范曉凡, 劉 勇, 譚新球，張戰(zhàn)泓, 張 卓, 史曉斌,*, 張德詠,*

(1. 湖南大學研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2. 湖南省農業(yè)科學院植物保護研究所, 長沙 410125;3. 湖南省農業(yè)科學院蔬菜研究所, 長沙 410125)

根據國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)最新發(fā)現(xiàn)，自然界中存在9 110種病毒，其中全球目前已報道的植物病毒約2 129種，許多植物病毒能夠專一性地感染農作物，對農林生產造成了嚴重的損失。由于植物細胞壁屏障的存在，病毒無法直接感染植物，只能依賴于昆蟲介體的行為來實現(xiàn)其在宿主間的傳播(Whitfield and Rotenberg, 2015; 關桂靜等, 2017)。病毒對于昆蟲的影響可以分為直接影響和間接影響，前者是病毒與媒介結合后對介體昆蟲生理生化和行為的影響(施艷等, 2013; Blanc and Michalakis, 2016)，如:水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)可以提高黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps的存活率和產卵量，并促進種群的增長(王前進等, 2018);番茄黃化葉曲病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)可以促進煙粉虱Bemisiatabaci的取食行為，增加刺探與取食頻率(Jahanetal., 2014)，從而促進病毒的傳播。后者是指病毒的侵染可觸發(fā)寄主植物的應激反應，進而在一定程度上影響介體昆蟲，以此改變介體昆蟲的生態(tài)適應性,如:蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus, TuMV)可以導致植物胼胝質沉積堵塞篩管的能力下降，從而有利于綠色桃蚜Myzuspersicae繁殖(Casteeletal., 2015);蘋果感染植原體CandidatusPhytoplasmamali后釋放大量的石竹烯，更容易吸引木虱(Mayeretal., 2008)。病毒依賴介體昆蟲進行傳播，病毒對植物的侵染又可以對介體昆蟲產生影響，因此在植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者間形成了復雜的互作關系，其中寄主植物介導介體昆蟲與病毒的互作可能是決定田間病害流行的重要原因(Stoutetal., 2006)。

番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)最早在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)，感病植株癥狀表現(xiàn)為葉脈間的褪綠黃化，葉緣卷曲，首先于下部葉片觀察到癥狀。發(fā)病嚴重時，整棵植株死亡，果實受到嚴重影響(Wintermantel and Wisler, 2006)。ToCV是一種韌皮部限制病毒，主要通過介體昆蟲煙粉虱以半持久非循環(huán)方式傳播(Polstonetal., 2014)，其寄主范圍非常廣泛，包括25科85種雙子葉植物，其中包括非常重要的經濟作物番茄、南瓜、辣椒等(Fiallo-Olivé and Navas-Castillo， 2019)。由于MED煙粉虱的適應性能強、寄主范圍廣、繁殖能力強，現(xiàn)已在全球范圍內分布廣泛，對全世界的農林經濟作物生產造成了嚴重的影響(Fontetal., 2004)。目前關于ToCV的分子特征，煙粉虱傳播ToCV的方式與特性已經做了充分的報道(Shietal., 2018; Weietal., 2019)，研究表明MED煙粉虱具有較強的獲毒和傳毒能力，但是對于ToCV暴發(fā)流行的原因尚不清楚，在煙粉虱攜帶病毒后，病毒對煙粉虱在不同寄主植物上的寄主選擇性和取食行為的影響仍缺乏研究。

為此，本研究將通過Y型嗅覺儀探究攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱對于ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆以及ToCV非寄主棉花的選擇趨向性差異，利用EPG技術比較攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱在4種植物上的取食行為，揭示煙粉虱攜帶ToCV后在不同寄主植物間的選擇和取食行為差異，為深入研究煙粉虱-寄主植物-病毒三者間的相互關系奠定基礎，也為有效控制ToCV的傳播提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試蟲源：MED煙粉虱，由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所張友軍研究員課題組饋贈。MED煙粉虱種群長期飼養(yǎng)在溫度25～28℃、相對濕度60%～80%、光周期16L∶8D的溫室內，以棉花為寄主繼代飼養(yǎng)。將初羽化的MED煙粉虱用微蟲籠夾至感染ToCV的番茄上獲毒48 h，獲得攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲。

1.1.2供試毒源：單獨侵染ToCV(GenBank登錄號: KC887999.1)的番茄采自山東壽光，并且經過PCR以及小RNA測序檢測無其他病毒復合侵染。將毒株移栽至湖南省農業(yè)科學院植物保護研究所溫室，在不同隔間中單獨培養(yǎng)，分別采用蟲傳的方法獲取毒株。

