黃友如，王教飛

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

芋艿起源于印度和東南亞地區(qū)，后傳入我國，在蘇南地區(qū)有悠久的栽培歷史．芋艿在植物分類學(xué)上屬天南星科[1]，常作一年生作物，實則多年生草本植物．芋艿球莖是地下莖的膨大部分，外皮多為棕色，內(nèi)部組織多為白色、粉色或紫色．長江中下游地區(qū)以白梗芋艿為主[2-3]，是食材的主要部分，深受人們喜愛．

王教飛[4]和孫啊敏等人[5]通過堿溶酸沉法分離得到芋艿蛋白，并研究了不同pH環(huán)境條件下芋艿分離蛋白的流變特性及金屬離子對芋艿分離蛋白功能性質(zhì)的影響．黃友如等人[6]針對芋艿分離蛋白的等電點、變性溫度、氨基酸組成及亞基相對分子質(zhì)量分布等重要物化性質(zhì)進行了研究．有關(guān)芋艿蛋白的分級分離及各組分理化性質(zhì)方面的探討，除了Sumathi等[7]有關(guān)芋艿胰蛋白酶抑制劑方面的研究外，國內(nèi)外文獻鮮見報道．

本文以新鮮芋艿球莖為材料制備谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白4種蛋白成分，并對4種芋艿蛋白成分的熱穩(wěn)定性、等電點、亞基相對分子質(zhì)量分布、氨基酸組成與含量，以及二級結(jié)構(gòu)等重要物化性質(zhì)進行分析比較，填補了目前在芋艿蛋白各組分理化性質(zhì)認(rèn)識上的空白．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芋艿：產(chǎn)自常熟．

鹽酸、氫氧化鈉、巰基乙醇、丙烯酰胺、考瑪斯亮藍、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、甘油、溴酚藍等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司．

1.2 儀器與設(shè)備

酸度計，DSC3-差示掃描量熱分析儀，梅特勒-托利多（上海）公司；FreeZone凍干機，美國Labeonco公司；Chirascan VX圓二色光譜儀，英國Applied Photophysics公司；TGL-16G離心沉淀機，上海安亭科學(xué)儀器廠；Mini Gel Tank小型垂直電泳槽，賽默飛世爾科技（中國）有限公司．

1.3 芋艿蛋白組分的分級分離

參考Osborne分級法[8]，以新鮮芋艿球莖為材料分離制備谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白4種蛋白組分，分別占新鮮芋艿總蛋白質(zhì)量的38.27%，2.99%，3.97%和43.38%．該4種組分占了新鮮芋艿總蛋白質(zhì)量的88.61%，其他蛋白占總蛋白質(zhì)量的11.39%．分離所得芋艿蛋白各組分的蛋白質(zhì)純度（即蛋白質(zhì)含量）分別為96.27%，89.90%，93.21%和91.32%，凱氏定氮法測定，換算因子N=6.25．

1.4 芋艿蛋白各組分等電點的測定

參考文獻[6]中1.4節(jié)芋艿分離蛋白等電點的測定．

1.5 芋艿蛋白各組分的非還原和還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析

參考文獻[6]中1.5節(jié)芋艿分離蛋白的非還原和還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析．

1.6 芋艿蛋白各組分的熱穩(wěn)定性測定

參考文獻[6]中1.6節(jié)芋艿分離蛋白熱穩(wěn)定性測定．

1.7 芋艿蛋白各組分的氨基酸組成分析

參考文獻[6]中1.7節(jié)芋艿分離蛋白的氨基酸組成分析．

1.8 芋艿蛋白各組分的圓二色譜（Circular Dichroism，CD）測定

參考文獻[9]中5.3.3 芋艿蛋白組分的圓二色譜測定．

2 結(jié)果與分析

2.1 芋艿蛋白組分的等電點

芋艿清蛋白的等電聚焦電泳（isoelectric focusing, IEF）圖譜及含量分布見圖1．從圖1可以看出，芋艿清蛋白可檢出4個可辨條帶．其中含量較高的條帶為3號條帶，pI值為5.04，占清蛋白總量的57.43%．其他含量較低的等電點條帶分別是條帶4、2和1，等電點pI值分別為4.45、6.77和7.03，其含量分別占清蛋白總量的7.93%、20.49%和14.15%．

