究者對(duì)萬(wàn)壽菊品種抗旱性[1]、耐鹽性[2]進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，并對(duì)干旱條件下促進(jìn)萬(wàn)壽菊不定根的發(fā)生[3]進(jìn)行了研究，并取得一定的研究成果。但對(duì)萬(wàn)壽菊不定根發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

雙 向 電 泳（Two dimensional electrophoresis，2-DE）作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一，最早建立于1975年，該方法大大提高了蛋白質(zhì)分離的分辨率和重復(fù)性[4]。本研究采用改良TCA/丙酮沉淀法，在膜蛋白和疏水性蛋白的提取方面進(jìn)行了改善，對(duì)雙向電泳的上樣量、等電聚焦參數(shù)及分離膠濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到適于萬(wàn)壽菊全蛋白分析的提取方法和雙向電泳技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用萬(wàn)壽菊種子為泛美奇跡系列黃色，2021年2月購(gòu)自蘭州市甘肅新時(shí)代園林工程公司。參考Liao等[5]的方法，將萬(wàn)壽菊種子進(jìn)行消毒，萌發(fā)5 d。控制好環(huán)境因子，萌發(fā)期間培養(yǎng)箱溫度為（25±1）℃，每天光照14 h，光強(qiáng)為200 μmol/（s·m2）。培養(yǎng) 5 d 后的萬(wàn)壽菊幼苗，在下胚軸基部切去乳白色初生根，作為外植體在裝有蒸餾水、0.1% PEG溶液（w/v）、PEG+NO （SNAP作為NO供體）和PEG+H2O2中繼續(xù)培養(yǎng)3 h[6]后取樣，用液氮速凍保存至-80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TCA/丙酮法取4 g樣品于研缽中，加入0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）用液氮研磨至粉末。用含0.7 g/L二硫蘇糖醇（DTT）的丙酮溶液洗滌沉淀至顏色變白，沉淀真空干燥。加入裂解液室溫裂解2 h，離心上清即為蛋白[7]。

1.2.2 改良TCA/丙酮法參照Damerval等[7]的方法并做修改。取2 g樣品于研缽中，加入0.04 g PVPP，5倍體積的 Tris-Hcl（含1 mmol/L PMSF），混勻離心，取上清加入5倍體積TCA/丙酮［含10% TCA和0.07% β-巰基乙醇（β-ME）］，棄上清，沉淀用預(yù)冷丙酮（含0.07% β-ME）進(jìn)行洗滌，干燥后加蛋白裂解液，其中DTT現(xiàn)加，離心上清即為蛋白。

1.2.3 蛋白定量參照Bradford方法進(jìn)行蛋白定量，配制考馬斯亮藍(lán)（CBB）G-250染色液和牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液，加超純水配制不同濃度的蛋白溶液，加比色液測(cè)定其顯色后的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白樣品的OD值，依據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)樣品蛋白質(zhì)的濃度[8]。

1.2.4 蛋白質(zhì)雙向電泳參考Bio-Rad 雙向電泳操作手冊(cè)，使用Bio-Rad Protean?i12TMIEF Cell系統(tǒng)，選取17 cm pH 4～7的線(xiàn)性膠條，上樣量設(shè)為400 μg 和600 μg，加入水化上樣緩沖液，補(bǔ)足至400 μL。設(shè)置IEF程序，開(kāi)始第一向等電聚焦。設(shè)置每根膠條的極限電流50 μA，設(shè)置等點(diǎn)聚焦溫度為20℃。聚焦結(jié)束后，立即開(kāi)始膠條平衡，平衡結(jié)束后，開(kāi)始第二向SDS-PAGE，再進(jìn)行染色脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取對(duì)萬(wàn)壽菊全蛋白含量的影響

圖1中的maker是對(duì)照組（a），清晰度適中，中間2個(gè)不清晰的垂直電泳條帶（b，c）是通過(guò)TCA/丙酮法提取萬(wàn)壽菊全蛋白得到的，右邊2條清晰的垂直電泳條帶（d，e）是通過(guò)改良TCA/丙酮法提取萬(wàn)壽菊全蛋白得到的，且改良后的垂直電泳條帶明顯有增加。因此，改良后的方法更適合萬(wàn)壽菊全蛋白的提取。

