李雙 賈功雪 陶海萍 王玉軍 李斌業(yè) 楊其恩*

(1 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810001)(2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)(3 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省動物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810001)(4 青海省人民醫(yī)院，生殖醫(yī)學(xué)中心，西寧 810007)

氧氣是生物代謝的必需物質(zhì)，缺氧會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理性應(yīng)激反應(yīng)(Nozik-Grayck and Shimoda,2020)。非習(xí)服動物進(jìn)入高海拔低氧環(huán)境會出現(xiàn)進(jìn)食減少、生長發(fā)育緩慢(杜繼曾和張家興，2004)、紅細(xì)胞增多(程守科等，2001)、心室重塑、心肌細(xì)胞凋亡(佟浩等，2011)、肺動脈高壓、肺血管重構(gòu)(馮恩志等，2014)及肝臟細(xì)胞病變(李慶芬等，1986)。低氧環(huán)境暴露也會顯著損傷生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致生育力下降甚至不育等現(xiàn)象。低氧對雄性動物生殖功能的影響主要包括：生殖行為頻次降低(章麗梅，2009)；生殖相關(guān)激素睪酮(Testosterone,T)、促黃體激素(Luteinizing hormone,LH)、催乳素等水平下調(diào)(Aymanet al.,2021)；精原細(xì)胞、精母細(xì)胞凋亡明顯增多(Liaoet al.,2010;Liuet al.,2020)；精子活力降低、畸形率升高(Liuet al.,2020;Wanget al.,2020a)。繁殖策略是動物環(huán)境適應(yīng)和進(jìn)化的必要過程，解析低氧影響精子發(fā)生的過程和分子機(jī)理，對理解動物低氧生理和病理以及適應(yīng)進(jìn)化有重要的意義。

低氧通過激活低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(Hif-1α)和調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)影響生殖細(xì)胞發(fā)育。低氧應(yīng)激通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax，增加精原細(xì)胞和精母細(xì)胞凋亡(黃付敏，2011)。此外，低氧會上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠精母細(xì)胞Hif-1α表達(dá)，引起精母細(xì)胞凋亡(H?pflet al.,2003)。精細(xì)胞對低氧應(yīng)激也較為敏感，大鼠處于低氧環(huán)境32 d 后，精子活性氧增加，從而引發(fā)DNA 損傷和精子活力降低(Noblancet al.,2013)。萬霖等(2012) 發(fā)現(xiàn)移居高原6個月后，男性精子活力下降，且精子特異性鈣通道CatSperl轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，可能導(dǎo)致受精能力不足。有研究表明低氧抑制精子Asxl2基因轉(zhuǎn)錄，可能影響圓形精細(xì)胞形成與精子發(fā)育(崔鵬等，2020；殷駿等，2021)。此外，最近的研究表明，低氧暴露除影響精子發(fā)育外，還影響早期胚胎發(fā)育，海拔3 000 m 環(huán)境低氧暴露小鼠精子活力降低，卵裂率和囊胚率降低(Taoet al.,2021)。低氧如何影響精子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制，目前依然缺乏研究。

小RNA(small RNA)是生物體內(nèi)一類重要的功能分子，根據(jù)片段長度與結(jié)合蛋白的差異分為miRNA (micro RNA)、siRNA (small interference RNA)、piRNA (piwi-interacting RNA) 和tsRNA(tRNA-derived small RNA)。small RNA 在睪丸中的主要功能是誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄或沉默，調(diào)控生殖細(xì)胞的生長和發(fā)育，參與精子發(fā)生過程(Yusukeet al.,2010)。睪丸組織中miRNA 參與精子形成過程中相關(guān)蛋白的合成與腔隙的形成，間接調(diào)控精子成熟及運(yùn)動功能(張楠等，2016)。piRNA 可與PIWI 家族蛋白相互作用，參與生殖干細(xì)胞自我維持和分化、減數(shù)分裂、精子形成等生殖相關(guān)事件(趙爽和劉默芳，2010;Wanget al.,2020b)。精子中的tsRNA可由壓力水平的變化誘導(dǎo)產(chǎn)生，其在精子表觀遺傳中發(fā)揮重要作用(Yamasakiet al.,2009;Bale,2015)。但低氧是否調(diào)控small RNA 表達(dá)從而引起基因異常表達(dá)，目前并不清楚。因此，本研究通過模擬海拔5 000 m 低壓低氧環(huán)境，對低氧處理后小鼠精子進(jìn)行small RNA 測序，對其差異miRNAs的靶基因進(jìn)行富集分析，為低氧影響生殖系統(tǒng)的相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8 周齡129S2/SvPasCrl 雄性小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司。小鼠隨機(jī)分為對照組(Control)和低氧組(Hypo-4W)，每組6 只。對照組飼養(yǎng)于中國科學(xué)院西北高原生物研究所動物房(海拔：2 270 m，室溫：20℃～25℃)，低氧組飼養(yǎng)于模擬海拔5 000 m的青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院低壓氧艙內(nèi)(溫度：20℃～25℃，壓力：52 889～53 001 Pa，氧濃度：10%～12%，濕度：37.3%～51.0%，新風(fēng)量：110～ 189 m3/h) 4 周。所有動物自由取食和飲水，12 h∶12 h 光照控制。動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織形態(tài)分析

