郭杰，史鋒, 2*，孫慢慢，馬凡淇，李永富

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，241122)2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù) 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(上海北連食品有限公司，上海，201114) 4(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

亞硝酸鈉因其抑菌、防腐、增色等特性而被廣泛作為食品添加劑，并且腌制食物存放一定時間也會產(chǎn)生亞硝酸鈉[1]。但是，過量攝入亞硝酸鈉會導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，這種現(xiàn)象在嬰兒中頻繁出現(xiàn)，對嬰兒健康造成嚴(yán)重危害。更為嚴(yán)重的是，亞硝酸鹽是亞硝胺的前體物質(zhì)，而亞硝胺是被廣泛證實(shí)的強(qiáng)致癌物質(zhì)[2]。因此，尋找天然食物成分來有效降低食品中的亞硝酸鈉以及阻斷亞硝胺合成已成為食品工業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)。

麒麟菜是一種大型海洋經(jīng)濟(jì)紅藻，含有大量的卡拉膠和粗纖維，主要用途是提取卡拉膠。隨著卡拉膠在食品和化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了大量的麒麟菜提膠殘渣。這些殘渣大部分僅當(dāng)作廢棄物處理，不僅未能發(fā)揮其剩余價值，也造成了環(huán)境污染。而事實(shí)上麒麟菜殘渣中含有豐富的不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)，這些IDF富含羥基與羧基等官能團(tuán)，具有較強(qiáng)的結(jié)合能力和吸水膨脹特性[3]。已有研究表明某些植物IDF具有吸附亞硝酸鈉的能力[4-6]，并且纖維吸水膨脹后，可以加快腸道蠕動進(jìn)而將所吸附的亞硝酸鈉等有害物質(zhì)帶出體外。然而目前的研究多集中于麒麟菜全海藻的應(yīng)用，缺乏麒麟菜殘渣吸附有害物質(zhì)的研究。本文研究了不同粒度麒麟菜殘渣的理化性質(zhì)、亞硝酸鈉吸附能力和亞硝胺合成阻斷能力，為人們有效開發(fā)麒麟菜殘渣資源提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耳突麒麟菜殘渣，浙江上方科技有限公司，其膳食纖維含量約為91%，其中可溶性膳食纖維干基含量為0.88%，IDF干基含量為90.1%。使用超微粉碎機(jī)粉碎麒麟菜殘渣得到粗樣以及40、100、150、200、300目5個不同目數(shù)的樣品，分別記為EC、E40、E100、E150、E200、E300。亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、二甲胺水溶液(體積分?jǐn)?shù)為40%)、α-萘胺，國藥化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用的所有試劑均是國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子精密天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；JYNU40-37M超微粉碎機(jī)，青島捷怡納機(jī)械科技有限公司；UV1800紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；THZ-300C恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉的理化性質(zhì)測定

持水力[7]、膨脹力[8]和陽離子交換能力[9]分別參照文獻(xiàn)報道的方法測定。

1.3.2 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉的亞硝酸鈉吸附能力測定

1.3.2.1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考文獻(xiàn)[10]的方法建立亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉的吸附實(shí)驗(yàn)

稱取400 mg麒麟菜殘渣粗粉和超微粉于50 mL離心管，加入4 mL 20 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加模擬胃液至20 mL(此時混合液中麒麟菜殘渣添加量為20 mg/mL，亞硝酸鈉的初始質(zhì)量濃度為4 μg/mL)，在37 ℃、150 r/min恒溫水浴中振搖4 h。

然后均選用E200進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：在不同劑量麒麟菜殘渣的吸附實(shí)驗(yàn)中，E200的添加量分別為5、15、20、25、30、35、40 mg/mL；在不同吸附時間下的吸附實(shí)驗(yàn)中，時間設(shè)置為5、10、15、30、60、120、150、180、210、240、270 min；在不同亞硝酸鈉初始濃度的吸附實(shí)驗(yàn)中，亞硝酸鈉的初始濃度分別設(shè)為2、4、10、100、200、400 μg/mL。

1.3.2.3 麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉吸附率的測定

參照劉星等[11]的方法，將上述振搖吸附后的反應(yīng)液于4 000 r/min離心10 min，取出10 mL上清液，立即加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2.0 mL，混勻，靜置3～5 min后再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加雙蒸水至25 mL，靜置15 min，在波長538 nm處測定吸光度。亞硝酸鈉吸附率按公式(1)計算：

(1)