圖1 芋艿清蛋白的IEF圖譜及含量分布

芋艿球蛋白的IEF圖譜及含量分布見圖2．從圖2可以看出，芋艿球蛋白可分辨檢出7個條帶．其中含量最高的條帶為6號條帶，等電點為5.23，占該球蛋白總量的 50.69%．其他含量較低的 pI條帶分別是 7、5、4、3、2 和1 號條帶，等電點 pI值分別為 4.56、5.89、6.22、6.67、6.78和8.57，其含量分別占該球蛋白總量的11.01%、2.62%、8.58%、8.59%、13.04%和5.47%．

圖2 芋艿球蛋白的IEF圖譜及含量分布

芋艿醇溶蛋白IEF圖譜及含量分布見圖3．從圖3可以看出，芋艿醇溶蛋白僅可分辨檢出1個條帶，即條帶1，等電點pI值為6.67，含量為醇溶蛋白總量的57.43%左右．其他蛋白條帶聚焦不明顯．

圖3 芋艿醇溶蛋白的IEF圖譜及含量分布

芋艿谷蛋白的IEF圖譜及含量分布見圖4．從圖4可以看出，芋艿谷蛋白可分辨檢出1個非常突出的條帶，即條帶1，等電點pI值為6.76，占谷蛋白總量的幾近100%．未見其他蛋白條帶聚焦．

圖4 芋艿谷蛋白的IEF圖譜及含量分布

2.2 芋艿蛋白組分的SDS-PAGE

圖5為芋艿蛋白組分還原與非還原SDS-PAGE．由圖5可以看出，在芋艿蛋白4種成分的SDS-PAGE過程中，添加巰基乙醇前后，其電泳條帶差異顯著．也就是說，是否添加巰基乙醇，會影響其條帶的分離．

圖5 芋艿蛋白組分SDS-PAGE條帶

添加巰基乙醇（1、2、3和4泳道）時：清蛋白有2個條帶，相對分子質(zhì)量分別在21.4 kDa（大亞基）和16.5 kDa（小亞基）左右；球蛋白有2個條帶，相對分子質(zhì)量分別在22.1 kDa（大亞基，著色較深）和15.5 kDa（小亞基）左右；醇溶蛋白有3個條帶，相對分子質(zhì)量分別在27.8 kDa（大亞基）、21.9 kDa和11.0 kDa（小亞基，著色較深）左右；谷蛋白有3個條帶，相對分子質(zhì)量分別在22.5 kDa（大亞基，著色較深）、17.5 kDa和16.8 kDa左右．

無巰基乙醇（1'、2'、3'和 4'泳道）時：清蛋白僅 1 個條帶，相對分子質(zhì)量在57.9 kDa左右；球蛋白同樣只有1個條帶，相對分子質(zhì)量在38.0 kDa左右；醇溶蛋白有2個條帶，相對分子質(zhì)量分別在58.4 kDa（著色較淺）和39.2 kDa（著色較深）左右；谷蛋白有3個條帶，相對分子質(zhì)量分別在54.8，38.8和21.7 kDa左右．

添加巰基乙醇可打開二硫鍵，實現(xiàn)亞基之間的分離，出現(xiàn)相對分子質(zhì)量較低的新條帶．上述實驗結(jié)果說明：清蛋白（57.9 kDa）至少含有2種亞基，擬由2個大亞基（21.4 kDa）和1個小亞基（16.5 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成；球蛋白（38.0 kDa）擬由1種大亞基（22.1 kDa）和1種小亞基（15.5 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成；醇溶蛋白至少含有3種亞基，其著色較深（39.2 kDa）的條帶擬由1個大亞基（27.8 kDa）和1個小亞基（11.0 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成，其著色較淺（58.4 kDa）條帶的亞基構(gòu)成較為復(fù)雜，可能由3種亞基通過二硫鍵交聯(lián)組成，或者也有其他組合的可能；谷蛋白至少含有3種亞基，即1種大亞基和2種相對分子質(zhì)量較為接近的小亞基，大亞基與小亞基之間，以及小亞基之間擬有二硫鍵的交聯(lián)．

