張必松，陳宇航，張 璐，薛慧欣，張翊姿，朱益波

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

0 引言

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種通過微生物將D型和L型谷氨酸單體縮合形成的生物兼容高分子聚合物[1]．其分子量在10～10 000 KDa，最早發(fā)現(xiàn)于炭疽桿菌的莢膜組成成分[2]．因為γ-PGA分子量不同會呈現(xiàn)不同的特點，從而展現(xiàn)優(yōu)異的吸水性、保濕性、生物相容性及可降解性等性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、藥物載體、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)菌肥等行業(yè)[3-5]．因微生物發(fā)酵法相較于其他方法具有生產(chǎn)周期短、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小及產(chǎn)量高等優(yōu)點[6-7]，工業(yè)上廣泛應(yīng)用其生產(chǎn)γ-PGA．迄今為止多數(shù)生產(chǎn)γ-PGA的菌株均屬于芽孢桿菌，依照是否利用谷氨酸作為前體，分為谷氨酸非依賴型和依賴型[8]．谷氨酸依賴型菌株（例如Bacillus lichensATCC 9945a，Bacillus subtilisN-2）需要向培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸或其前體來提高γ-PGA產(chǎn)量[9-10]．非谷氨酸依賴型菌株如Bacillus methylis nutritionSK19.001和Bacillus licheniformisPGA-N可以利用無谷氨酸的培養(yǎng)基生產(chǎn)γ-PGA[11-12]．雖然該類菌株可以縮減原料成本，但因其產(chǎn)量低且提升空間小的缺點，而較少被應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)．除了生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)基成本也是制約γ-PGA工業(yè)化生產(chǎn)的重要影響因素．目前工業(yè)生產(chǎn)γ-PGA高成本的主要原因是原材料和產(chǎn)物回收過程的成本居高不下，而原材料成本甚至達(dá)到了生產(chǎn)成本的60%[13]．綜上所述，要實現(xiàn)γ-PGA的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，必須要有優(yōu)良的生產(chǎn)菌株以及搭配合理的低成本培養(yǎng)基．本研究旨在從發(fā)酵大豆產(chǎn)品中篩選獲得γ-PGA高產(chǎn)菌株，并利用響應(yīng)面法預(yù)測最佳發(fā)酵培養(yǎng)基以提高γ-PGA的產(chǎn)量．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

（1）12種不同品名或產(chǎn)商的發(fā)酵豆制品均從常熟理工學(xué)院東湖校區(qū)超市及電商平臺購買．

（2）γ-PGA標(biāo)品（分子量700 KDa）由上海藍(lán)嫣化妝品有限公司提供．

1.1.2 培養(yǎng)基

LB ( Luria-Bertani ) 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.4．

種子培養(yǎng)基：丙三醇20 g/L、氯化銨 10 g/L、七水硫酸鎂5 g/L、L-谷氨酸10 g/L、酵母提取物10 g/L、磷酸氫二鉀 2 g/L，pH 7.4．

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸12 g/L、L-谷氨酸20 g/L、丙三醇80 g/L、氯化銨7 g/L、磷酸二氫鉀 0.5 g/L、一水合硫酸錳 0.1 g/L、七水硫酸鎂 0.5 g/L、氯化鈣 0.15 g/L、六水三氯化鐵0.04 g/L，pH 7.4．

以上培養(yǎng)基成分誤差均控制在±0.01 g以內(nèi)且培養(yǎng)基以121 ℃滅菌20 min后待用．

1.1.3 材料與試劑

腐乳、磷酸氫二鉀、谷氨酸鈉、酵母提取物、檸檬酸、氯化銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、L-谷氨酸、MnSO4·H2O、酵母提取物、瓊脂粉、氯化鈣、氫氧化鈉、丙三醇、六水三氯化鐵、胰蛋白胨、濃硫酸、鹽酸、十六烷基三甲基溴化銨、薄層色譜板、DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）、8 000～14 000 Da透析袋（美國聯(lián)合碳化物公司）、KOD預(yù)混酶（愛必夢生物科技有限公司）、Gyra及16S rRNA引物(蘇州金唯智生物科技有限公司）．