小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后取睪丸及附睪組織。睪丸經(jīng)4% 多聚甲醛避光4℃固定10 h，依次浸泡于30%、50%、75%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明組織后石蠟包埋。將4 μm 睪丸組織切片置于載玻片上，42℃烤片后經(jīng)過梯度乙醇復(fù)水后進(jìn)行蘇木素—伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE) 染色，晾干封片后光學(xué)顯微鏡(尼康Eclipse E200)觀察并拍照。

附睪尾置于1 mL 人輸卵管液中，切割成塊并置于37℃培養(yǎng)箱中10 min，使精子完全釋放。顯微鏡下對小鼠精子計(jì)數(shù)后取20 μL 精子懸浮液滴加到黏附載玻片上均勻涂片，使精子沉降、黏附。將黏附的精子用甲醇固定10 min，晾干后進(jìn)行HE染色，晾干封片后光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.3 small RNA提取與測序

精子懸浮液經(jīng)離心后去除上清，加入TRIzol(Invitrogen)裂解，氯仿異丙醇抽提法獲得總RNA。使 用Thermofisher Qubit 3.0 檢 測RNA 濃度，以1 μg RNA 總量進(jìn)行建庫。5’端和3’端進(jìn)行接頭連接和純化，RT-PCR 擴(kuò)增建庫。最終進(jìn)行文庫純化，使用TBS380(Picogreen 試劑盒)定量后在Illumina Hiseq2000平臺上檢測。

1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

將原始FASTQ 數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列、低質(zhì)量3’端序列、小于18 nt 的短序列和N 含量超過10%的序列，由最終獲得的序列中提取18～ 32 nt 的reads。Bias 軟件對每條read的序列進(jìn)行堿基偏好性分析。使用Rfam (11.0，http://Rfam.sanger.ac.uk/) 數(shù)據(jù)庫對測得的small RNA 進(jìn)行注釋。隨后，使用Bowtie (v1.2.1.1) 將small RNA 序列比對到小鼠mm10 參考基因組上，并分析其在基因組中的分布情況。隨后對miRNA進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析，并利用FPKM進(jìn)行表達(dá)量的均一化處理，獲得低氧處理組相比對照組的差異表達(dá)miRNA。根據(jù)DESeq2對組間差異miRNA進(jìn)行差異表達(dá)可視化(Loveet al.,2014)，利用mirPath v.3工具DIANA tools進(jìn)行差異miRNA靶基因富集聚類和通路分析(Vlachoset al.,2015)。使用miRWalk分析差異miRNA 的3’UTR 區(qū)且評分大于0.95 的靶基因，并對靶基因聚類分析(Dweepet al.,2014)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

精子數(shù)量統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)每組4個生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SE) 表示，采用GraphPad Prism軟件7.00中獨(dú)立t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。small RNA測序分析每組實(shí)驗(yàn)3 個生物學(xué)重復(fù)，small RNA 序列長度分布同樣使用獨(dú)立t檢驗(yàn)。樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方(R2) 表示，取值范圍[-1,1]，其中正向相關(guān)：＞0，負(fù)向相關(guān)：＜0，無相關(guān)性：=0。根據(jù)樣本測序的生物學(xué)重復(fù)，樣品間R2至少要大于0.8，能夠說明組間生物樣本相關(guān)。不同樣品中的表達(dá)差異分析通過對原始的read count進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，形成統(tǒng)一的FPKM值，根據(jù)FPKM 值通過DESeq R包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，鑒定出樣品間差異表達(dá)miRNA，其中P＜0.05，且log2(Fold Change)絕對值大于1(|log2(Fold Change)|＞1)即差異倍數(shù)(Fold Change)大于2為差異表達(dá)miRNA。