圖1 萬(wàn)壽菊全蛋白不同提取方法的SDS-PAGE圖譜

2.2 不同分離膠濃度對(duì)萬(wàn)壽菊蛋白質(zhì)分離效果的影響

由圖2所示，條帶a分離膠濃度為10%時(shí)，蛋白分離過(guò)快，至電泳跑膠完成時(shí)，蛋白條帶集中在尾部，且由于蛋白分離速度較快，分離區(qū)域長(zhǎng)度無(wú)法滿(mǎn)足；當(dāng)分離膠濃度為15%（條帶c）時(shí)，蛋白質(zhì)分離過(guò)慢，至電泳跑膠完成時(shí)，膠的上部存在大量蛋白聚集，蛋白質(zhì)未能充分分離；相比較而言，在濃度為12%（條帶b）的分離膠中，對(duì)蛋白的分離效果最好，各分子量蛋白條帶都較清晰的展現(xiàn)在SDS-PAGE圖譜上。因此，分離膠濃度為12%時(shí)，最適合萬(wàn)壽菊全蛋白的分離。

圖2 不同分離膠濃度對(duì)SDS-PAGE圖譜的影響

2.3 不同蛋白上樣量對(duì)2-DE圖譜的影響

上樣量對(duì)2-DE圖譜具有較大影響，上樣量過(guò)高或過(guò)低均不能滿(mǎn)足雙向電泳分析的需要，合適的上樣量才能達(dá)到最佳的蛋白分離效果。試驗(yàn)設(shè)400 μg和600 μg 2個(gè)上樣量進(jìn)行雙向電泳（圖3）。上樣量為400 μg，分離膠濃度為10%時(shí)，橫條紋、豎條紋多，背景不夠清晰，蛋白點(diǎn)有較為明顯的拖尾，并且有些較大的斑點(diǎn)將周?chē)拓S度蛋白斑點(diǎn)掩蓋（圖3-a）。上樣量為400 μg，分離膠濃度為12%時(shí)，2-DE圖譜的效果略有改善，但蛋白點(diǎn)分離不夠清晰（圖3-b）。上樣量為600 μg，分離膠濃度為12%時(shí)，一些低豐度蛋白得到充分分離且各豐度蛋白點(diǎn)得到均勻的分布，2-DE圖譜背景清晰，存在較小擴(kuò)散及拖尾現(xiàn)象（圖3-c）。因此，選擇600 μg上樣量、12%分離膠濃度進(jìn)行雙向電泳分析可達(dá)到較好的分離效果。

圖3 不同上樣量對(duì)2-DE圖譜的影響

3 討論

本試驗(yàn)參照Wang等[9]的方法，選定65 mmol/L DTT加入水化上樣緩沖液和裂解液，是為了保護(hù)二硫鍵并促進(jìn)其溶解，兩性離子去污劑CHAPS能顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性，所以在裂解液中添加了4%的CHAPS 促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解。

蛋白質(zhì)分離的清晰度很大程度上由分離膠濃度決定，若膠的濃度較低，雖然蛋白質(zhì)點(diǎn)能夠較好地分離，但會(huì)丟失分子量較小的蛋白；若膠濃度過(guò)高，蛋白質(zhì)分離不夠清晰且有的蛋白點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)重疊[10]。對(duì)于番茄子葉[11]等多數(shù)植物組織來(lái)說(shuō) ，12% 的分離膠濃度較適合其蛋白質(zhì)的分離，本研究也得出濃度為12%的分離膠更適合萬(wàn)壽菊幼苗全蛋白的分離。

上樣量的大小直接影響蛋白點(diǎn)的獲取和雙向電泳的分辨率。合適的上樣量有利于蛋白的分離，并且在凝膠圖譜上清晰地顯現(xiàn)更多不同分子量的蛋白。在番茄子葉總蛋白雙向電泳的研究中，選擇300 μg為最適上樣量[11]；向日葵種子蛋白雙向電泳中，選擇1000 μg為最佳上樣量[12]。在本研究中，當(dāng)上樣量達(dá)到600 μg時(shí)，2-DE 蛋白質(zhì)圖譜的分辨率較高，而且一些低豐度蛋白得以顯現(xiàn)，因此，600 μg上樣量足以進(jìn)行后續(xù)研究。