于明華，范晨昕，馬 烈，郄紅麗，王化坤

（1.蘇州市園藝站，江蘇 蘇州 215128；2.蘇州市吳江區(qū)林業(yè)站，江蘇 蘇州 215202；3.江蘇省太湖常綠果樹技術(shù)推廣中心，江蘇 蘇州 215107）

植物經(jīng)常遭受到不同的非生物脅迫，比如干旱、極端溫度、營養(yǎng)缺乏、鹽漬化、重金屬殘留等，對植物的生長發(fā)育及分布造成較大影響．據(jù)報(bào)道，植物會通過生理和代謝過程、分子改變來應(yīng)對和適應(yīng)不利的環(huán)境因素[1]．值得一提的是，以果實(shí)為主要產(chǎn)出的果樹在生長過程中的逆境脅迫下會直接影響到果實(shí)的生長及品質(zhì)．每年秋季的霜凍、冬季的冰凍和初春的倒春寒引起的花果凍害，嚴(yán)重影響果樹的生長發(fā)育，制約果樹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展．

枇杷（Eriobotrya japonicaL.）是起源于我國的特色高效果樹，又是優(yōu)良的冬季觀花觀果常綠綠化樹，其花、果、葉均可入藥，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高．但冬季的嚴(yán)寒會導(dǎo)致果實(shí)、枝葉甚至樹體受凍，從而限制其樹種的分布和利用[2]．近年來，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)的發(fā)展為全面量化低溫脅迫相關(guān)響應(yīng)基因的表達(dá)，分析其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制以及挖掘重要功能基因提供了重要手段．但枇杷防寒研究多集中于生理生化、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、影響果實(shí)凍害因素等方面，分子方面只進(jìn)行了一些抗寒有關(guān)基因的克隆工作[3]，還無法從分子層面說明其抗寒機(jī)理，嚴(yán)重滯后于模式植物．此外，目前果樹抗寒分子機(jī)理研究只有單一樹種的報(bào)道，內(nèi)容也只限于抗寒相關(guān)基因的克隆和分析．在低溫條件下，不同種類果樹的主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptional factors，TFs）是否存在特異，其調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的機(jī)理及過程是否相同，還沒有相應(yīng)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析．

基于此，本文將低溫誘導(dǎo)下枇杷葉片轉(zhuǎn)錄組分析序列數(shù)據(jù)進(jìn)行在線TFs分析，并與其他現(xiàn)有果樹TFs進(jìn)行綜合對比，找出果樹轉(zhuǎn)錄因子在不同果樹上的分布規(guī)律，從而探討枇杷低溫反應(yīng)的分子機(jī)制，為枇杷的抗寒基礎(chǔ)研究和防寒技術(shù)研究提供重要依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 植物材料

一年生“冠玉”枇杷嫁接苗取自江蘇省太湖常綠果樹技術(shù)推廣中心枇杷種質(zhì)資源圃，江蘇省蘇州市（32°03′N，124°24′E）．

1.2 TFs分析

枇杷葉片在4 ℃條件下處理4 h，通過RNA-Seq獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]．將獲得的122 081個基因序列數(shù)據(jù)輸入plantTFcat網(wǎng)站（http://plantgrn.noble.org/PlantTFcat/）進(jìn)行在線TFs分析．下載網(wǎng)站中所有12類果樹轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)，并以擬南芥作為對照，使用Excel 軟件（Microsoft office 2013）對轉(zhuǎn)錄因子的分類、數(shù)量、比例等進(jìn)行匯總分析．

1.3 CBF基因的實(shí)時定量RT-PCR分析

在 4 ℃條件下分別在 0（CK），0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 采集枇杷葉片組織，用于提取RNA并進(jìn)行CBF基因的實(shí)時熒光定量RT-PCR分析，設(shè)置3個重復(fù)．應(yīng)用TIANGEN快速試劑盒和20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行mRNA的分離，反轉(zhuǎn)錄成cDNA．然后稀釋10倍，取1 μL作為實(shí)時定量RT-PCR的模板．基于EjCBF3和EjCBF4的序列，應(yīng)用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)引物（表1）．實(shí)時定量RT-PCR反應(yīng)體系20 μL，10 μL iTaq Universal SYBR Green 混合物，0.4 μL 正反引物．反應(yīng)程序如下：退火 94 ℃ 4 min，然后 40 個循環(huán)（94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 43 s）．應(yīng)用ABI7300軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．

表1 枇杷實(shí)時定量RT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷TFs分析

在122 081個基因中檢測出1 308個TFs基因，共分為53類，其中數(shù)量在20個以上的有23類（表2），小計(jì)1 073個，占所有轉(zhuǎn)錄因子的82.03%．?dāng)?shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子是bHLH基因家族，共有96個，占總數(shù)的7.34%；次之為NAC基因家族（87個，6.65%）、ERF基因家族（AP2-EREBP，85個，6.5%）、C2H2基因家族（80個，6.12%）、C3H基因家族（75個，5.73%）、MYB_related基因家族（65個，4.97%）、bZIP基因家族（65個，4.97%）、G2-like基因家族（GARP-G2-like，57 個，4.36%）、WRKY基因家族（55 個，4.2%）等，數(shù)量均超過50個．這說明枇杷在冷處理下，反應(yīng)過程很復(fù)雜，很多種類的TFs都參與了反應(yīng)過程，并且誘發(fā)了更多的功能基因，這有助于枇杷冷馴化能力的提高．