2 結(jié)果

2.1 低氧組小鼠精子形態(tài)

對照組和低氧組小鼠采集睪丸組織及附睪精子樣品(圖1a)。形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠的曲精細(xì)管結(jié)構(gòu)正常，各級生殖細(xì)胞有序排列，但低氧組小鼠的睪丸內(nèi)，生殖細(xì)胞排列紊亂，且部分生殖細(xì)胞染色質(zhì)濃縮(圖1b)。低氧組小鼠精子表現(xiàn)出精子頭部三角形、細(xì)線化及精子尾斷裂等畸形狀態(tài)(圖1c)。統(tǒng)計(jì)表明，低氧處理小鼠精子總數(shù)量雖然與對照組相比無顯著差異，但畸形精子比例顯著增多(6.84 ± 0.86,n=4vs.0.39 ±0.05,n=4)(P＜0.001)(圖1d)。

圖1 低氧組小鼠精子形態(tài)異常.a：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；b：對照組與低氧組小鼠睪丸組織蘇木素-伊紅染色，星號表示生殖細(xì)胞紊亂曲精細(xì)管，箭頭指向核濃縮的生殖細(xì)胞，標(biāo)尺：100 μm；c：對照組與低氧組小鼠精子蘇木素-伊紅染色代表圖，標(biāo)尺：10 μm；d：對照組與低氧組小鼠精子總數(shù)及畸形精子比例統(tǒng)計(jì)，每個點(diǎn)代表一個生物重復(fù).數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤統(tǒng)計(jì).***P ＜0.001Fig.1 Abnormal morphology of sperm in Hypo-4W animals.a:Schematic diagram of experimental design.b:HE staining of testicular tissues of Control and Hypo-4W animals,the asterisks indicate germ cell disorder convoluted tubules,the arrows point to germ cells with concentrated nucleus,Scale bars=100 μm.c: Representative images of HE staining of sperm of mice in Control and Hypo-4W animals,Scale bars=10 μm.d: Total number of sperms and proportion of abnormal sperms of mice in Control and Hypo-4W animals,each dot represents a biological repeat.Data were presented as the mean±SE.***P ＜0.001

2.2 低氧組小鼠精子small RNA序列

small RNA 測序低氧組獲得平均2.96 × 107條reads，對照組平均2.59 × 107條reads，堿基錯誤率均低于0.05%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，達(dá)到后續(xù)分析要求。比對分析結(jié)果顯示，低氧組小鼠與對照組small RNA 分布一致，大量序列片段長度集中在21～22 nt(圖2 a)。但是，低氧組小鼠精子21 nt 長度的small RNA 比例顯著低于對照組(37.1 ± 1.9590,n=3vs.41.5 ± 0.1015,n=3)(P＜0.05)。將得到的序列分別與miRBase 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，選擇Rfam 數(shù)據(jù)庫注釋所得的small RNA (圖2b)。低氧組與對照組類似，miRNAs 占比分別為91.47%和91.17%，rRNA 占比分別為3.45% 和3.93%，tRNA 占比分別為0.84% 和1.01%，snRNA占比分別為0.63% 和0.47%。

統(tǒng)計(jì)序列長度18～ 32 nt 的前6 個堿基比發(fā)現(xiàn)，低氧組堿基偏向性與對照組類似，miRNAs的5’端第1個堿基對U 有很強(qiáng)的偏好性，而第2～4個堿基都幾乎不含堿基U。第2和第4個堿基都偏好G，第3和第5個堿基偏好A，第6個堿基偏好U 且?guī)缀醪缓瑝A基C (圖2c)。除了不同序列長度的前6 個堿基，分析發(fā)現(xiàn)，18～32 nt 序列長度的第1 個堿基類型存在差異(圖2d)。21 nt 長度序列的第1個堿基都偏好堿基U，對照組幾乎無堿基G 的存在(約0.5%)，而低氧組小鼠精子21 nt 長度的miRNAs 中有少許堿基G 的存在(約1.0%)。