式中：A0，無麒麟菜殘渣樣品(只含亞硝酸鈉)的吸光度；Ai，麒麟菜殘渣樣品與亞硝酸鈉混合液的吸光度；Aj，麒麟菜殘渣樣品的本底吸光度。

1.3.3 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉對亞硝胺合成阻斷率的測定

參照趙二勞等[12]的方法，向15 mL離心管中加入200 mg麒麟菜殘渣粗粉和超微粉，然后依次加入4 mL模擬胃液、0.4 mL 10 mmol/L的亞硝酸鈉溶液、0.4 mL 10 mmol/L的二甲胺溶液，用雙蒸水定容至10 mL，37 ℃振搖4 h后4 000 r/min離心10 min。吸取1.0 mL上清液加到6孔培養(yǎng)板中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上照15 min后，加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的對氨基苯磺酸溶液和1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的α-萘胺溶液以及0.5 mL雙蒸水，搖勻后靜置15 min。用紫外可見分光光度計在525 nm處測吸光度。按公式(2)計算亞硝胺合成阻斷率：

(2)

式中：A0，無麒麟菜殘渣樣品的吸光度；Ai，加入麒麟菜殘渣樣品的吸光度；Aj，麒麟菜殘渣樣品的本底吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行顯著性分析，顯著性差異水平設(shè)為0.05，使用Origin軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉的理化性質(zhì)

持水力和膨脹力是評價物質(zhì)水合特性的重要指標(biāo)。具有較佳的吸水膨脹特性的物質(zhì)可加快腸道蠕動，并將吸附的有害物質(zhì)帶出體外。陽離子交換能力反映了纖維鏈的斷裂及基團(tuán)暴露程度，暴露出來的基團(tuán)越多越有利于吸附有害物質(zhì)。如圖1所示，在麒麟菜殘渣粗粉和超微粉中，粗樣(EC)的持水力和膨脹力最小，分別為(4.07±0.04) g/g和(2.40±0.19) mL/g，E40持水力和膨脹力最大，分別為(5.61±0.06) g/g和(5.67±0.30) mL/g。隨著超微粉碎程度的增大，持水力和膨脹力有所下降，直至基本穩(wěn)定在4.9 g/g和4.5 mL/g。隨著粒度減小，陽離子交換能力由EC的(0.18±0.001) mmol NaOH/g增加至E300的(0.32±0.02) mmol NaOH/g。GOI等[13]的研究中，商業(yè)膳食纖維Fibra Leo的持水力和膨脹力分別為(3.1±0.1) g/g和(6.2±0.3) mL/g，說明麒麟菜殘渣超微粉的水合特性可以與商業(yè)可用膳食纖維相媲美。

陽離子交換能力增加主要是因?yàn)榘l(fā)生交換反應(yīng)所需的側(cè)鏈基團(tuán)增加，由此驗(yàn)證了超微粉碎破壞了纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且粉碎程度越強(qiáng)，暴露出來的基團(tuán)越多。E40的水合性質(zhì)顯著提高也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)，但是在繼續(xù)粉碎后持水能力和膨脹力有所減小，主要是因?yàn)檫^度粉碎破壞了麒麟菜殘渣顆粒的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致水合性能輕微下降。以上結(jié)果表明麒麟菜殘渣超微粉可能具有一定的吸附性能及較高的吸水膨脹性能，可以吸附腸道中的有害物質(zhì)并促進(jìn)其排出體外，因此其吸附性能值得進(jìn)一步研究。

a-持水力和膨脹力；b-陽離子交換能力圖1 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉的理化性質(zhì)Fig.1 The physicochemical property of crude and superfine powder of Eucheuma sp.residue注：相同指標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 麒麟菜殘渣的亞硝酸鈉吸附能力和亞硝化反應(yīng)抑制作用

首先測定了亞硝酸鈉顯色反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以亞硝酸鈉的質(zhì)量(μg)和538 nm下的吸光度(A538)分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，得出相應(yīng)的回歸方程：y=0.029 1x+0.000 6，R2=0.999 8，表明在0.0～12.5 μg亞硝酸鈉的質(zhì)量(μg)與吸光度(A538)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1 麒麟菜殘渣的亞硝酸鈉吸附能力和亞硝胺合成阻斷能力

麒麟菜殘渣在模擬胃液中具有較強(qiáng)的吸附率和阻斷率，這是由于在酸性條件下，酸性基團(tuán)會發(fā)生解離，這更有利于吸附的進(jìn)行。如圖2所示，吸附率和阻斷率隨著目數(shù)增加總體上呈遞增趨勢。E200的亞硝酸鈉吸附率最高，為(92.3±1.30)%，其次是E150，為(91.3±0.65)%，其他粒度樣品的吸附率為80%左右。E300對亞硝胺合成的阻斷率最高，為(65.2±2.1)%，其次是EC，為(63.4±4.7)%，其他粒度樣品的阻斷率為60%左右。結(jié)果表明麒麟菜殘渣可以有效吸附亞硝酸鈉并阻斷亞硝胺的合成，并且它對亞硝胺合成的阻斷率比對亞硝酸鈉的吸附率低，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[14-16]。