1.1.4 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋、冷凍干燥機(jī)、電子天平、離心機(jī)、pH計、恒溫培養(yǎng)箱、往復(fù)式搖床、立式滅菌鍋、722分光光度計．

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

參考Sui and Engineering[14]的方法，稱取2 g發(fā)酵豆制品于100 mL無菌蒸餾水中煮沸5 min，殺滅細(xì)胞營養(yǎng)體．靜置沉淀后取1 mL上清液于50 mL LB培養(yǎng)基中，220 r/min，30 ℃，培養(yǎng)24 h，10-4倍梯度稀釋后在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布100 μL培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)24 h．將具有濕潤光滑表面且挑起拉絲的單個菌落接種到種子培養(yǎng)基中，220 r/min，30 ℃培養(yǎng)20 h．然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種6%（v/v）的種子液，220 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h．測定發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量并斜面保存產(chǎn)量最大的菌株．

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 產(chǎn)物分離純化

取一定量的發(fā)酵液并用6 mol/L HCl將pH調(diào)至4.0，離心機(jī)程序為12 000 r/min條件下離心5 min除去菌體沉淀；使用6 mol/L NaOH將上清液pH調(diào)至7.0后加入3倍體積預(yù)冷乙醇，混勻后于4 ℃醇沉過夜（10 h）；在相同條件下離心，保留產(chǎn)物沉淀并靜置直至殘留乙醇完全揮發(fā)；再將沉淀溶解于適量蒸餾水后，使用8 000～14 000 Da的透析袋于蒸餾水中過夜透析[15-16]，并將透析液在 -42 ℃條件下冷凍干燥24 h后得到高純度γ-PGA．

1.2.2.2 產(chǎn)量測定方法

利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）比色法快速檢測γ-PGA的產(chǎn)量[17-18]．

1.2.2.3 產(chǎn)物鑒定

參照Song[19]的方法對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定．使用蒸餾水溶解純化后的γ-PGA，加入等體積濃硫酸，密封后于高壓滅菌鍋中121 ℃加熱2.5 h水解γ-PGA．待冷卻至室溫后加入6 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4．將γ-PGA標(biāo)品進(jìn)行相同處理，用薄層層析法分析其成分，以L-谷氨酸為對照，將正丁醇、蒸餾水、乙酸作為展開劑，體積比依次為3∶1∶1．

1.2.3 菌種鑒定

（1）菌落形態(tài)和革蘭氏染色鑒定

按照微生物生物學(xué)實驗教程的方法[20]，將菌種劃線接種于LB固體培養(yǎng)基后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并記錄其菌落形態(tài)，使用革蘭氏經(jīng)典染色法對目的菌株菌種染色并用油鏡觀察．

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析

參照高陽[21]及Vet[22]的方法，取5 mL新鮮培養(yǎng)液，于10 000 r/min 離心2 min后收集細(xì)胞沉淀物，用細(xì)菌基因組提取試劑盒對Bacillus amyloliquefaciensYB-9菌株提取基因組DNA，然后對該菌株16S rRNA和gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序和比對．?dāng)U增引物為通用引物，對27F和1492R及GyrAF（5'-GAGGGATAGCGGTTAGATGAGC-3'）和GyrAR（5'-CCGTTCACCAGCAGGTTAGG-3'）分別擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA及gyrA基因．

16S rRNA 反應(yīng)體系：50 μL，包括 KOD 預(yù)混酶 20 μL、上下游引物各 2 μL、模板 DNA 2 μL、H2O 24 μL．PCR 擴(kuò)增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；循環(huán) 35 次；72 ℃ 5 min．

gyrA 擴(kuò)增反應(yīng)體系：50 μL， Phanta Max Master預(yù)混酶 20 μL、模板 DNA 2 μL、上下游引物各 2 μL、H2O 24 μL．PCR 擴(kuò)增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min．

用1%（m/v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物．將PCR產(chǎn)物切膠回收后，委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成 16S rRNA和gyrA基因測序．結(jié)果用DNA star進(jìn)行拼接，并上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中執(zhí)行核苷酸序列Blast，再使用MEGA 7軟件NJ（Neighbour Joining）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗

以γ-PGA產(chǎn)量為指標(biāo)優(yōu)化碳源、氮源、底物和無機(jī)鹽．分別選擇可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、丙三醇、甘蔗和糖蜜代替初始培養(yǎng)基中的丙三醇作為碳源，在獲得最優(yōu)碳源后優(yōu)化碳源濃度．選取5種有機(jī)氮源：黃豆粉、豆粕粉、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和4種無機(jī)氮源：氯化銨、硫酸銨、檸檬酸銨、尿素代替初始培養(yǎng)基中的氯化銨作為氮源，得到最優(yōu)氮源后對其質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化．對底物 L- 谷氨酸和谷氨酸鈉進(jìn)行優(yōu)化，梯度依次為：5，10，15，20，25，30，35 g/L．對檸檬酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取梯度依次為0，3，6，9，12，15 g/L．通過比較磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、一水合硫酸錳、氯化鈣、六水三氯化鐵、氯化鋅、七水硫酸亞鐵對γ-PGA產(chǎn)量的影響，選出影響最顯著的金屬離子．

1.3.2 PB實驗設(shè)計

在單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，通過選擇尿素、甘油、檸檬酸、谷氨酸、酵母提取物、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、FeCl3這9個參數(shù)進(jìn)行了N為12的PB實驗設(shè)計，各個參數(shù)應(yīng)用高（+）低（-）兩個水平（表1）．

表1 PB實驗設(shè)計表 單位：（g·L-1)

1.3.3 最陡爬坡試驗

按照PB試驗結(jié)果獲得對γ-PGA產(chǎn)量影響最為明顯的3個因素，并依照其正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)來設(shè)計步長長短及變動方向，迅速達(dá)到最佳響應(yīng)區(qū)域．根據(jù)PB實驗中估計值對產(chǎn)量的正或負(fù)影響選取高低水平．

1.3.4 BBK（Box-Behnken）設(shè)計

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗的分析結(jié)果確定的3個因素，設(shè)置γ-PGA的產(chǎn)量為響應(yīng)值且每個因子的3個水平用（-1, 0, +1）編碼，每個測試點平行3次，其他因素按照PB試驗的分析結(jié)果確定．表現(xiàn)出積極影響的因素采用高水平，表現(xiàn)出消極影響的因素采用低水平．BBK試驗設(shè)計的因素及水平見表2．

表2 Box-Behnken 試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌落及細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)過篩選和分離，由不同的發(fā)酵豆制品中分離出10株γ-PGA生產(chǎn)菌株，表現(xiàn)最優(yōu)的為編號YB-9的菌株．其在種子培養(yǎng)基上生長旺盛，并且菌落隨培養(yǎng)時間表現(xiàn)出不同的形狀：培養(yǎng)9 h時，菌落開始形成，形態(tài)類似水滴，表層光滑透明，呈圓形或橢圓形，挑起拉絲，見圖1（a）．培養(yǎng)24 h時，菌落表面變成白色，中間突起形成包含黏液的囊泡，周圍褶皺，在培養(yǎng)過程中少量菌落囊泡破裂，囊泡中的無色黏液滴落，見圖1（b）．

圖1 （a）9 h時菌落形態(tài)；（b）24 h時菌落形態(tài)；（c）9 h時革蘭氏染色；（d）24 h時革蘭氏染色

對培養(yǎng)9 h和24 h的細(xì)菌用革蘭氏染色法進(jìn)行染色和觀察，通過油鏡可以觀察到：培養(yǎng)9 h的細(xì)菌單體為桿狀，呈紫色，見圖1（c）．可以初步判定 YB-9 為革蘭氏陽性桿菌；培養(yǎng)24 h的細(xì)菌出現(xiàn)前芽孢，見圖1（d），可以判定 YB-9 為芽孢桿菌．

2.1.2 YB-9的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

將YB-9的16S rRNA和gyrA基因序列上傳至NCBI進(jìn)行BLAST序列比對和分析，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，如圖2所示．從YB-9的16S rRNA和gyrA基因的系統(tǒng)發(fā)生樹可知，YB-9與解淀粉芽孢桿菌相似度最高，并且和菌株Bacillus amyloliquefaciensstrain MPA 1034的相似性達(dá)到了100%．結(jié)合YB-9的形態(tài)特征可以確定其為解淀粉芽孢桿菌．