圖2 低氧組小鼠精子small RNA 測序分析.a：small RNA 序列長度分布統(tǒng)計(jì)，*P ＜0.05；b：miRNAs 及其他不同種類的RNA 分子所占比例統(tǒng)計(jì)；c：小鼠精子miRNAs前6個堿基序列的堿基偏好性；d：小鼠精子不同片段長度miRNAs第1個堿基序列的堿基偏好Fig.2 small RNA sequencing analysis of sperm for Hypo-4W animals.a: Statistics of small RNA sequence length distribution,* P＜0.05;b: Statistics on the proportion of miRNAs and another different type of small RNA molecules;c: Base bias of the first 6 base sequences of miRNAs in mouse sperm;d:Base bias of the 1st base sequence of miRNAs of different fragment lengths in mouse sperm

2.3 低氧組小鼠精子miRNA表達(dá)分析

miRNA 相關(guān)性分析表明，樣品間基因表達(dá)水平皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方(R2) 為0.95，大于0.8，表明組間生物樣本具有相關(guān)性(圖3a)。根據(jù)樣本所有miRNA 的FPKM 值計(jì)算組內(nèi)及組間生物樣本miRNA 的表達(dá)含量。獲得miRNA 的表達(dá)量后，DESeq 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并篩選低氧組和對照組間顯著差異的miRNAs。最終獲得79 個差異miRNAs，其中上調(diào)21 個，下調(diào)58 個(圖3b)。

圖3 低氧組小鼠精子miRNA 差異表達(dá).a：低氧組小鼠精子miRNA 表達(dá)量的樣本相關(guān)性熱圖；b：低氧組小鼠精子miRNA 差異表達(dá)數(shù)量火山圖(P ＜0.05,|log2(Fold Change)|＞1)Fig.3 Differential expression of miRNA in mouse sperm for Hypo-4W animals.a:Sample correlation heat map of expression quantity;b:Volcano plot of miRNA differential expression in sperm of mice for Hypo-4W animals(P ＜0.05,|log2(Fold Change)|＞1)

2.4 低氧組小鼠精子差異表達(dá)miRNA靶基因分析

根據(jù)mirPath 和miRWalk 在線軟件的靶基因數(shù)據(jù)庫，獲取差異miRNAs 對應(yīng)的靶基因，上調(diào)的21 個miRNAs 包含9 189 個靶基因，下調(diào)的58 個miRNAs 包含15 454個靶基因。NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得同樣低氧處理的小鼠睪丸組織差異表達(dá)基因(Li and Yang,2022)，將本研究獲得的差異miRNAs的靶基因與之進(jìn)行比對。所有差異miRNAs的靶基因共比對到831 個差異表達(dá)基因，上調(diào)的21 個miRNAs 的靶基因比對到429 個差異表達(dá)基因，其中181 個表達(dá)上調(diào)基因，248 個表達(dá)下調(diào)基因(圖4a)；下調(diào)的58 個miRNAs 的靶基因比對到813 個差異表達(dá)基因，其中349 個表達(dá)上調(diào)基因，464 個表達(dá)下調(diào)基因(圖4b)。

圖4 低氧組小鼠精子差異miRNA 靶基因分析.a：下調(diào)miRNAs的靶基因比對到同樣低氧處理的小鼠睪丸組織差異基因火山圖；b：上調(diào)miRNAs的靶基因比對到同樣低氧處理的小鼠睪丸組織差異基因火山圖Fig.4 Analysis of differential miRNA target genes in mice sperm of Hypo-4W animals.a: The volcanic map of target genes of down-regulated miRNAs were compared to the differential genes in testicular tissues of mice with the same treatment;b:The volcanic map of target genes of up-regulated miRNAs were compared to the differential genes in testicular tissues of mice with the same treatment