1.1.3供試植物：茄科植物：番茄Lycopersiconesculentum(鉆紅美娜)、辣椒Capsicumannuum(新選益都紅)；豆科植物：豇豆Vignaunguiculata(盈豇888)；錦葵科植物：棉花Gossypiumspp. (中棉所63)。 將供試種子播種于育苗盆中，放至于溫度26±1℃、相對濕度60%～80%、光周期14L∶10D的溫室內培育至發(fā)芽，隨后將發(fā)芽的植株移栽到花盆中進行培養(yǎng)。花盆均用100目紗網封蓋，避免煙粉虱及其他害蟲污染寄主植物，保證植株的健康生長。

1.2 MED煙粉虱雌成蟲對寄主植物選擇行為的生物測定

用Y型嗅覺儀測定MED煙粉虱雌成蟲對4種植物的趨性行為反應，將處于同一長勢的棉花、番茄、豆角和辣椒分別放入4個味源瓶中，兩兩進行組合，每個玻璃臂通過硅膠管分別與氣體流量計、味源瓶、活性碳、空氣泵相連。打開氣閥通氣4 h后，取饑餓處理2 h的100頭未攜帶ToCV煙粉虱成蟲，將其引入Y型管的管柄中，用錫箔紙蓋住進行避光處理，控制管中氣體流速在400 mL/min，每30 min觀察一次。煙粉虱進入Y型管管柄2/3處可視為選擇，待2/3的煙粉虱選擇完畢后，記錄兩個管柄內做出選擇的煙粉虱數量。同時，取100頭飼毒48 h的煙粉虱成蟲，將其引入Y型管的管柄中，按以上方法測試攜帶ToCV煙粉虱對4種植物的取食偏好性。每次測定后需更換Y型管，消除誤差，實驗重復6次。實驗在平均溫度為(25±1)℃，相對濕度60%～80%的安靜房間中進行。

1.3 EPG技術分析MED煙粉虱雌成蟲在4種寄主植物上的取食行為

利用DC-EPG Giga-8(荷蘭瓦赫寧根大學)刺吸電位技術監(jiān)測攜帶和未攜帶ToCV煙粉虱口針在健康的ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆與ToCV非寄主棉花上的取食行為差異。將初羽化2-5 d的供試煙粉虱雌成蟲饑餓處理2 h后，將其放置于生物冰袋上短暫麻醉后迅速將一段2～3 cm、直徑12.5 μm的金絲一端粘連在煙粉虱的前胸背板上，另一端與EPG工作傳感器的銅線粘連，同時將植物電極插入植株生長的土壤中。當煙粉虱口針刺入植株組織時，回路接通，電流信號經電流放大器放大后，由轉換器將其轉換成數字信號，再由STYLET軟件(荷蘭瓦赫寧根大學)記錄并以波形數據的形式儲存在計算機中。每頭煙粉虱記錄8 h，每次記錄結束后，更換新的植物和煙粉虱。攜帶ToCV和煙粉虱對于番茄、辣椒和豇豆以及棉花的取食行為各測定15頭成蟲。實驗在平均溫度25±1℃，相對濕度60%～80%的安靜房間中進行。

1.4 數據分析

應用統(tǒng)計軟件為SPSS16.0。采用單因素ANOVA比較分析攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱對4種健康寄主植物的選擇偏好性；繪圖采用SigmaPlot 12.0。

EPG數據記錄和波形識別使用EPG style+a與EPG style+d軟件(Giga-8 DC-EPG系統(tǒng)，荷蘭瓦赫寧根大學)，根據湯清波等(2011)標準對np, C, pd, E1, E2和G波6種波形進行歸納統(tǒng)計；分析前先檢測數據的方差齊性和正態(tài)性，若符合正態(tài)分布，則采用T檢驗比較分析攜帶和未攜帶ToCV煙粉虱的取食差異；不符合正態(tài)分布的數據用log10轉換。

2 結果

2.1 ToCV對MED煙粉虱雌成蟲寄主選擇行為的影響

通過Y型嗅覺儀對煙粉虱雌成蟲的寄主選擇行為進行測定，所得結果如圖1。對于未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲，辣椒和番茄的引誘力最強；其次是棉花；豇豆的吸引力最弱。當煙粉虱成蟲攜帶了ToCV，再對這4種植物進行選擇時，選擇番茄、辣椒的煙粉虱數量仍然是最多的，豇豆對其吸引力仍然是最弱的；但是與未攜帶ToCV的煙粉虱(對照)相比，攜帶ToCV的煙粉虱對番茄、辣椒分別與其他植株進行選擇時，選擇最喜愛的番茄與辣椒的煙粉虱數量顯著減少(P<0.05)；對棉花與番茄、辣椒分別進行選擇時，選擇棉花的煙粉虱的數量沒有顯著變化(P>0.05)；對棉花和豇豆進行選擇時，選擇棉花的煙粉虱的數量出現(xiàn)顯著減少(P<0.05)；對豇豆與番茄、辣椒進行選擇時，選擇豇豆的煙粉虱的數量沒有顯著變化(P>0.05)；對豇豆與棉花進行選擇時，選擇豇豆的煙粉虱的數量出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。