圖2 麒麟菜殘渣粗粉和超微粉的亞硝酸鈉吸附率 和亞硝胺合成阻斷率Fig.2 The adsorption rate of sodium nitrite and blocking rate of nitrosamine synthesis by crude and superfine powder of Eucheuma sp.residue

來思彤等[17]研究了依次為0.200～0.250、0.160～0.200、0.125～0.160、0.080～0.125、0.063～0.080 mm的5種不同區(qū)間粒度紫花苜蓿上部葉皮顆粒對亞硝酸鈉的吸附能力，發(fā)現(xiàn)隨著粒度減小，對亞硝酸鈉的吸附能力依次增強(qiáng)。而本研究中亞硝酸鈉吸附率最高的是150和200目麒麟菜殘渣超微粉，與紫花苜蓿吸附率最高時的粒度最為接近。因?yàn)轺梓氩藲堅膩喯跛徕c吸附效果極佳，所以選擇吸附效果最好的E200對其吸附亞硝酸鈉的影響因素進(jìn)行下一步探討。

2.2.2 麒麟菜殘渣劑量對亞硝酸鈉吸附率的影響

吸附劑的用量會改變吸附亞硝酸鈉活性位點(diǎn)的數(shù)量，對吸附過程有很大的影響。如圖3所示，當(dāng)麒麟菜殘渣濃度較低時，它的劑量與吸附率之間呈顯著的量效關(guān)系，表現(xiàn)為麒麟菜殘渣濃度增大后吸附率迅速升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，對亞硝酸鈉的吸附率可達(dá)(94.6±0.3)%，之后隨麒麟菜殘渣濃度增加，吸附率增加的程度逐漸變小，趨于飽和，最高可達(dá)(97.7±0.2)%。兩者之間符合良好的對數(shù)曲線關(guān)系，經(jīng)擬合得到方程：y=12.899 lnx+51.785，R2=0.977 8。麒麟菜殘渣對亞硝酸鹽達(dá)到半數(shù)吸附率所需濃度IC50為0.87 mg/mL。蘇學(xué)軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草提取物對亞硝酸鈉吸附率隨劑量增加呈對數(shù)增長，IC50為2.35 mg/mL。本研究中麒麟菜殘渣超微粉對亞硝酸鈉的吸附率也隨劑量增加而呈對數(shù)增加，IC50為0.87 mg/mL，表明麒麟菜殘渣超微粉具有明顯優(yōu)于仙鶴草提取物的亞硝酸鈉吸附能力。

圖3 E200質(zhì)量濃度對亞硝酸鈉吸附率的影響Fig.3 Effect of E200 dosage on adsorption rate of sodium nitrite

2.2.3 亞硝酸鈉初始濃度的影響

為探究亞硝酸鈉初始濃度(c0)對E200吸附亞硝酸鈉的影響，選用2～400 μg/mL的亞硝酸鈉溶液并研究了吸附等溫線。由圖4可知，E200的吸附量(qe)與亞硝酸鈉初始濃度成正比例關(guān)系。隨著亞硝酸鈉初始濃度的增加，E200對亞硝酸鈉的吸附量從(0.080±0.010)線性增加到(18.376±0.066) mg/g，說明在亞硝酸鈉濃度較高的情況下麒麟菜殘渣仍可以有效地吸附亞硝酸鈉。ZHU等[4]研究了超微粉碎后的青稞麩皮膳食纖維的亞硝酸鈉吸附量為(0.674±0.014) mg/g，遠(yuǎn)低于本研究的麒麟菜殘渣的亞硝酸鈉吸附量。

圖4 亞硝酸鈉初始濃度對E200吸附亞硝酸鈉的影響Fig.4 Effect of sodium nitrite initial concentration on sodium nitrite adsorption by E200

分別使用公式(3)、公式(4)對吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行Langmuir和Freundlich等溫模型的線性回歸擬合。

(3)

(4)

式中：kL(L/mg)和kf(mg/g)(L/mg)1/n分別為Langmuir常數(shù)和Freundlich常數(shù)，kf越大，吸附能力越大，kL越大，說明麒麟菜殘渣和亞硝酸鈉之間的相互作用越大。qm為最大吸附量，mg/g;1/n,吸附位點(diǎn)的異質(zhì)性;ce，平衡時亞硝酸鈉的濃度，mg/L。