上調(diào)miRNAs的靶基因比對的特有差異表達(dá)基因有18 個，包含10 個表達(dá)上調(diào)基因：Gdf9、Psg19、Mtrex、Pcna、1700092M07Rik、Wdr95、Uqcc2、BC049715、Muc3、Hsbp1l1，8 個表達(dá)下調(diào)基因：Acly、Fxyd1、Mgarp、Acsbg1、Nsdhl、Efcab9、Aox1、Ttc39d。下調(diào)miRNAs 的靶基因比對的特有差異表達(dá)基因具有402 個，其中178 個表達(dá)上調(diào)基因，包含Gip、Serpina3b、Cd52等，224 個表達(dá)下調(diào)基因，包含Sftpb、Serpinb6d、Tpbg等。上調(diào)miRNAs 和下調(diào)miRNAs 共同調(diào)節(jié)的靶基因比對到差異基因有411 個，其中表達(dá)上調(diào)的基因171 個，包含Ccl9、Olfr316、Zfp981等，表達(dá)下調(diào)基因240 個，包含Cck、Hapln1、Fads2等。

此外，上調(diào)miRNAs 中miR-206-3p 的靶基因包含Kdm3b、Kmt5a、Kdm5a等；miR-144-5p 的靶基因包含Dnmt3b、Pou2f1、Tnpo1等；miR-30a-5p的靶基因包含Cdk14、Cyp26b1、Sema3a等。下調(diào)miRNAs 中miR-7688-5p 的靶基因包含Kat8、Srsf1、Kmt5a等；miR-299a-5p 的靶基因包含Zfp738、Kat7、Slc4a7等；miR-299b-5p 的靶基因包含Cdkl2、Vcpkmt、Dap3等。同時發(fā)現(xiàn)，表觀修 飾相 關(guān) 基因Kat6b、Kmt2a、Kmt2e、Kmt2c和Kmt2d等是差異miRNAs 的靶基因。

2.5 低氧組差異表達(dá)miRNA靶基因富集分析

對獲取的差異miRNAs對應(yīng)的靶基因分別進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。KEGG 分析顯示，上調(diào)的21 個miRNAs 的靶基因富集在脂肪酸代謝、FoxO信號通路、粘附連接、賴氨酸降解、晝夜節(jié)律、甲狀腺激素信號通路、類固醇生物合成和HIF-1 信號通路等(圖5a)。FoxO 信號通路相關(guān)miRNAs 有包含miRNA-206a 在內(nèi)的10 個miRNAs，靶基因包含未分化精原細(xì)胞標(biāo)記基因FoxO1和Igf等；甲狀腺激素信號通路相關(guān)miRNAs 有包含miRNA-19b在內(nèi)的11 個miRNAs，靶基因包含Med13和Pdpk1等；HIF-1 信號通路相關(guān)miRNAs 包含miRNA-30a在內(nèi)的11 個miRNAs，靶基因包含Hif-1α和Bcl2等。對上調(diào)的miRNAs 靶基因進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)富集在細(xì)胞分化、細(xì)胞蛋白修飾、胚胎發(fā)育、染色體結(jié)構(gòu)和對壓力的反應(yīng)等生物過程(圖5b)。下調(diào)的58 個miRNAs 的靶基因富集在脂肪酸代謝(圖5c)，主要發(fā)揮作用的是miRNA-199 及靶基因Fasn、Acat1、Oxsm。對這些下調(diào)的miRNAs 的靶基因進(jìn)行GO 分析，發(fā)現(xiàn)它們富集在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞氮化合物代謝、細(xì)胞蛋白修飾、染色體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期等生物過程(圖5d)。

圖5 低氧組小鼠精子差異miRNA靶基因富集分析.a：下調(diào)miRNAs的靶基因KEGG氣泡圖；b：下調(diào)miRNAs的靶基因GO生物過程分析柱狀圖；c：上調(diào)miRNAs的靶基因KEGG氣泡圖；d：上調(diào)miRNAs的靶基因GO生物過程分析柱狀圖Fig.5 Enrichment analysis of differential miRNA target genes in mice sperm of Hypo-4W animals.a: KEGG bubble map of down-regulated miRNAs target genes;b: Histogram of GO biological process analysis of target genes of down-regulated miRNAs;c: KEGG bubble map of upregulated miRNAs target genes;d:Histogram of GO bioprocess analysis of target genes of up-regulated miRNAs