2.3 芋艿蛋白組分的熱穩(wěn)定性分析

4種芋艿蛋白成分的熱變性情況見圖6．由圖6可知，芋艿蛋白成分中谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白的變性溫度分別是71.2，71.9，70.1 和 67.1 ℃，其ΔH（變性熱焓）分別為 1.551，1.470，1.455 和1.434 J/g．圖6中呈現(xiàn)的吸熱峰顯示了芋艿蛋白分子從天然態(tài)到變性態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程，即因程序加熱而經(jīng)歷著的解折疊過程．

圖6 芋艿蛋白組分的熱變性曲線

變性溫度為71.9 ℃的是芋艿醇溶蛋白，屬4種芋艿蛋白中熱變性溫度最高的組分．變性溫度為67.1 ℃的是芋艿清蛋白，屬4種芋艿蛋白中熱變性溫度最低的組分．可見，相比其他蛋白成分，芋艿醇溶蛋白的熱穩(wěn)定性較好．

蛋白亞基之間疏水相互作用的增強可升高蛋白質(zhì)的變性溫度[10]，因此醇溶蛋白、球蛋白的熱穩(wěn)定性高于清蛋白．這里芋艿醇溶蛋白和球蛋白的變性溫度高于芋艿清蛋白也證明了這一點．結(jié)合后面芋艿蛋白組分的氨基酸組成分析可知，芋艿醇溶蛋白中胱氨酸含量占1.86%，高于其他3種蛋白組分．因半胱氨酸殘基的巰基氧化而產(chǎn)生的二硫鍵對蛋白質(zhì)熱變性溫度是否有一定程度的貢獻，可進一步通過添加諸如巰基乙醇之類還原劑的實驗證明．理論上，蛋白質(zhì)變性并不能斷開二硫鍵，但在蛋白制備過程中二硫鍵的交聯(lián)一定會影響最終提取蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)解折疊所需的能量增加，熱變性溫度升高．

當(dāng)然，疏水相互作用不是影響蛋白質(zhì)變性溫度的唯一因素．通常，蛋白質(zhì)發(fā)生熱轉(zhuǎn)變前后的變性熱焓（ΔH）（圖6吸熱峰的峰面積）與其有序的二級結(jié)構(gòu)（如β-折疊等）含量有關(guān)[8]．變性過程中熱能的變化主要產(chǎn)生于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間氫鍵的斷裂[11]，而分子間氫鍵則是穩(wěn)定β-折疊結(jié)構(gòu)的主要作用力，因此蛋白質(zhì)高變性溫度與其β-折疊結(jié)構(gòu)含量呈正相關(guān)[12]．芋艿谷蛋白變性焓最高，說明其有序結(jié)構(gòu)所占比例較大，后面圓二色譜中有關(guān)芋艿蛋白組分二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果也證明：4種蛋白組分中，芋艿谷蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)含量最高（49.0%）．

4種蛋白組分中芋艿清蛋白的變性溫度和變性焓均最低，圓二色譜分析也證明其二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量僅有16.6%，是4種芋艿蛋白組分中β-折疊含量相對最低的．

2.4 芋艿蛋白組分的氨基酸組成

芋艿蛋白組分的酸水解不引起消旋作用，產(chǎn)物為L型的氨基酸．除色氨酸被破壞外，另有一小部分絲氨酸及蘇氨酸被分解，而天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基則被水解下來形成相應(yīng)的天冬氨酸和谷氨酸[6]．

圖7比較了4種芋艿蛋白質(zhì)組分中17種氨基酸的組成．由圖可知，僅從氨基酸種類比較，4種芋艿蛋白成分中各種氨基酸含量均有差異．

圖7 芋艿蛋白各組分的氨基酸組成

一般來說，蛋白質(zhì)顯示最高穩(wěn)定性的溫度取決于極性和非極性相互作用對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性貢獻的相對值[11]．

在芋艿蛋白組分中，非極性氨基酸（即脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，色氨酸除外）分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的38.38%、36.87%、35.70%和37.27%．