表2 枇杷TFs匯總

2.2 枇杷TFs基因的表達(dá)分析

除TFs的家族類別及檢測到的數(shù)量外，具體TFs的表達(dá)量也與枇杷抗寒機(jī)理直接相關(guān)．對比所有TFs的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，按相對表達(dá)量的大小降序排列所有正向表達(dá)的TFs，其中排在前10位的TFs如表3所示．可以看出，CL3864.Contig1_All、CL1945.Contig8_All、CL8139.Contig4_All、CL8139.Contig1_All等 4 個基因都屬于CBF（C-repeat binding transcription factor）基因家族，它們在正常情況下不表達(dá)，在冷脅迫后特異性表達(dá)．除此之外，相對表達(dá)量最高的Unigene60904_All也屬于CBF基因家族．這說明在冷脅迫下，CBF基因發(fā)揮了十分重要的調(diào)控作用[5]，與葡萄[6]、柑橘[7]等果樹的冷脅迫結(jié)果一致，進(jìn)一步證明CBF基因在植物冷反應(yīng)荷爾蒙信號途徑中的特殊作用．

表3 上調(diào)表達(dá)前10位TFs

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選取列表中相對表達(dá)量最高的Unigene60904_All基因和特異表達(dá)第1位的CL3864.Contig1_All基因，編號為EjCBF3和EjCBF4，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR分析．我們發(fā)現(xiàn)EjCBF3和EjCBF4在4 ℃處理不同時間后的基因表達(dá)趨勢基本一致（圖1），但EjCBF4比EjCBF3啟動快，表達(dá)水平更高，這可能與EjCBF4的特異表達(dá)有關(guān)．

圖1 EjCBF3和EjCBF4在枇杷4 ℃處理后的相對基因表達(dá)

2.3 不同種類果樹的TFs數(shù)量比較

13類果樹和擬南芥的TFs總數(shù)為27 097個，平均 1 936個．不同果樹TFs數(shù)量差別很大，其中蘋果最多為3 119個；次之為桃、梨、擬南芥、獼猴桃、棗等，數(shù)量均超過2 000個；草莓最少，為1 250個．枇杷的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量也較少，僅為1 308個（表4）．這種數(shù)量的不同可能與樹種、材料以及不同的處理方法有關(guān)．

表4 14種植物TFs匯總

表4 14種植物TFs匯總（續(xù)）

2.4 13類果樹TFs類別情況分析

13類果樹和擬南芥共有58類TFs，其中前10位的分別為bHLH、MYB、ERF、NAC、C2H2（Cys2His2 -type zinc fingers）、MYB_related、bZIP、WRKY、C3H（CCCH zinc finger proteins）、GRAS共 14 633 個，占 TFs總數(shù)的 54%（表4）．表5列出了14類植物的前10位TFs，其中bHLH、ERF、NAC、C2H2、MYB_related這5類TFs均出現(xiàn)在14類植物的前10位TFs中．MYB不是枇杷的TOP10 TFs，bZIP不是草莓的TOP10 TFs，WRKY不是桃的TOP10 TFs．C3H存在于枇杷、獼猴桃、蘋果、桃、棗、柑橘、葡萄7種果樹的TOP10 TFs列表中，而GRAS只存在于枇杷、草莓、核桃和蘋果4種果樹TOP10 TFs中（表5）．

表5 14種植物主要轉(zhuǎn)錄因子類別

表5 14種植物主要轉(zhuǎn)錄因子類別（續(xù)）

同一轉(zhuǎn)錄因子在不同樹種間數(shù)量差別較大，其中M-type_MADS、MYB、bHLH、NAC等極差數(shù)量均在 180個以上，ERF、B3（B3-Domain）、FAR1、bZIP差別100個以上，其他C2H2、MYB_related、WRKY、C3H、GRAS差別在90個以上（見表4）．說明不同植物間特異性差異明顯，其基因調(diào)控機(jī)制也可能有差別．

在 58類 TFs中，RAV（Related to ABI3 / VP1）、VOZ（Vascular plant One Zinc finger protein）、S1Fa-like、HRT-like、SAP、LFY、NZZ/SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）、STAT（Signal transducer and activator of transcription）等8類在不同果樹間存在缺失，HRT-like、SAP、STAT在2個樹種同時缺失，其他5類只在1個樹種缺失．其中枇杷缺失了5個（RAV、SAP、LFY、NZZ/SPL、STAT），核桃缺失了4個（VOZ、HRT-like、SAP、STAT），板栗（S1Fa-like）和梨（HRT-like）各缺失了 1 個．