3 討論

雄性生育能力依賴于持續(xù)的精子發(fā)生，這是遺傳因素和環(huán)境因素共同調(diào)控的復(fù)雜細(xì)胞發(fā)育過程。已有大量研究表明，低氧環(huán)境對人類和其他哺乳動物精子發(fā)生和功能具有顯著損傷，包括精子形態(tài)及數(shù)量，精子頂體酶活性和精漿生化指標(biāo)等(廖衛(wèi)公等，2006；鄧琛耀等，2020)。本研究通過低壓氧艙模擬海拔5 000 m 環(huán)境處理4 周建立缺氧小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠精子發(fā)生過程受損。低氧組小鼠睪丸組織中生殖細(xì)胞排列紊亂，部分生殖細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮提示其可能凋亡，且精子畸形率顯著升高，這是非習(xí)服動物進(jìn)入高原地區(qū)后生殖細(xì)胞的共有特點(diǎn)。除上述損傷外，本研究發(fā)現(xiàn)低氧損傷導(dǎo)致小鼠精子中small RNA 的21 nt 片段減少，并且顯著影響精子miRNAs表達(dá)水平。

不同類型的small RNA 在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在生殖系統(tǒng)中，24～ 32 nt 長度的piRNA 被廣泛研究。piRNA 與PIWI 家族蛋白的相互作用參與生殖干細(xì)胞自我維持和分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂、精子形成等事件(Wanget al.,2020b)。PIWI家族蛋白MILI 從小鼠胚胎期第12.5 天開始表達(dá)，直至出生后的圓形精子細(xì)胞產(chǎn)生階段(Wendaet al.,2017)。減數(shù)分裂粗線期的piRNAs 參與轉(zhuǎn)座子抑制、mRNA 降解清除與翻譯激活和MIWI蛋白泛素化降解從而調(diào)控后續(xù)精子形成(Kuramochi-Miyagawaet al.,2008)。此外，piRNA結(jié)合蛋白MILI基因突變小鼠由于精母細(xì)胞的偶線期到粗線期發(fā)育阻斷導(dǎo)致小鼠不育(Kuramochi-Miyagawaet al.,2008)。本研究中獲得的piRNA 序列數(shù)占0.08%，且其在整體序列中差異不顯著。缺氧環(huán)境下小鼠睪丸組織各級生殖細(xì)胞類型存在，與對照組小鼠都表現(xiàn)可育，其原因可能與piRNA 差異不顯著的結(jié)果有關(guān)。

miRNA 在精原細(xì)胞分化、減數(shù)分裂和精子形成中均發(fā)揮重要功能。Dicer酶作為miRNA 合成關(guān)鍵酶，在不同生殖細(xì)胞發(fā)育時期敲除后，均表現(xiàn)精子發(fā)生異常，且越早敲除Dicer基因，精子發(fā)生異常表型越明顯(Chenet al.,2017)。由此可見，miRNA 通過介導(dǎo)精子發(fā)生相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控從而調(diào)節(jié)雄性生殖功能。例如miRNA-221 和miRNA-222 通過抑制KIT 蛋白水平維持哺乳動物雄性生殖細(xì)胞的未分化狀態(tài)(Felliet al.,2005;Yanget al.,2013)，miRNA-130a 通過直接靶向小鼠支持細(xì)胞雄激素受體抑制精子發(fā)生(Liet al.,2018)，miRNA-146 在維甲酸誘導(dǎo)的精原細(xì)胞分化過程中下調(diào)(Huszar and Payne,2013)。Kit信號的激活與生殖細(xì)胞發(fā)育等多個精子發(fā)生的關(guān)鍵事件有關(guān)，而miRNA-146 的過表達(dá)導(dǎo)致Kit基因表達(dá)下調(diào)(Huszar and Payne,2013)。本研究中miRNA-146的上調(diào)表明低氧環(huán)境可能通過調(diào)節(jié)Kit信號的激活從而影響小鼠精子發(fā)生過程。本研究中miRNA-30a、miRNA-206、miRNA-31、miRNA-146 及miRNA-335 等上調(diào)，其對應(yīng)靶基因包含Soat1、Hsd11β1、Stat3、Smad4、Fads6、Fasn、Alsl6、Hif-1α等。這些靶基因參與的信號通路富集在類固醇合成、FoxO 信號通路和HIF-1 信號通路，表明小鼠精子發(fā)生過程對低氧環(huán)境的響應(yīng)體現(xiàn)在雄激素合成過程(Satoet al.,2020)、睪丸抗逆境應(yīng)激(Huanget al.,2016) 及HIF-1 信號通路誘導(dǎo)精母細(xì)胞凋亡(H?pflet al.,2003)等方面。