不帶電荷的極性氨基酸（如甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸、胱氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺除外）分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的19.82%、22.00%、19.84%和21.04%．帶正電荷的極性氨基酸（即精氨酸、組氨酸和賴氨酸）分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的15.54%、14.93%、13.53%和15.10%．帶負電荷的極性氨基酸（即谷氨酸與天冬氨酸，含谷氨酰胺與天冬酰胺）分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的26.26%、26.20%、30.93%和26.59%．

眾所周知，醇溶蛋白的疏水性較強是其水溶性差的主要原因，但在4種芋艿蛋白組分中芋艿醇溶蛋白的非極性氨基酸含量卻是最低的，可見造成芋艿醇溶蛋白水溶性差、熱變性溫度高的原因不完全與非極性氨基酸含量有關(guān)，也與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)中非極性氨基酸的分布模式有關(guān)．

類似的情況也在芋艿清蛋白中出現(xiàn)．一般清蛋白的水溶性較好，但在4種芋艿蛋白組分中芋艿清蛋白的極性氨基酸含量卻是最低的．可見造成芋艿清蛋白水溶性好、熱變性溫度低的原因不完全與極性氨基酸含量有關(guān)，也與極性氨基酸在蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)中的分布模式有關(guān)．

芋艿蛋白各組分中必需氨基酸含量，除醇溶蛋白較低外，其他均較高．其在清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中的含量分別為38.47%、39.23%、28.20%和39.02%．半必需氨基酸（即精氨酸、組氨酸）在清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中的含量分別為10.14%、9.0%、11.37%和9.90%．

2.5 芋艿蛋白組分CD光譜分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈本身的折疊和盤繞方式．它僅涉及肽鏈中的主鏈構(gòu)象，并不涉及側(cè)鏈構(gòu)象．蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要是指無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和α-螺旋，通常采用圓二色譜測定[13]．

圖8為芋艿蛋白各組分CD光譜．應(yīng)用圓二色譜儀的機帶程序，根據(jù)Chen-Yang 原理[14]可計算出芋艿蛋白成分二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和α-螺旋所占的比例，結(jié)果見表1．

圖8 芋艿蛋白各組分CD光譜

表1 芋艿蛋白各組分的二級結(jié)構(gòu)含量 單位：%

4種芋艿蛋白組分中，清蛋白的α-螺旋含量最高，谷蛋白的α-螺旋含量最低．一條多肽鏈可否形成α-螺旋、形成的螺旋穩(wěn)定與否，與其氨基酸序列及組成有很大的關(guān)聯(lián)[15]．4種蛋白組分中清蛋白的極性氨基酸含量最低（61.62%）．因此在同一pH環(huán)境下，清蛋白中具有相同電荷的荷電氨基酸相對較少，彼此間靜電斥力較低，較易形成鏈內(nèi)氫鍵，有利于α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定．但類似的解釋似乎不能用來說明谷蛋白的α-螺旋含量最低的原因，畢竟谷蛋白的極性氨基酸含量也達62.73%，僅次于清蛋白．4種芋艿蛋白組分中，谷蛋白的甘氨酸、異亮氨酸的含量較高（圖7），甘氨酸的側(cè)鏈R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，是螺旋的破壞者[16]．如果肽鏈中擁有龐大側(cè)鏈的氨基酸（如異亮氨酸）殘基連續(xù)出現(xiàn)，鑒于空間位阻的關(guān)系，也難以形成有規(guī)律的α-螺旋[16]．這是造成谷蛋白的α-螺旋含量最低的原因．可見蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的荷電性質(zhì)、側(cè)鏈基團的大小、空間排列及位阻等對多肽鏈螺旋的形成有影響．

4種芋艿蛋白組分中，谷蛋白的β-折疊含量最高，清蛋白的β-折疊含量最低．如果把氫鍵看作是維持蛋白質(zhì)α-螺旋與β-折疊的主要作用力，則芋艿蛋白4種組分的變性熱焓與其α-螺旋和β-折疊的總量之間呈正相關(guān)（圖9）．分子間氫鍵是穩(wěn)定β-折疊結(jié)構(gòu)的主要作用力，4種芋艿蛋白組分中，β-折疊含量與其對應(yīng)的變性溫度之間的關(guān)系也證實了“蛋白質(zhì)高變性溫度與其β-折疊結(jié)構(gòu)含量呈正相關(guān)”[12]（圖9）．