3 討論

3.1 TFs在植物逆境中起到較大作用

TFs在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，特別是在應(yīng)對生物和非生物脅迫中起著關(guān)鍵性作用．自1987年P(guān)az-Ares首次報(bào)道玉米TFs基因的克隆以來，相繼從高等植物中分離出了數(shù)百種調(diào)控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)及生長發(fā)育等相關(guān)基因表達(dá)的TFs．TFs在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中是一個非常關(guān)鍵的因素，在脅迫刺激下它們能不斷合成，并將信號傳遞放大，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而引起植物生理生化的改變，以應(yīng)對逆境對植物的不利影響[8]．植物主要的冷脅迫反應(yīng)途徑是ABA依賴和ABA獨(dú)立信號傳導(dǎo)途徑．TFs和他們的特異性相互作用在分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起到重要的作用[9]．本文從枇杷4 ℃處理4 h的葉片轉(zhuǎn)錄組122 081個基因中檢測出53類、1 308個TFs．說明在冷處理下，TFs發(fā)生了較快、較大的變化，從而積極調(diào)控下游基因的表達(dá)．

3.2 TFs物種間差異大

本文13個果樹的TFs種類最多的為58類，最少為53類．?dāng)?shù)量最多的蘋果為3 119個，草莓最少為1 250個，枇杷也較少，僅為1 308個．不同植物間主要的TFs家族不同，在前10類轉(zhuǎn)錄因子中，bHLH、ERF、NAC、C2H2、MYB_related5類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于所有的14類植物中．

不同植物間轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量和類別差異很大，原因主要與物種本身有關(guān)，其中基因組大小、處理?xiàng)l件不同、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾、調(diào)節(jié)等因素是主要原因．

3.3 枇杷冷脅迫反應(yīng)原理

從13類果樹TFs數(shù)量及枇杷冷脅迫反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄組和TFs分析結(jié)果來看，bHLH（96個）、ERF（85個）、NAC（87個）等TFs可能在植物冷脅迫下起到了重要作用．

b HLH是真核生物中存在最廣泛的一大類轉(zhuǎn)錄因子，它處于植物適應(yīng)逆境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中較為下游的位置，直接調(diào)節(jié)逆境脅迫響應(yīng)基因，調(diào)節(jié)方式更為具體和精細(xì)[10]．ICE（inducer of CBF expression）作為一種bHLH類的轉(zhuǎn)錄因子，在低溫情況下能夠與啟動子中的MYC 作用元件特異結(jié)合，誘導(dǎo)CBF的表達(dá)，進(jìn)一步結(jié)合到COR（cold-regulated genes）啟動子的DRE序列，誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，繼而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性[11]．

ERF（AP2-EREBP）分為2個亞族，包括含2個AP2結(jié)構(gòu)域的AP2基因和含有1個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的EREBP基因[12]．CBF作為1個AP2TFs，能夠與很多脅迫誘導(dǎo)基因啟動子中的DRE/CRT順式作用元件特異結(jié)合，隨后調(diào)控植物不同類別脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，提高對干旱、低溫、鹽的耐性[13]．在植物冷馴化過程中ICE-CBF-COR基因調(diào)控途徑發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]．本研究中低溫脅迫下枇杷b HLH、ERF是表達(dá)最多的2類TFs，其能特異、大量地表達(dá)，快速有效地激活I(lǐng)CE-CBF-COR冷反應(yīng)途徑，從而有助于提高枇杷的抗寒能力．CBF基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論．

NAC轉(zhuǎn)錄因子是近年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的TFs，也是植物基因組最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[15]．在擬南芥[16]、葡萄[17]等多種植物中鑒定出了該基因．本研究中枇杷NAC類TFs共87個，在冷脅迫高表達(dá)TFs中居于第2位，說明NAC轉(zhuǎn)錄因子在枇杷冷反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用．

除常規(guī)冷脅迫反應(yīng)TFs外，CAMTA3是一種受鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子．由于冷脅迫處理能夠快速誘導(dǎo)植物胞內(nèi)鈣離子的升高[18]，從而激活鈣調(diào)素，通過調(diào)節(jié)CAMTA3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控CBF1和CBF2的表達(dá)[19]．本研究中枇杷擁有30個CAMTA，是所有14類植物中數(shù)量最多的．Kim等研究表明CAMTA1、CAMTA2、CAMTA3經(jīng)4 ℃ 2 h處理可以誘導(dǎo)CBF1-3最高表達(dá)，4 ℃ 24 h處理可以誘導(dǎo)15%的不依賴CBF路徑的基因，通過這快慢兩種路徑提高植物抗寒性[20]．

本研究結(jié)果表明枇杷冷脅迫下分子機(jī)理相對比較復(fù)雜，ICE-CBF-COR和CAMTA快慢兩條途徑參與其中，bHLH、ERF、NAC類TFs發(fā)揮了重要作用．