small RNA 在跨代攜帶表觀遺傳信息方面發(fā)揮著重要作用(Quaratoet al.,2022)。本研究上調(diào)miRNAs 還靶向其他表觀修飾相關(guān)基因Kat6b、Kmt2a、Kmt2e、Kmt2c和Kmt2d等，說明精子中miRNAs失調(diào)有可能通過表觀遺傳修飾的方式將生殖細(xì)胞損傷表型遺傳給后代。同樣地，研究表明低氧環(huán)境下小鼠睪丸組織中表觀遺傳修飾基因Kmt2c、Stpg4、Zfp932、Huwe1表達(dá)上調(diào)，Kdm1a和Nek11表達(dá)下調(diào)，并且其生活在常氧環(huán)境的子代小鼠有精子發(fā)生障礙(Li and Yang,2022)，該表型可能與低氧環(huán)境下小鼠精子miRNAs失調(diào)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，差異miRNAs 的931 個靶基因可以比對到相同低氧處理小鼠睪丸組織表達(dá)基因。上調(diào)和下調(diào)miRNAs 共同調(diào)節(jié)的靶基因比對到差異基因有411 個，其中表達(dá)上調(diào)的基因171 個，包含Ccl9、Olfr316、Zfp981等，表達(dá)下調(diào)基因240 個，包含Cck、Hapln1、Fads2等。這些研究表明，上調(diào)和下調(diào)miRNAs共同參與調(diào)控靶基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從而引起睪丸組織基因表達(dá)水平對低氧環(huán)境的應(yīng)激反饋，而此應(yīng)激隨著生殖細(xì)胞攜帶遺傳信息，可能通過靶向調(diào)控的表觀遺傳修飾基因Kat6b、Kmt2a、Kmt2e、Kmt2c和Kmt2d等表達(dá)水平變化影響子代精子發(fā)生。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，睪丸中特異表達(dá)的tsRNA在遺傳信息的跨代傳遞中發(fā)揮重要功能。精子中由不同的壓力水平誘導(dǎo)tRNA 產(chǎn)生的tsRNA 作為表觀遺傳信息載體，可以將環(huán)境誘導(dǎo)的獲得性性狀傳遞給子代(Bale,2015;Sharmaet al.,2016)。在高脂肪飼料的父本小鼠模型中，精子富集30～ 34 nt長度的tsRNA，表現(xiàn)出基因表達(dá)譜和RNA 修飾的變化，將高脂肪飼料的雄鼠精子tsRNA 片段注射到正常合子中，F(xiàn)1 代代謝紊亂(Chenet al.,2016)。本研究中，低氧組與對照組小鼠精子tRNA 占比分別為0.84%和1.01%，差異不顯著。但低氧組小鼠精子中21 nt 片段顯著降低，21 nt 片段是精子miRNA 片段富集區(qū)，其同樣靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控精子發(fā)生過程。因此，本研究推測低氧環(huán)境通過影響miRNA 水平而不是其他small RNA 靶向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，影響小鼠精子發(fā)生過程。

綜上所述，模擬海拔5 000 m 缺氧環(huán)境導(dǎo)致小鼠精子畸形率顯著上升，精子small RNA 通過下調(diào)21 nt 片段含量及上調(diào)脂肪酸代謝、FoxO 信號通路、粘附連接、賴氨酸降解、晝夜節(jié)律、甲狀腺激素信號通路、類固醇生物合成和HIF-1 信號通路等相關(guān)靶基因的miRNAs應(yīng)對缺氧應(yīng)激。然而，要完全揭示動物生殖系統(tǒng)應(yīng)對低氧環(huán)境的分子調(diào)控機(jī)制，還需運(yùn)用功能基因組學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步研究非習(xí)服動物生殖系統(tǒng)不同細(xì)胞類型中的基因表達(dá)差異、信號傳遞和蛋白互作關(guān)系。