圖2 YB-9的系統(tǒng)發(fā)生樹

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物分析

按照1.2.2.3的方法對純化產(chǎn)物的水解液進(jìn)行薄層色譜分析，以γ-PGA標(biāo)品和L-谷氨酸為對照．結(jié)果表明，純化產(chǎn)物水解液中主要是L-谷氨酸，與γ-PGA標(biāo)品水解產(chǎn)物層析圖譜一致，并且與L-谷氨酸的相對遷移率相同（圖3）．考慮到γ-PGA為L-谷氨酸均聚物，基于以上結(jié)果，可初步判斷YB-9發(fā)酵液純化產(chǎn)物為γ-PGA．

圖3 水解產(chǎn)物薄層色譜圖

2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1 單因素優(yōu)化

在單因素試驗中，經(jīng)過比較6種碳源對菌株產(chǎn)γ-PGA的作用大小，得到最優(yōu)碳源為甘油，最適濃度是75 g/L（圖4）．

圖4 碳源對γ-PGA產(chǎn)量的影響

選擇了5種有機(jī)氮源和4種無機(jī)氮源進(jìn)行實驗，最佳的有機(jī)氮源為酵母提取物，無機(jī)氮源為尿素，尿素和酵母提取物的最適濃度分別為5 g/L和1 g/L（圖5）．由圖5（c）還可以看出YB-9的生物量隨著酵母提取物濃度的增加而增大，且γ-PGA的產(chǎn)量達(dá)到最大前的變化趨勢與YB-9的生物量變化趨勢一致．可以推測酵母提取物應(yīng)該是通過促進(jìn)YB-9的生長進(jìn)而影響γ-PGA生產(chǎn)的．由圖6（a）可見，對γ-PGA產(chǎn)量促進(jìn)作用較大的底物是谷氨酸，其最佳濃度為35 g/L．由圖6（b）可以看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基不含檸檬酸時，γ-PGA產(chǎn)量處于一個很低的水平，并且隨著檸檬酸含量的增多，γ-PGA產(chǎn)量呈拋物線變化的趨勢，在濃度為12 g/L時上升到峰值．

圖5 氮源對γ-PGA產(chǎn)量的影響

圖6 前體及檸檬酸對γ-PGA產(chǎn)量的影響

2.3.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

在單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上，通過Design Expert 10.0.4軟件對尿素、甘油、檸檬酸、谷氨酸、酵母提取物、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、FeCl3這9個參數(shù)進(jìn)行了N為12的PB實驗設(shè)計，結(jié)果如表3所示．對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果表明模型的P值遠(yuǎn)小于0.01（表4），說明該模型影響十分顯著．谷氨酸濃度、檸檬酸濃度和六水三氯化鐵濃度3個因素通過F檢驗后P值均小于0.01，說明該3個因素對YB-9產(chǎn)生γ-PGA的影響最為顯著，其影響大小順序為：谷氨酸＞檸檬酸＞六水三氯化鐵，因此選取這3個因素作為顯著影響因素．此外，由表3還能看出谷氨酸和檸檬酸呈現(xiàn)正效應(yīng)，六水三氯化鐵呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)．

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Plackett-Burman 試驗的方差回歸模型分析

2.3.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

基于 PB 試驗的結(jié)果，選擇谷氨酸、檸檬酸、六水三氯化鐵作為最陡爬坡試驗的3個因素．依據(jù)谷氨酸、檸檬酸、六水三氯化鐵三因素估計值中的正負(fù)符號來確定各因素的步長以及方向，然后通過最陡爬坡試驗確定中心點．具體試驗設(shè)計和結(jié)果見表5．γ-PGA的產(chǎn)量隨著3個顯著因子谷氨酸、檸檬酸、六水三氯化鐵的變化出現(xiàn)類拋物線趨勢，在第3組試驗時出現(xiàn)峰值，因此選取谷氨酸、檸檬酸、六水三氯化鐵的濃度分別為 35，16，0.006 g/L 作為 BBK 試驗設(shè)計的中心點．