圖1 攜帶ToCV和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲對4種寄主植物的選擇

2.2 攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲取食行為的變化

2.2.1在ToCV寄主上取食行為的變化：在ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲非韌皮部取食行為EPG實驗結果如表1, 3和5。攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在番茄、辣椒和豇豆上的總刺探次數顯著高于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，但是總刺探時間顯著短于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，C波(非韌皮部取食)總時間均無顯著差異(P>0.05)，而攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲第1次刺探到第1次E波(韌皮部取食)出現(xiàn)時間在三者上都有明顯的推遲，顯著晚于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)；但是攜帶ToCV的煙粉虱與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲相比在番茄和豇豆上的第1次刺探發(fā)生時間顯著提前，而在辣椒上的第1次刺探發(fā)生時間無顯著差異(P>0.05)。攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲對番茄、辣椒和豇豆的韌皮部的取食行為EPG實驗結果如表2, 4和6。攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲在番茄、 辣椒和豇豆上的E1波 (韌皮部分泌唾液)總時間、 E1波數量、 E1波平均時間、E2波數量與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲相比均無顯著差異(P>0.05)，但是攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲的E2波(韌皮部吸食汁液)總時間與未攜帶ToCV的煙粉虱相比顯著減少(P<0.05)，E波潛在指數也顯著降低(P<0.05)；而攜帶和未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在番茄和豇豆上的E2波平均時間無顯著差異(P>0.05)，在辣椒上的出現(xiàn)了顯著的減少(P<0.05)。

表1 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的 MED煙粉虱雌成蟲在番茄植株上取食的非韌皮部的EPG參數

表2 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在番茄植株上取食的韌皮部的EPG參數

表3 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在辣椒植株上取食的非韌皮部的EPG參數

表4 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在辣椒植株上取食的韌皮部的EPG參數

表5 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在豇豆植株上取食的非韌皮部的EPG參數

表6 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在豇豆植株上取食的韌皮部的EPG參數

2.2.2在ToCV非寄主上取食行為的變化：在ToCV非寄主棉花上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲非韌皮部取食行為EPG實驗結果如表7。攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在棉花上的總刺探次數顯著高于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，總刺探時間顯著短于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，而C波總時間在兩者間均無明顯差異(P>0.05)，攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲第1次刺探到第1次E波出現(xiàn)時間都存在明顯的推遲，顯著晚于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)；對于第1次刺探發(fā)生時間，攜帶ToCV的煙粉虱與未攜帶ToCV的煙粉虱相比在棉花上則沒有顯著差異(P>0.05)。在ToCV非寄主棉花上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲的韌皮部的取食行為EPG實驗結果如表8。攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲在棉花上的E1波總時間、E1波數量、E1波平均時間、E2波數量與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲均無顯著差異(P>0.05)，但是攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲的E2波總時間和平均時間與未攜帶ToCV的煙粉虱相比都顯著減少(P<0.05)，E波潛在指數也均顯著降低(P<0.05)。