擬合后的方程如公式(5)、公式(6)所示，麒麟菜殘渣吸附數(shù)據(jù)與Freundlich模型(R2=0.992 6)擬合的效果優(yōu)于Langmuir模型(R2=0.975 4)，F(xiàn)reundlich模型的1/n為1.214 6，表明麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉的吸附是一個協(xié)同吸附過程。

(5)

lnqe=1.214 6 lnce-1.562 7

(6)

2.2.4 吸附時間的影響

為了解麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉吸附達(dá)到平衡所需的時間，分別測定了E200(添加量為20 mg/mL)在模擬胃液條件下吸附亞硝酸鈉5～270 min的吸附量，結(jié)果如圖5所示。E200對亞硝酸鈉的吸附率隨時間的延長而快速上升，吸附5 min時，吸附率為(70.0±0.4)%。當(dāng)處理時間延長至180 min時，吸附率明顯上升，達(dá)到(87.2±1.0)%，處理時間為240 min時，吸附率升至(93.1±0.7)%，繼續(xù)延長處理時間，吸附率不再上升，反而略有下降，說明在一定時間內(nèi)麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉的吸附效果與處理時間呈正相關(guān)。樊琛等[19]研究了蘆薈凝膠在0～4 h下對亞硝酸鈉的吸附率，發(fā)現(xiàn)1 h內(nèi)吸附率快速增加到34.7%，隨后吸附率的增加減緩并最終穩(wěn)定在48%左右。而本研究中麒麟菜殘渣超微粉E200在5 min時就可以吸附70.0%的亞硝酸鈉，之后上升較慢，在4 h達(dá)到平衡，平衡時可以吸附93.1%的亞硝酸鈉。

圖5 吸附時間對E200吸附亞硝酸鈉的影響Fig.5 Effect of adsorption time on sodium nitrite adsorption by E200

為了更深入地了解吸附特性，利用公式(5)、公式(6)將吸附反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)擬合到準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動力學(xué)反應(yīng)模型中，如公式(7)、公式(8)所示。

(7)

(8)

式中：k1為準(zhǔn)一級反應(yīng)速率常數(shù)，k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)模型速率常數(shù)，qt，“t”時刻吸附亞硝酸鈉的量，mg/g；qe，平衡時吸附亞硝酸鈉的量。

擬合后的方程如公式(9)、公式(10)所示，麒麟菜殘渣對亞硝酸鈉的吸附在準(zhǔn)二級動力學(xué)模型上的擬合效果(R2=0.996 3)優(yōu)于準(zhǔn)一級動力學(xué)模型(R2=0.930 8)，說明可能發(fā)生化學(xué)吸附。本研究中麒麟菜殘渣超微粉對亞硝酸鈉的吸附與宋娟等[20]對殼聚糖質(zhì)活性炭吸附亞硝酸鈉擬合的結(jié)果一致，均符合Freundlich等溫線模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型。

ln(qe-qt)=-0.006 8t-3.128 7

(9)

(10)

3 結(jié)論

麒麟菜殘渣超微粉在模擬人體胃液下具有較強(qiáng)的亞硝酸鈉吸附能力，其中E200的吸附效果最好。E200在5 min就可以吸附約70.0%的亞硝酸鈉，之后上升較慢，在4 h達(dá)到吸附平衡，平衡時可以吸附約93%的亞硝酸鈉。此外，吸附率隨麒麟菜殘渣超微粉劑量增加而呈對數(shù)增加，吸附一半亞硝酸鈉的E200劑量為0.87 mg/mL；吸附率隨亞硝酸鈉濃度線性增加，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)吸附率最高可達(dá)(18.376±0.066) mg/g；麒麟菜殘渣超微粉對亞硝酸鈉的吸附可能是化學(xué)吸附；麒麟菜殘渣具有約65%的亞硝胺合成阻斷率。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明麒麟菜殘渣可有效降低模擬胃液內(nèi)亞硝酸鈉的濃度，預(yù)防由亞硝酸鈉引起的癌癥，并且麒麟菜殘渣超微粉的吸水膨脹性能達(dá)到商業(yè)膳食纖維的標(biāo)準(zhǔn)，可加快腸道蠕動，從而促進(jìn)亞硝酸鈉的排出。這不僅可以緩解亞硝酸鈉帶來的危害，而且為麒麟菜提膠殘渣開辟了新用途，有助于其資源的再利用和附加值的提升。然而本文對麒麟菜殘渣中主要發(fā)揮吸附和阻斷作用的組成還不清晰，還需要分離提取纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)來做進(jìn)一步的研究。