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計結(jié)果 單位：（g·L-1)

2.3.4 BBK Design 試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表6、表7．根據(jù)表7可知，模型F值為 255.37（P＞0.000 1），試驗誤差很小，失擬項的F值為5.22（P=0.720＞0.01），說明回歸模型顯著．綜上，該實驗?zāi)Ｐ涂捎糜陬A(yù)測γ-PGA最大產(chǎn)量．通過Design Expert 10.0.4對表6中的測試數(shù)據(jù)執(zhí)行二次多項式回歸擬合后獲得以下方程式：Y=18.69+1.3A-0.36B-0.2C-3.15AB-1.52AC+1.27BC-6.5A2-7.02B2-6.02C2．式中：Y為γ-PGA 產(chǎn)量（g/L）；A為L-谷氨酸濃度（g/L）；B為檸檬酸濃度（g/L）；C為六水三氯化鐵濃度（g/L）．

表6 Box-Behnken Design 試驗設(shè)計與結(jié)果 單位：（g·L-1)

表7 方差回歸模型分析

2.4 最優(yōu)條件的預(yù)測及驗證

使用Design-Expert 10.0.4 根據(jù)回歸方程得出相對應(yīng)的等高線、響應(yīng)面圖．若等高線的形狀越類似于橢圓形，那么相應(yīng)的兩個因素的相互作用就越顯著，反之越不顯著；響應(yīng)表面的三維圖坡度越陡，影響越大，反之越小．

由圖7～圖9知：檸檬酸濃度和谷氨酸濃度之間的相互作用對 YB-9產(chǎn)生γ-PGA 的影響最為顯著；谷氨酸和六水三氯化鐵濃度的交互作用、檸檬酸濃度和六水三氯化鐵濃度的交互作用依次降低．在一定范圍內(nèi)，γ-PGA的產(chǎn)量隨著各因素濃度的增大呈拋物線趨勢．由響應(yīng)面模型能夠觀察到，3個因素之間彼此相互影響，表明它們之間對γ-PGA的產(chǎn)率是多因素共同影響而非簡單的線性關(guān)系．根據(jù)二次多項回歸方程運算結(jié)果得出：谷氨酸、檸檬酸和六水三氯化鐵的最佳濃度分別為35.00，16.00，0.006 g/L．在上述條件下，γ-PGA 的最大預(yù)測產(chǎn)量為18.87 g/L．使用響應(yīng)面確定的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行了3個平行實驗，獲得的γ-PGA平均產(chǎn)量為19.39±0.75 g/L，與預(yù)測值接近，表明該模型能較好地反映培養(yǎng)基成分對解淀粉芽孢桿菌YB-9產(chǎn)生γ-PGA的實際情況．

圖7 谷氨酸和檸檬酸濃度對γ-PGA產(chǎn)量交互影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖8 六水三氯化鐵和檸檬酸濃度對γ-PGA產(chǎn)量交互影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖9 六水三氯化鐵和谷氨酸濃度對γ-PGA產(chǎn)量交互影響的響應(yīng)面及等高線圖

3 結(jié)語

本實驗的主要目的是研究解淀粉芽孢桿菌YB-9發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的培養(yǎng)基的優(yōu)化．通過PB實驗設(shè)計，篩選出谷氨酸、檸檬酸和六水三氯化鐵的濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響最顯著．然后通過最陡爬坡試驗確定其濃度范圍．最后經(jīng)過BBK試驗完成了響應(yīng)面設(shè)計，得到了發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比：檸檬酸16 g/L、L-谷氨酸35 g/L、丙三醇80 g/L、尿素5 g/L、酵母提取物1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、氯化鈣0.15 g/L、一水合硫酸錳 0.1 g/L、六水三氯化鐵0.006 g/L，pH7.4，發(fā)酵條件220 r/min，30 ℃培養(yǎng)48 h，γ-PGA的產(chǎn)量最終為19.39±0.75 g/L，與優(yōu)化前相比提高了132.25%．