表7 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在棉花植株上取食的非韌皮部的EPG參數

表8 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在棉花植株上取食的韌皮部EPG參數

3 討論

ToCV是一種在全球范圍內引起嚴重作物病害的植物病毒，它的傳播依賴于昆蟲介體煙粉虱。傳播病毒的過程分為獲毒、持毒和傳毒3個過程(史曉斌等, 2012)，當介體昆蟲獲取了一定量的病毒粒子后，它必須將病毒粒子轉移到新的寄主上才能完成傳毒，完成病毒在未被侵染寄主間的擴散。因此，介體昆蟲對寄主的選擇行為變化直接影響著病毒的傳播，直接關系到病毒最終的擴散范圍(Gandon, 2018)。大量研究表明，無毒的介體昆蟲與攜帶病毒的介體昆蟲在對于健康植株和感病植株選擇中存在明顯的差異，通常表現(xiàn)為無毒的介體昆蟲趨向于選擇帶毒植株，而帶毒的介體昆蟲則趨向于選擇健康植株或者沒有明確趨向(Eigenbrodeetal., 2018)，這種趨性的改變將擴大寄主的范圍，加劇病毒的傳播。如有研究發(fā)現(xiàn)植物病毒能夠通過一種類似炎癥的免疫信號，級聯(lián)激發(fā)介體昆蟲煙粉虱腦部產生Caspase依賴的凋亡性神經退行，削弱其嗅覺和視覺的辨別能力，增強了帶毒昆蟲對于健康寄主的趨向，有利于病毒的傳播(Wangetal., 2020)。本研究結果發(fā)現(xiàn)當煙粉虱雌成蟲未攜帶ToCV時，它對于番茄和辣椒的選擇性最強，這是由于番茄和辣椒的揮發(fā)物中存在吸引煙粉虱的物質。當煙粉虱雌成蟲攜帶了ToCV時，病毒會影響煙粉虱對外界信息的辨別能力，因此它對于喜食的番茄、辣椒趨向性減弱，這將促有助于煙粉虱盡快轉移寄主，將病毒傳播出去。同時，本研究結果(圖1)表明，病毒侵染可以增強煙粉虱對本來具有弱選擇性的ToCV寄主豇豆的選擇，這將導致煙粉虱定殖的隨機性增大，從而增加了病毒在植物間的擴散機會；通過間種煙粉虱非嗜好植物來對其進行驅避的作用也會大大降低，增加了煙粉虱與病毒在田間流行的幾率。

介體昆蟲的取食行為直接影響著病毒的獲取與傳播，因此病毒對于介體昆蟲取食行為的影響直接決定著病毒傳播的效率。對于ToCV這種非循環(huán)性病毒而言，介體昆蟲的獲毒與傳毒過程均在較短時間內完成，因此刺探取食次數的增加、頻繁地更換取食位點和寄主轉移對于它來說更為有利和高效(Maucketal., 2016; 王世藩等, 2020)。Moreno-Delafuente等(2013)發(fā)現(xiàn)TYLCV可以通過操控煙粉虱的行為來促進自己的傳播，如影響煙粉虱對于寄主的選擇，加強煙粉虱的刺探及取食行為；Wang等(2015)對蚜蟲唾液中的血管緊張肽轉化酶(angiotensin-converting enzymes, ACEs)進行研究發(fā)現(xiàn)，ACE1基因和ACE2基因的同時敲除會增強蚜蟲取食能力，它能夠很快地刺探到寄主的韌皮部；周涵宇等(2018)發(fā)現(xiàn)將褐飛虱Nilapawatalugens相關的唾液蛋白基因干擾后，在取食水稻的6 h內，褐飛虱韌皮部取食的時間明顯縮短，部分干擾目的基因后的褐飛虱無法成功取食到韌皮部，這說明當病毒侵染介體昆蟲時，可能是通過抑制或者促進了某些基因的表達，從而對介體昆蟲的取食行為造成影響。

本研究通過EPG測定發(fā)現(xiàn)攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲與未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲相比，在ToCV寄主番茄、辣椒、豇豆與ToCV非寄主棉花上刺探取食的總刺探次數顯著增多；同時，第1次刺探到韌皮部的時間顯著推遲，對韌皮部吸食汁液的時間(E2波總時間)與總刺探時間顯著減少(表1～8)。盡管有研究表明，金絲的存在會影響煙粉虱的取食行為，12.5 μm的金絲與5 μm的鉑絲相比，金絲的存在會顯著增加煙粉虱的刺探次數，減少對韌皮部的取食時間(Chesnais and Mauck, 2018)，但是本研究所有的處理均采用粗細一致的金絲，意在探究ToCV病毒對于煙粉虱取食行為的影響，在分析時可以忽略金絲對于煙粉虱取食的影響。結果中在ToCV寄主上刺探次數的增加表明帶毒煙粉虱在到達植物皮部取食過程中可能會遇到更多阻礙，從而需要更多的刺探嘗試，這會提高病毒的傳播效率；而韌皮部分泌唾液時間的推遲與取食時間減少也可能促使煙粉虱對現(xiàn)有寄主的取食情況感到不滿足，從而促使它反復尋找新的宿主，這有利于病毒的傳播與流行。在ToCV非寄主上取食行為的變化與在ToCV寄主上的一致，說明病毒是直接影響了煙粉虱從而導致取食行為發(fā)生了變化，通過影響介體昆蟲、操控它的取食行為來促進自身的傳播。而在這4種不同的寄主植物上，煙粉虱攜帶病毒前后的第一次刺探開始的時間變化并不一致，這說明第一次刺探時間可能還會受寄主植物的葉片結構影響，導致有些刺探時間明顯提前，而有些顯著推后。無論病毒對介體昆蟲的直接、間接的影響都是來促進自身的傳播的，若能夠掌握昆蟲體內病毒受體的特性，研究出能夠阻礙受體與病毒的結合的物質，這將對控制病毒的傳播有重大意義。