圖9 芋艿蛋白各組分分析指標(biāo)的比較

一般認(rèn)為“β-轉(zhuǎn)角主要存在于球狀蛋白分子中”[12]，但在4種芋艿蛋白組分中，球蛋白的β-轉(zhuǎn)角含量最低（15.2%）．

3 總結(jié)

參考Osborne分級法[8]，以新鮮芋艿球莖為材料分離制備谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白4種蛋白成分，分別占新鮮芋艿總蛋白質(zhì)量的38.27%，2.99%，3.97%和43.38%．該4種組分共占新鮮芋艿總蛋白質(zhì)量的88.61%，其他蛋白占總蛋白質(zhì)量的11.39%．分離所得芋艿蛋白各組分的蛋白質(zhì)純度（即蛋白質(zhì)含量）分別為96.27%，89.90%，93.21%和91.32%．

等電聚焦電泳分析發(fā)現(xiàn)，芋艿谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白4種主要蛋白成分的等電點分別位于pH 6.76（占谷蛋白總量的幾近100%）、6.67（占醇溶蛋白總量的 57.43%）、5.23（占球蛋白總量的 50.69%）和5.04（占清蛋白總量的57.43%）．

SDS-PAGE分析表明：清蛋白（57.9 kDa）至少含有2種亞基，擬由2個大亞基（21.4 kDa）和1個小亞基（16.5 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成．球蛋白（38.0 kDa）擬由1種大亞基（22.1 kDa）和1種小亞基（15.5 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成．醇溶蛋白至少含有3種亞基，其著色較深（39.2 kDa）的條帶擬由1個大亞基（27.8 kDa）和1個小亞基（11.0 kDa）通過二硫鍵交聯(lián)組成；其著色較淺（58.4 kDa）條帶的亞基構(gòu)成較為復(fù)雜，可能由3種亞基通過二硫鍵交聯(lián)組成，或有其他組合的可能；谷蛋白至少含有3種亞基，即1種大亞基和2種相對分子質(zhì)量較為接近的小亞基，大亞基與小亞基之間，以及小亞基之間擬有二硫鍵的交聯(lián)．

熱穩(wěn)定性（DSC）分析顯示：谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白的變性溫度分別是71.2、71.9、70.1和67.1℃，其ΔH（變性熱焓）分別為1.551，1.470，1.455和1.434 J/g．兩者的趨勢走向較為一致．芋艿清蛋白變性溫度最低，醇溶蛋白的變性溫度最高．與其他蛋白成分相比，芋艿醇溶蛋白的熱穩(wěn)定性較好．

氨基酸分析表明：在芋艿蛋白組分中，非極性氨基酸分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的38.38%、36.87%、35.70%和37.27%．對應(yīng)的極性氨基酸分別占清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量的61.62%、63.13%、64.3%和62.73%．值得注意的是，谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白的變性溫度與其極性氨基酸含量的趨勢走向一致．說明蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的荷電性質(zhì)、側(cè)鏈基團的大小、空間排列及位阻等對多肽鏈折疊及蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成貢獻頗多，并進而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性．這里，在穩(wěn)定芋艿蛋白4個組分高級結(jié)構(gòu)的非共價相互作用的4個因素中，氫鍵、離子鍵的作用似乎占主導(dǎo)地位，而疏水相互作用、范德華力對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的貢獻較弱．

芋艿蛋白各組分中必需氨基酸含量除醇溶蛋白較低外，其他均較高．其在清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中的含量分別為38.47%、39.23%、28.20%和39.02%；半必需氨基酸（即精氨酸、組氨酸）在清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中的含量分別為10.14%、9.0%、11.37%和9.90%．

CD光譜分析證明：4種芋艿蛋白組分中，α-螺旋與β-折疊含量正好相反，如清蛋白的α-螺旋含量最高，β-折疊含量最低；谷蛋白的β-折疊含量最高，α-螺旋含量最低．